Trong phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá thì cần sử dụng cặp mồi nào?

Nội dung chính

• Thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá gồm những thuốc thử và vật liệu thử nào?
• Trong phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá thì cần sử dụng cặp mồi nào?
• Quy trình thực hiện phản ứng Realtime RT PCR trong phương pháp Realtime RT PCR được thực hiện ra sao?

Thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá gồm những thuốc thử và vật liệu thử nào?

Bệnh hoại tử thần kinh ở cá (Hình từ internet)

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp Realtime RT PCR như sau:

3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1 Etanol, từ 96 % đến 100 % (thể tích).

3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphate (PBS)

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) và Realtime RT PCR.

3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược RT PCR.

3.2.2 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò (Probe) Realtime RT PCR.

3.2.3 Kít tách chiết ARN (acid deoxyribo nucleic).

3.2.4 Kít nhân gen RT PCR, PCR

3.2.5 Kít nhân gen Realtime RT PCR

3.2.6 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.7 Thang chuẩn DNA (Ladder)

3.2.8 Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.9 Kít tách chiết ARN (acid deoxyribo nucleic).

3.2.10 Agarose

3.2.11 Dung dịch đệm TAE (Tris - acetate - EDTA) hoặc TBE (Tris - brorate - EDTA) (xem A.1).

3.2.12 Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.13 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

3.3 Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng parafin

3.3.1 Formalin 10 %, được chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) hoặc nước cất (tỷ lệ thể tích 1 : 9).

3.3.2 Xylen

3.3.3 Thuốc nhuộm Haematoxylin (xem A.2).

3.3.4 Thuốc nhuộm Eosin (xem A.3).

3.3.5 Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.

Theo Tiêu chuẩn trên thì thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá gồm:

- Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược RT PCR.

- Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò (Probe) Realtime RT PCR.

- Kít tách chiết ARN (acid deoxyribo nucleic).

- Kít nhân gen RT PCR, PCR

- Kít nhân gen Realtime RT PCR

- Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

- Thang chuẩn DNA (Ladder)

- Nước tinh khiết, không có nuclease.

- Kít tách chiết ARN (acid deoxyribo nucleic).

- Agarose

- Dung dịch đệm TAE (Tris - acetate - EDTA) hoặc TBE (Tris - brorate - EDTA) (xem A.1).

- Chất nhuộm màu

- Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

Trong phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá thì cần sử dụng cặp mồi nào?

Theo tiết 6.2.3.2 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về cặp mồi sử dụng trong phương pháp Realtime RT PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phương pháp Realtime RT - PCR

...

6.2.3.2 Chuẩn bị mồi

Phương pháp Realtime PCR sử dụng cặp mồi RNA 2 FOR/ RNA 2 REV và RNA2 probe (3.2.2) để phát hiện vi rút VNN. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục D, Bảng D.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

- Đoạn dò ARN2 Probe sử dụng ở nồng độ 10 pM: pha loãng đoạn dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (5 µl mồi gốc và 45 µl nước tinh khiết không có nuclease)

Như vậy, cặp mồi sử dụng trong phương pháp Realtiem RT PCR là cặp mồi RNA 2 FOR/ RNA 2 REV và RNA2 probe để phát hiện vi rút VNN gây nên bệnh hoại tử thần kinh ở cá.

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown trong 30s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nucleas (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

Đoạn dò ARN2 Probe sử dụng ở nồng độ 10 pM: pha loãng đoạn dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (5 µl mồi gốc và 45 µl nước tinh khiết không có nuclease).

Quy trình thực hiện phản ứng Realtime RT PCR trong phương pháp Realtime RT PCR được thực hiện ra sao?

Theo Phục lục D Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về thực hiện phản ứng Realtime RT PCR như sau:

D.2 Thực hiện phản ứng Realtime RT -PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi đặc hiệu RNA 2 FOR / RNA 2 REV (3.2.2) đã được chuẩn bị sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kit nhân gen Invitrogen superscript III qRT-PCR kit Cat.No: 11732-0885)

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng D.2):

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 5 µl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng VNN chuẩn.

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

- Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng Realtime RT- PCR bằng máy Realtime PCR (4.1.2) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng D.3).

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy Realtime PCR ABI 7500

Theo đó, quy trình thực hiện phản ứng Realtime RT PCR được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.