Thuốc nhuộm Hematoxylin dùng trong phương pháp parafin được chuẩn bị như thế nào? Phương pháp parafin dùng để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá có được tiến hành như thế nào?

Nội dung chính

• Thuốc thử và vật liệu thử trong phương pháp parafin dùng để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá gồm những loại nào?
• Thuốc nhuộm Hematoxylin dùng trong phương pháp parafin được chuẩn bị như thế nào?
• Phương pháp parafin dùng để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá được tiến hành như thế nào?

Thuốc thử và vật liệu thử trong phương pháp parafin dùng để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá gồm những loại nào?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá quy định về thuốc thử và vật liệu thử như sau:

"3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết để phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước tinh khiết, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung.

3.1.1. Etanol, 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.

3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR.

3.2.1. Cặp mồi (primers), gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.2.2. Agarose.

3.2.3. Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate - EDTA) (xem A.1).

3.2.4. Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.5. Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X).

3.2.6. Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.7. Thang chuẩn AND (Marker)

3.2.8. Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.9. Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit)

3.2.10. Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic), protein K.

3.3. Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng parafin.

3.3.1. Formalin 10 %, được chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (tỷ lệ thể tích 1 : 9).

3.3.2. Xylen.

3.3.3. Thuốc nhuộm Haematoxylin (xem A.2).

3.3.4. Thuốc nhuộm Eosin (xem A.3).

3.3.5. Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.

3.3.6. Keo dán lamen.

..."

Theo đó, thốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp parafin gồm:

- Formalin 10 %, được chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (tỷ lệ thể tích 1 : 9).

- Xylen.

-Thuốc nhuộm Haematoxylin (xem A.2).

- Thuốc nhuộm Eosin (xem A.3).

- Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.

- Keo dán lamen.

Thuốc nhuộm Hematoxylin dùng trong phương pháp parafin được chuẩn bị như thế nào? (Hình từ Internet)

Thuốc nhuộm Hematoxylin dùng trong phương pháp parafin được chuẩn bị như thế nào?

Theo Phụ lục A Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá quy định về dung dịch TAE như sau:

"A.1. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1. Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2. Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2. Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin - Mayer)

A.2.1. Thành phần

Hematoxylin dạng tinh thể:1 g

Natri iodat: 0,2 g

Amoni alum sulphate: (hoặc Postasium alum sulphate) 50 g

Axit citric: 1 g

Chloral hydrate: 50 g

Nước:1000 ml

A.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan Hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và Amoni alum sulphate hoặc kali nhôm sulfat, hòa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrate rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3. Thuốc nhuộm Eosin

A.3.1. Thành phần

Eosin Y 1 g

Etanol 70 % (thể tích) 1 lít

Axit axetic: 5 ml

A.3.2. Chuẩn bị

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 % (thể tích). Hòa tan eosin trong cồn, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong chai tối màu."

Từ quy định trên thì thành phần tạo nên thuốc nhuộm Hematoxylin gồm:

- Hematoxylin dạng tinh thể:1 g

- Natri iodat: 0,2 g

- Amoni alum sulphate: (hoặc Postasium alum sulphate) 50 g

- Axit citric: 1 g

- Chloral hydrate: 50 g

- Nước:1000 ml

Hòa tan Hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và Amoni alum sulphate hoặc kali nhôm sulfat, hòa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrate rồi lọc qua giấy lọc. Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

Phương pháp parafin dùng để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá được tiến hành như thế nào?

Theo tiết 6.2.4 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá quy định về cách tiến hành phương pháp parafin như sau:

"6.2. Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp parafin.

...

6.2.4. Cách tiến hành.

6.2.4.1. Đúc khuôn.

- Đặt khuôn nhựa (4.2.1) rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 h đến 3 h:

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h:

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3.5) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3.5) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

- Đúc khuôn: rót parafin (3.3.5) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa đặt vào khay sắt (4.2.4), đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

8.2.4.2. Cắt tiêu bản.

- Cắt gọt khối parafin (6.2.4.1) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.2.5),

- Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 µm đến 5 µm, cắt một vài lát;

- Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C

Dùng phiến kính (4.2.8) vớt dán lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô.

6.2.4.3. Nhuộm tiêu bản

- Ngâm tiêu bản (6.2 4 2) vào cốc xylen (3.3.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.3 3), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.3.4), thời gian từ 60 s đến 90 s;

- Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1 1) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.3.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.3.6). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.2.10).

6.2.5. Đọc kết quả.

Mẫu mô được soi dưới kính hiển vi quang học (4.2.10) cho thấy sự hiện diện của các khối u hình tròn màu trắng không bắt màu của H & E;

Giai đoạn sớm quan sát thấy sợi nấm tại vị trí hoại tử thể hiện ở những chấm đen nhỏ trên tiêu bản nhuộm. Dần hình thành những u hạt nấm màu trắng."

Theo đó, các bước tiến hành phương pháp parafin gồm:

- Đúc khuôn;

- Cắt tiêu bản;

- Nhuộm tiêu bản;

- Đọc kết quả.

Chi tiết các bước tiến hành phương pháp parafin được thực hiện theo Tiêu chuẩn vừa nêu trên.