Để thực hiện tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá thì cần dùng những hóa chất nào?

Nội dung chính

• Thiết bị dụng cụ cần thiết khi áp dụng phương pháp Nested RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá gồm những thiết bị dụng cụ nào?
• Để thực hiện tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá thì cần dùng những hóa chất nào?
• Thực hiện tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCTR như thế nào để có thể chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá?

Thiết bị dụng cụ cần thiết khi áp dụng phương pháp Nested RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá gồm những thiết bị dụng cụ nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về thiết bị, dụng cụ dùng trong phương pháp Nested RT PCR như sau:

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau

4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR, Realtime PCR

4.1.1 Máy nhân gen PCR.

4.1.2 Máy Realtime PCR

4.1.3 Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

4.1.4 Máy lắc trộn vortex

4.1.5 Máy spindown

4.1.6 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

4.1.7 Máy đọc gel

4.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng parafin

4.2.1 Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.2.2 Máy xử lý mẫu mô tự động

4.2.3 Nồi đun parafin, có thể duy trì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C.

4.2.4 Khay sắt, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.2.5 Máy làm lạnh tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C.

4.2.6 Máy cắt tiêu bản, cắt ở độ mỏng từ 3 µm đến 5 µm.

4.2.7 Nồi dãn tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C.

4.2.8 Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20X, 40 X và 100 X.

4.2.9 Lamen, vô trùng.

4.2.10 Lam kính, vô trùng.

4.2.11 Bom Canada (keo gắn).

4.2.12 Bút ghi kính (ghi ký hiệu mẫu).

4.2.13 Máy sấy mẫu sau cắt

Như vậy, thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp Nested RT PCR gồm những thiết bị, dụng cụ sau:

- Máy nhân gen PCR.

- Máy Realtime PCR

-Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

- Máy lắc trộn vortex

- Máy spindown

- Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

- Máy đọc gel.

Để thực hiện tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá thì cần dùng những hóa chất nào? (Hình từ Internet)

Để thực hiện tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá thì cần dùng những hóa chất nào?

Theo mục B.1 Phục Lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về hóa chất cần dùng khi tách chiết ARN như sau:

Chuẩn bị hóa chất

VÍ DỤ: Bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNAMini Kit, Cat. No: 12280-050.

Các hóa chất cần được chuẩn bị và bảo quản theo đúng hướng dẫn của bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit, với thể tích vừa đủ cho số lượng mẫu chiết tách, bao gồm:

- Proteinase K

- Dung dich đệm Lysis Buffer

- Dung dịch Carrier ARN

- Dung dịch Wash buffer (W5)

- Nước RNAse-free (E3)

- Cách pha hỗn hợp dung dịch Carrier và Lysis Buffer

N x 0,21 mL = A mL

A mL x 28 µL/mL = B µL

Trong đó: N là số mẫu cần tách chiết

A là tổng số mL Lysis Buffer cần cho N mẫu;

B là tổng số µL Carrier ARN cần cho N mẫu.

Theo tiêu chuẩn trên thì các hóa chất cần dùng khi tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá gồm:

- Proteinase K

- Dung dich đệm Lysis Buffer

- Dung dịch Carrier ARN

- Dung dịch Wash buffer (W5)

- Nước RNAse-free (E3)

Thực hiện tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCTR như thế nào để có thể chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá?

Theo mục B.2 Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về cách tiến hành tách chiết ARN khi áp dụng phương pháp Nested RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá như sau:

Tiến hành

- Cho 25 µL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml;

- Cho 200 µL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K;

(Nếu thể tích mẫu < 200 µL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 µL bằng dung dịch PBS hoặc 0.9% NaCl).

- Cho hỗn hợp dung dịch Lysis Buffer và Carrier ARN vào ống chứa mẫu; đóng nắp ống và vortex 15s;

- Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;

- Cho thêm 250 µL cồn 96 - 100 % vào ống mẫu; đóng nắp và vortex 15s;

- Để ở nhiệt độ phòng 5 min;

(Mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên).

- Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc;

- Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 2 đến 3 min; chuyển cột lọc sang ống thu mới;

- Cho 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) vào cột lọc; ly tâm 12.000 vòng trong 2 đến 3 min; Chuyển cột lọc sang ống thu mới;

- Lặp lại bước 9 với 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) một lần nữa;

- Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới;

- Ly tâm khô 12000v trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5;

- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 µL;

- Cho 10 - 50 µL nước ARNse-free (E3) (có sẵn trong bộ kít) vào cột lọc;

- Để ở nhiệt độ phòng 1 min; Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 1 đến 2 min. Lấy sản phẩm dưới cột lọc;

- Bảo quản ARN ở nhiệt độ âm 80° C.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây bệnh VNN.

Như vậy, khi áp dụng phương pháp Nested RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá thì việc tách chiết ARN được thực hiện theo Tiêu chuẩn nêu trên

Lưu ý là mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây bệnh VNN.