Thực hiện chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống bằng phương pháp Realtime RT PCR như thế nào? Chuẩn bị thuốc thử để chẩn đoán tình trạng bệnh đầu vàng ở tôm sú giống ra sao?

Nội dung chính

• Những loại thuốc thử và vật liệu thử nào nên sử dụng để thực hiện chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống?
• Thực hiện chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống bằng phương pháp Realtime RT PCR như thế nào?
• Chuẩn bị thuốc thử để chẩn đoán tình trạng bệnh đầu vàng ở tôm sú giống ra sao?

Những loại thuốc thử và vật liệu thử nào nên sử dụng để thực hiện chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống?

Theo Mục 3 TCVN 8710-4:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm quy định về thuốc thử và vật liểu thử khi tôm mắc bệnh đầu vàng như sau:

"3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích được công nhận, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1 Etanol, từ 70 % đến 100 % (C2H6O).

3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphate (PBS)

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) và realtime RT - PCR

3.2.1 Cặp mồi RT - PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.2.2 Cặp mồi Realtime RT - PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò (Probe).

3.2.3 Kít tách chiết ARN

3.2.4 Kít nhân gen RT - PCR

3.2.5 Kít nhân gen (Realtime RT-PCR).

3.2.6 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.7 Thang chuẩn AND (Ladder)

3.2.8 Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.9 Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate - EDTA) (xem A.1).

3.2.10 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

3.2.11 Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.12 Agarose"

Theo đó khi tôm sú giống có dấu hiệu mắc bệnh đầu vàng thì cần sử dụng những loại thuốc thử và vật liệu thử nêu trên để tiến hành thử nghiệm ở tôm sú giống.

Thực hiện chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống bằng phương pháp Realtime RT PCR như thế nào? (Nguồn ảnh: Internet)

Thực hiện chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống bằng phương pháp Realtime RT PCR như thế nào?

Theo tiểu mục 6.2 Mục 6 TCVN 8710-4:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm quy định về việc chẩn đoán bệnh bệnh đầu vàng ở tôm bằng phương pháp Realtime RT PCR như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phương pháp Realtime RT - PCR

6.2.1 Lấy mẫu (Theo 6.1.1)

6.2.2 Bảo quản mẫu (Theo 6.1.2)

6.2.3 Chuẩn bị mẫu (Theo 6.1.3)

6.2.4 Cách tiến hành

6.2.4.1 Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ARN: PureLinK Viral RNA/DNAMini kit (50) (Lot 1361246)[2]) (xem phụ lục B)

6.2.4.2 Chuẩn bị mồi

Phương pháp Realtime RT-PCR sử dụng cặp mồi YHV 141F / YHV 206R và YHV p (3.2.2) để phát hiện vi rút đầu vàng YHV1. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục D, Bảng D.1).

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

Đoạn dò YHV-p sử dụng nồng độ 6 µM: Pha loãng đoạn dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (3 µl mồi gốc và 47 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.2.4.3 Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy Realtime PCR (4.1.2) theo phương pháp Realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút đầu vàng YHV1 sử dụng cặp mồi YHV 141F / YHV 206R và YHV p (3.2.2) (xem phụ lục D).

6.2.4.4. Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct);

- Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct dao động ± 2.

Với điều kiện phản ứng như trên:

- Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính;

- Mẫu không có giá trị Ct là âm tính;

- Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.

CHÚ Ý: - Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả;

- Phản ứng realtime RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

...."

Theo đó, việc chẩn đoán bệnh bằng phương pháp Realtime RT PCR sẽ được thực hiện ở phòng thí nghiệm, thực hiện theo quy trình vừa nêu trên. Việc thử nghiệm phải đảm bảo đầy đủ các thiết bị, dụng cụ và các thứ cần thiết khác cho việc thử nghiệm.

Chuẩn bị thuốc thử để chẩn đoán tình trạng bệnh đầu vàng ở tôm sú giống ra sao?

Theo Phụ lục A TCVN 8710-4:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm quy định về thành phần và việc chuẩn bị thuốc thử như sau:

"A.1 Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1 Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2 Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.2.1 Thành phần

Natri clorua (NaCl) 8 g

Natri hydro photphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O) 2,9 g

Kali dihydro photphat (KH2PO4) 0,2 g

Kali clorua (KCl) 0,2 g

Nước cất 1000 ml

A.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min."

Như vậy, cần chuẩn bị thuốc thử cho việc thử nghiệm kiểm tra tình trạng bệnh đầu vàng ở tôm sú giống theo quy định nêu trên.