Trình tự cặp mồi và thực hiện phản ứng RT PCR bằng phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống ra sao?

Nội dung chính

• Bệnh đầu vàng ở tôm sú giống do tác nhân nào gây ra?
• Phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm được tiến hành như thế nào?
• Trình tự cặp mồi và thực hiện phản ứng RT PCR bằng phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống ra sao?

Bệnh đầu vàng ở tôm sú giống do tác nhân nào gây ra?

Theo Mục 1 và Mục 2 TCVN 8710-4:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm quy định về tác nhân gây ra bệnh đầu vàng ở tôm sú giống như sau:

"1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh đầu vàng do vi rút đầu vàng genotype 1 (YHV1) gây ra ở tôm.

2 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh đầu vàng (Yellow head disease - YHV) ở tôm do vi rút đầu vàng genotype 1.

Vi rút đầu vàng genotype 1 (YHV1) là 1 trong 8 genotype của phức hợp đầu vàng và cũng là tác nhân duy nhất gây bệnh đầu vàng. Vi rút YHV1 có dạng hình que kích thước 40-50 nm x 150-180 nm, thuộc giống Okavirus, họ Roniviridae, bộ Nidovirales. Cấu trúc acid nhân là ARN, sợi đơn dương (+; ssRNA)."

Như vậy, tác nhân gây bệnh đầu vàng ở tôm sú giống là do vi rút đầu vàng genotype 1 (YHV1) gây ra. Vi rút đầu vàng genotype 1 (YHV1) là 1 trong 8 genotype của phức hợp đầu vàng và cũng là tác nhân duy nhất gây bệnh đầu vàng. Vi rút YHV1 có dạng hình que kích thước 40-50 nm x 150-180 nm, thuộc giống Okavirus, họ Roniviridae, bộ Nidovirales. Cấu trúc acid nhân là ARN, sợi đơn dương (+; ssRNA).

Phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm được tiến hành như thế nào?

Phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm được tiến hành như thế nào?

Theo tiểu mục 6.1.4 Mục 6 TCVN 8710-4:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm quy định về phương pháp RT PCR như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Phương pháp RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

...

6.1.4 Cách tiến hành

6.1.4.1 Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ARN: PureLinK Viral RNA/DNA Mini kít (50) (Lot 1361246)[1]) (xem phụ lục B).

6.1.4.2 Chuẩn bị mồi

Phương pháp RT PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 10F/144R (3.2.1) để phát hiện YHV1. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục C, Bảng C1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc;

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 10 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 90 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.1.4.3 Thực hiện phản ứng RT - PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy PCR (4.1.1) theo phương pháp RT PCR sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.1) sử dụng kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục C).

6.1.4.4 Điện di

6.1.4.4.1 Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.12) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.9) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi.

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.11) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược, không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.4.4.2 Chạy điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.10) vào 8 µl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.6), chạy kèm theo thang chuẩn DNA (ladder) (3.2.7) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder) (3.2.7) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 25 min.

6.1.5 Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.7).

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Mẫu đối chứng dương có vạch sáng kích thước 135 bp.

Với điều kiện phản ứng trên:

Kết quả mẫu thử dương tính khi:

- Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 135 bp.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi:

- Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng."

Theo đó, khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống thì tiến hành theo các bước được quy định như trên.

Trình tự cặp mồi và thực hiện phản ứng RT PCR bằng phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống ra sao?

Theo Phụ lục C TCVN 8710-4:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm quy định về phương pháp RT PCR phát hiện YHV1 như sau:

C.1 Trình tự cặp

C.2 Thực hiện phản ứng RT - PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng C.2).

VÍ DỤ: RT-PCR dùng kít nhân gen SuperScript® III One-Step RT-PCR with Platinum®Taq.Cat: 12574-026 [3])

Chuyển 22,0 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: Cho 3 µl mẫu ARN tách chiết đã được giám định hoặc sử dụng các mẫu chuẩn;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 3 µl nước tinh khiết không có nuclease;

- Mẫu thử: Cho 3µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng RT - PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Như vậy, trình tự cặp mồi cũng như các phản ứng trong quá trình tiến hành phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống sẽ căn cứ vào quy định vừa nêu trên để thực hiện.