Có thể chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp RT PCR hay không? Bệnh hoại tử cơ ở tôm có thể xuất hiện trên tôm sú giống hay không?

Nội dung chính

• Tôm bị hoại tử cơ sẽ có những triệu chứng lâm sàng nào mà người nuôi có thể nhận biết được?
• Có thể chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp RT PCR hay không?
• Bệnh hoại tử cơ ở tôm có thể xuất hiện trên tôm sú giống hay không?

Tôm bị hoại tử cơ sẽ có những triệu chứng lâm sàng nào mà người nuôi có thể nhận biết được?

Theo tiểu mục 3.1 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về triệu chứng lâm sàng khi tôm mắc bệnh hoại tử cơ như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

3.1. Chẩn đoán lâm sàng

3.1.1. Dịch tễ học

Vi rút gây bệnh IMNV cảm nhiễm chủ yếu trên các tôm thuộc họ Tôm he (Penaeidae): Penaeus vannamei, Ρ.stylirostris, Ρ.monodon… gây tỉ lệ chết cao. Tỷ lệ tôm nhiễm bệnh trong ao, bể có thể lên đến 100 %, tỷ lệ gây chết khoảng 40 % đến 70 %.

Bệnh có thể lan truyền từ bố mẹ truyền vi rút gây bệnh cho con cái thông qua quá trình sinh sản. Hoặc bệnh lan truyền thông qua những sinh vật mang mầm bệnh vào vùng nuôi như chim ăn những con tôm bệnh hoặc tôm chết thải phân ra ngoài môi trường nuôi, thông qua kí chủ trung gian mang mầm bệnh vào ao bể nuôi, qua dùng chung dụng cụ, nguồn nước nhiễm bệnh.

Bệnh xuất hiện quanh năm, đặc biệt là mùa xuân và đầu hè khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ trong ngày biến thiên quá lớn, thay đổi độ mặn gây sốc cho tôm.

3.1.2. Triệu chứng lâm sàng

Giai đoạn cấp tính của bệnh IMNV: cơ vân tôm vùng bụng kéo dọc đến phần đuôi bị hoại tử, có màu trắng đục. Tôm bơi lờ đờ, dạt bờ rồi chết. Tôm chết nhiều liên tiếp trong vài ngày, tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 40 % đến 70 % trong ao nhiễm.

CHÚ THÍCH: Trong một số trường hợp, tôm bị stress do yếu tố môi trường hoặc tôm bị bệnh trắng đuôi cũng thể hiện dấu hiệu bệnh lý tương tự."

Theo đó, trường hợp tôm mắc bệnh hoại tử cơ thì sẽ có triệu chứng như cơ vân tôm vùng bụng kéo dọc đến phần đuôi bị hoại tử, có màu trắng đục. Tôm bơi lờ đờ, dạt bờ rồi chết. Tôm chết nhiều liên tiếp trong vài ngày, tỉ lệ tôm chết có thể từ 40% đến 70% trong ao nhiễm.

Có thể chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp RT PCR hay không?

Theo tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định phương pháp RT PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

3.2.1. Phương pháp RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymer phiên mã ngược)

3.2.1.1. Nguyên tắc

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) dựa trên hoạt động của DNA polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của mồi, bốn loại nucleotit gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn DNA đích thông qua các chu trình nhiệt. Để thực hiện phản ứng khuếch đại DNA đích cần có 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch tổng hợp mạch mới.

RT-PCR là phương pháp PCR mà axit nucleic đích là RNA. Để có thể thực hiện được PCR này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT - reverse transcription) thành cDNA bằng mồi đặc hiệu cho phản ứng này.

Giai đoạn phiên mã ngược RT, enzym được sử dụng là Reverse Transcriptase. Đây là một loại enzym không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA là mạch khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (cDNA) có sự tham gia của mồi, dNTP và dung dịch đệm cho phản ứng.

Có hai phương pháp thực hiện RT-PCR, đó là RT-PCR một bước và RT-PCR hai bước. Trong quy trình này, phương pháp RT-PCR hai bước được thực hiện để khuếch đại RNA đích.

3.2.1.2. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAase, trừ khi có quy định khác.

- Trizol;

- Cloroform;

- Isopropanol;

- Etanol 75 % và 95 %;

- Dung dịch TBE 1X

Chuẩn bị dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X): hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước, thêm 40 ml EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Khi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch TBE 1X.

- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh đến pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

- Dung dịch DEPC

Dung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ - 20 oC

- Dung dịch TE (Tris - EDTA)

Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6.

- Hỗn hợp phản ứng RT-PCR.

- Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần (loading dye 6X).

- Thang chuẩn DNA (DNA marker) gồm có các thang 100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp.

- Etidi bromua (EtBr).

CẢNH BÁO AN TOÀN: Etidi bromua là chất độc hại, tránh tiếp xúc và tránh hít phải hơi từ dung dịch còn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay và mặc áo bảo hộ lao động trong suốt thời gian tiếp xúc với EtBr.

- Gel agarose.

3.2.1.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:

- Tủ lạnh;

- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ - 20 oC;

- Máy li tâm, có thể hoạt động với gia tốc 13000 g;

- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, có thể hoạt động ở nhiệt độ 95 oC;

- Máy lắc trộn vortex;

- Cân phân tích có thể cân chính xác đến 0,1 mg;

- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 l đến 10 l, từ 2 l đến 20 l, từ 10 l đến 100 l, từ 100 l đến 1000 l;

- Giá Eppendorf có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml;

- Máy luân nhiệt (máy PCR);

- Bếp điện hoặc lò vi sóng;

- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml;

- Bình nón chịu nhiệt, dung tích 250 ml;

- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;

- Buồng đổ gel;

- Bàn đọc gel (UV);

- Giấy parafin.

..."

Như vậy, có thể áp dụng phương pháp RT PCR để tiến hành chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm.

Việc chẩn đoán bằng phương pháp RT PCR phải đảm bảo các yêu cầu về thuốc thử, vật liệu tử và các thiết bị dụng cụ cần thiết theo Tiêu chuẩn vừa nêu trên.

Chẩn đoán bệnh hoại tử cơ bằng phương pháp RT PCR (Hình từ internet)

Bệnh hoại tử cơ ở tôm có thể xuất hiện trên tôm sú giống hay không?

Theo tiểu mục 2.3 Mục 2 QCVN 02-34-1:2021/BNNPTNT về Giống tôm nước lợ, tôm biển - Phần 1: Tôm sú, tôm thẻ chân trắng quy định về các loại bên trên tôm sú như sau:

"2. QUY ĐỊNH VỀ KỸ THUẬT

2.3. Tình trạng sức khỏe

Tôm bố mẹ và tôm giống không bị nhiễm một trong các bệnh quy định tại Bảng 3:"

Theo đó bệnh hoại tử cơ ở tôm chỉ xuất hiện trên tôm thẻ chân trắng còn đối với tôm sú thì sẽ không mắc bệnh hoại tử cơ.