TCVN 12371-2-13:2024 về hóa chất của quy trình giám định vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật ra sao?

Nội dung chính

• TCVN 12371-2-13:2024 về hóa chất của quy trình giám định vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật ra sao?
• Lấy mẫu và bảo quản mẫu quy trình giám định vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật ra sao?
• Giám định bằng phương pháp RT-PCR vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật thế nào?

TCVN 12371-2-13:2024 về hóa chất của quy trình giám định vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật ra sao?

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-13:2024 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

- TCVN 12371-1:2019: Phần 1: Yêu cầu chung

- TCVN 12371-2-1:2018: Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus

- TCVN 12371-2-2:2018: Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.

- TCVN 12371-2-3:2019: Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

- TCVN 12371-2-4:2020: Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus

- TCVN 12371-2-5:2020: Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

- TCVN 12371-2-6:2020: Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Potato spindle tuber viroid

- TCVN 12371-2-7:2021: Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với Coffee ringspot virus

- TCVN 12371-2-8:2021: Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. garcae

- TCVN 12372-2-9:2021: Phần 2-9: Yêu cầu cụ thể đối với Rice grassy stunt virus và Rice ragged stunt virus

- TCVN 12371-2-10:2021: Phần 2-10: Yêu cầu cụ thể đối với Southern rice black streaked dwarf virus

- TCVN 12371-2-11:2022: Phần 2-11: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus chùn ngọn chuối do Banana bunchy top virus

- TCVN 12371-2-12:2022: Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus sọc lá lạc Peanut stripe virus

Tại Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-13:2024 quy định về hóa chất của quy trình giám định vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật như sau:

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác. Hóa chất sử dụng theo điều 4 của TCVN 12371-1:2019 và các hóa chất dưới đây. Phương pháp pha các loại dung dịch tham khảo phụ lục B.

(1) Agarose: nồng độ 1,5 %

(2) Axit axetic (CH3COOH): nồng độ 100%

(3) Axit boric (H3BO3): tinh thể

(4) Cặp mồi đặc hiệu cho ToRSV để giám định bằng phương pháp RT-PCR

U1: 5' - GAC GAA GTT ATC AAT GGC AGC - 3’ [3]

D1: 5' - TCC GTC CAA TCA CGC GAA TA - 3' [3]

(5) Cặp mồi đặc hiệu cho ToRSV để giám định bằng phương pháp real-time RT-PCR

ToRSV-UTRf: 5' - GAA TGG TTC CCA GCC ACT T - 3' [6]

ToRSV-UTRr: 5' - AGT CTC AAC TTA ACA TAC CAC - 3' [6]

(6) Dung dịch nạp mẫu (loading dye)

(7) Đệm nhuộm điện di

(8) Ethylenediaminetetraacetic Axit (EDTA) (C10H16N2O8): tinh thể

(9) Kit nhân gen, bộ gồm các hóa chất sử dụng cho phản ứng RT-PCR (Reverse transcription - polymerase chain reaction) một bước hoặc real-time RT-PCR (Realtime Quantitative Reverse transcription - polymerase chain reaction) một bước đã được thương mại

(10) Kit tách chiết RNA thương mại

(11) Mẫu dò (Probe)

ToRSV-UTRp: 5’ - FAM-5’-AGG ATC GCT ACT CCT CCG TCA AC-BHQ1-3’ [6]

(12) Mẫu đối chứng dương

(13) Mẫu đối chứng âm

(14) Mẫu trắng

(15) Natri hydroxide (NaOH): tinh thể

(16) Ni tơ lỏng

(17) Nước cất

(18) Nước khử lon

(19) Thang DNA chuẩn (Marker)

(20) Thuốc nhuộm axit nucleic

(21) Tris-Base (C4H11NO3): tinh thể

TCVN 12371-2-13:2024 về hóa chất của quy trình giám định vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật ra sao? (Hình ảnh Internet)

Lấy mẫu và bảo quản mẫu quy trình giám định vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật ra sao?

Tại Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-13:2024 quy định về lấy mẫu và bảo quản mẫu quy trình giám định vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật như sau:

- Lấy mẫu

Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN 12371-1:2019. Các bộ phận có thể lấy mẫu để giám định ToBRFV gồm hạt, lá và quả.

- Bảo quản mẫu

Mẫu được bảo quản và vận chuyển về phòng giám định theo điều 5.2.2.1 của TCVN 12371-1:2019.

Giám định bằng phương pháp RT-PCR vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật thế nào?

Tại tiểu mục 7.1 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-13:2024 quy định về giám định bằng phương pháp RT-PCR vi khuẩn, virus, Phytoplasma gây hại thực vật như sau:

(1) Tách chiết RNA

- Đối với mẫu hạt:

+ Mẫu hạt cần phải được nghiền nhuyễn bằng máy nghiền mẫu (3.7) hoặc bằng ni tơ lỏng (4.16) trước khi tách chiết RNA. Sử dụng 2,1 - 2,2 g hạt ớt hoặc 1,3 - 1,4 g hạt cà chua cho một lần nghiền mẫu, tương ứng với một lần giám định (một lần lặp lại). Sau đó, sử dụng 0,1 g mẫu đã được nghiền để thực hiện tách chiết RNA theo điều 7.2.1 của TCVN 12371-1:2019 hoặc theo hướng dẫn của Kit tách chiết RNA thương mại (4.10).

- Đối với mẫu lá, quả:

+ Một lần giám định (một lần lặp lại), sử dụng 0,05 g mẫu lá hoặc 0,5 g mẫu quả để thực hiện tách chiết RNA theo điều 7.2.1 của TCVN 12371-1:2019 hoặc theo hướng dẫn của Kit tách chiết RNA thương mại (4.10).

RNA sau khi tách chiết sẽ được bảo quản ở nhiệt độ - 20 °C (3.9).

(2) Khuếch đại gen

- RNA thu được sau khi tách chiết tiến hành khuếch đại đoạn gen mong muốn trong máy chu trình nhiệt (PCR) (3.3).

- Mẫu đối chứng dương (mẫu nhiễm ToRSV) (4.12), mẫu đối chứng âm (mẫu không nhiễm ToRSV) (4.13) và mẫu trắng (4.14) (nước khử ion (4.18) sử dụng để chuẩn bị phản ứng RT-PCR) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

- Sử dụng cặp mồi đặc hiệu (4.4) để giám định ToRSV.

- Thành phần và thể tích cho một phản ứng RT-PCR được thể hiện như sau:

*Nồng độ, thể tích của từng thành phần hóa chất và nồng độ RNA mẫu sử dụng sẽ thay đổi tùy vào bộ kit nhân gen (4.9).

** Thành phần hóa chất trong bộ kít nhân gen (4.9).

(3) Đọc kết quả

- Sản phẩm PCR được trộn với đệm nhuộm điện di (4.7), sau đó điện di bằng máy điện di (3.5) sử dụng gel agarose 1,5 % (4.1) đã có sẵn thuốc nhuộm axit nucleic (4.20) trong dung dịch đệm điện di TAE (B.1) hoặc TBE (B.2) với thời gian 30 phút ở hiệu điện thế 110 V.

- Đọc kết quả điện di bằng hệ thống đọc bản gel UV (3.2).

- Các loại đối chứng được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định đáp ứng các điều kiện sau:

+ Mẫu đối chứng dương: xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~ 449 bp trên bản gel.

+ Mẫu đối chứng âm và mẫu trắng: không xuất hiện vạch trên bản gel

Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả dương tính (nhiễm virus) khi xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~ 449 bp trên bản gel.

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính (không nhiễm virus) khi không xuất hiện vạch nào trên bản gel.

+ Thực hiện giám định lại nếu mẫu cho kết quả PCR không rõ ràng.