Cách tiến hành phương pháp Realtime PCR để tiến hành chẩn đoán bệnh khi tôm sú giống mắc bệnh đốm trắng ra sao?

Nội dung chính

• Nguyên nhân mắc bệnh đốm trắng ở tôm sú giống là do đâu?
• Tôm sú giống mắc bệnh đốm trắng thì có dấu hiệu dịch tễ như thế nào?
• Cách tiến hành phương pháp Realtime PCR để tiến hành chẩn đoán bệnh khi tôm sú giống mắc bệnh đốm trắng ra sao?

Nguyên nhân mắc bệnh đốm trắng ở tôm sú giống là do đâu?

Theo Mục 2 TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về vi rút gây bệnh đốm trắng ở tôm sú như sau:

"2 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh đốm trắng (White Spot Disease) do vi rút là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở tôm.

Vi rút gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus - WSSV) thuộc họ Nimaviridae, chi Whispovirus.

Vi rút dạng hình trứng, hay ovan, đối xứng đều có đường kính là 80 - 120 nm và chiều dài khoảng 250- 380 nm. Có đuôi phụ giống như lông mao ở một đầu. Vi rút có vật chất di truyền là AND. Mặc dù có sự đa dạng di truyền giữa các chủng phân lập từ các khu vực địa lý khác nhau, cho đến nay vi rút gây bệnh đốm trắng WSSV được phân loại là một loài duy nhất của chi Whispovirus. Vi rút ký sinh chủ yếu trên mang, chân bơi, đuôi, giáp đầu ngực, máu và cơ bụng của tôm."

Như vậy, bệnh đốm trắng (White Spot Disease) do vi rút là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở tôm; nguyên nhân gây bệnh là do vi rút gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus - WSSV) thuộc họ Nimaviridae, chi Whispovirus.

Cách tiến hành phương pháp Realtime PCR để tiến hành chẩn đoán bệnh khi tôm sú giống mắc bệnh đốm trắng ra sao?

Tôm sú giống mắc bệnh đốm trắng thì có dấu hiệu dịch tễ như thế nào?

Theo Mục 5 TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về dấu hiệu dịch tễ khi tôm sú giống mắc bệnh đốm trắng như sau:

"5 Chẩn đoán lâm sàng

5.1 Đặc điểm dịch tễ

Bệnh thường xảy ra trên các loài tôm thuộc họ tôm he (Penaeidae) như tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng (P. vannamei), tôm rảo (P. merguensis).

Ngoài ra còn một số loài như tôm đất, tôm càng xanh, cua, ghẹ, các loài giáp xác phù du như Artemia, Copepoda có thể mang mầm bệnh.

Bệnh xảy ra ở hầu hết các giai đoạn phát triển của tôm như ở cả tôm nước mặn, lợ.

Vi rút có thể lây lan theo chiều ngang từ cá thể bị nhiễm bệnh sang cá thể khỏe trong cùng ao hoặc có thể do tôm ăn thức ăn có mầm bệnh; hoặc qua các vật chủ trung gian như tôm tự nhiên, cua, ghẹ, động vật phù du mang mầm bệnh.

Bệnh đốm trắng xuất hiện quanh năm, đặc biệt khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ nhiệt độ trong ngày biến thiên quá lớn, thay đổi độ mặn gây sốc cho tôm.

5.2 Triệu chứng lâm sàng

Tôm bị bệnh thường thể hiện dấu hiệu giảm ăn rõ rệt, đôi khi có trường hợp tăng cường sự bắt mồi hơn bình thường, sau vài ngày bỏ ăn, tôm dạt bờ, lờ đờ với dấu hiệu xuất hiện các đốm trắng tròn đường kính từ 0,5 - 2,0mm dưới lớp vỏ kitin đặc biệt là vùng đầu ngực và đốt bụng cuối cùng. Những đốm trắng này nằm trong lớp vỏ và không thể loại bỏ bằng việc chà sát. Trong trường hợp cấp tính, tôm bệnh có thể chuyển sang màu hồng đỏ. Hiện tượng chết có thể xảy ra ngay sau đó, tỉ lệ chết có thể lên đến khoảng từ 90 % đến 100 % trong vòng 3 ngày đến 7 ngày."

Theo đó, bệnh đốm trắng xuất hiện quanh năm, đặc biệt khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ nhiệt độ trong ngày biến thiên quá lớn, thay đổi độ mặn gây sốc cho tôm. Ngoài đặc điểm dịch tễ anh có thể căn cứ vào các triệu chứng lâm sàn ở tôm để phát hiện bệnh; khi tôm nhiễm bệnh thì sẽ có biểu hiện lâm sàng như giảm ăn rõ rệt, đôi khi có trường hợp tăng cường sự bắt mồi hơn bình thường, sau vài ngày bỏ ăn, tôm dạt bờ, lờ đờ với dấu hiệu xuất hiện các đốm trắng tròn đường kính từ 0,5 - 2,0mm dưới lớp vỏ kitin đặc biệt là vùng đầu ngực và đốt bụng cuối cùng. Những đốm trắng này nằm trong lớp vỏ và không thể loại bỏ bằng việc chà sát.

Cách tiến hành phương pháp Realtime PCR để tiến hành chẩn đoán bệnh khi tôm sú giống mắc bệnh đốm trắng ra sao?

Theo tiểu mục 6.2 Mục 6 TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về việc chẩn đoán bệnh đốm trắng bằng phương pháp Realtime PCR với tôm sú giống như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phương pháp Realtime PCR

6.2.1 Lấy mẫu (Theo 6.1.1)

6.2.2 Bảo quản mẫu (Theo 6.1.2)

6.2.3 Chuẩn bị mẫu (Theo 6.1.3)

6.2.4 Cách tiến hành

6.2.4.1 Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN: DNeasy®Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506)[4]) (xem phụ lục B).

6.2.4.2 Chuẩn bị mồi

Phương pháp Realtime PCR sử dụng cặp mồi WSSV1011F /WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p (3.2.2) để phát hiện vi rút đốm trắng. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục D, Bảng D.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

- Đoạn dò WSSV-p sử dụng nồng độ 6 µM: pha loãng đoạn dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (3 µl mồi gốc và 47 µl nước tinh khiết không có nuclease)

6.2.4.3 Tiến hành phản ứng realtime PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy Realtime PCR (4.1.2) theo phương pháp Realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút WSSV sử dụng cặp mồi đặc hiệu WSSV1011F /WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p (3.2.2), sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục D).

6.2.4.4 Đọc kết quả

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct).

- Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct = ± 2

Với điều kiện phản ứng như trên:

- Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính

- Mẫu không có giá trị Ct là âm tính

- Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.

CHÚ Ý: - Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

- Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

7 Kết luận

Mẫu tôm được xác định mắc bệnh đốm trắng khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh đốm trắng và:

- Có kết quả dương tính với WSSV bằng phương pháp Nested PCR, hoặc:

- Có kết quả dương tính với WSSV bằng phương pháp Realtime PCR."

Theo đó, nếu anh muốn tiến hành thử nghiệm với tôm sú bằng phương pháp Realtime PCR thì thực hiện theo các bước vừa nêu trên.