Quy trình tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá được tiến hành như thế nào?

Nội dung chính

• Mẫu bệnh phẩm dùng trong việc chuẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá bằng phương pháp Nested RT PCR phải được bảo quản như thế nào?
• Việc tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR cần sử dụng đến dụng cụ nào?
• Quy trình tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá được tiến hành như thế nào?

Mẫu bệnh phẩm dùng trong việc chuẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá bằng phương pháp Nested RT PCR phải được bảo quản như thế nào?

Bệnh hoại tử thần kinh ở cá (Hình từ Internet)

Theo tiết 6.1.2 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định việc bảo quản mẫu bệnh phẩm dùng trong phương pháp Nested RT PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Phương pháp Nested RT - PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)

..

6.1.2 Bảo quản mẫu

Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 48 h hoặc bảo quản trong etanol từ 96 % đến 100 % (3.1.1). Đối với loại mẫu dùng cho phương pháp cắt mô cần phải cố định trong dung dịch formalin 10% và không bảo quản ở nhiệt độ âm;

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol từ 96 % đến 100 % (3.1.1).

...

Theo đó, mẫu bệnh phẩm trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 48 h hoặc bảo quản trong etanol từ 96 % đến 100 %.

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol từ 96 % đến 100 %.

Việc tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR cần sử dụng đến dụng cụ nào?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về thuốc thử và vật liệu thử dùng trong việc chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá như sau:

Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1 Etanol, từ 96 % đến 100 % (thể tích).

3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphate (PBS)

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) và Realtime RT PCR.

3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược RT PCR.

3.2.2 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò (Probe) Realtime RT PCR.

3.2.3 Kít tách chiết ARN (acid deoxyribo nucleic).

3.2.4 Kít nhân gen RT PCR, PCR

3.2.5 Kít nhân gen Realtime RT PCR

3.2.6 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.7 Thang chuẩn DNA (Ladder)

3.2.8 Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.9 Kít tách chiết ARN (acid deoxyribo nucleic).

3.2.10 Agarose

3.2.11 Dung dịch đệm TAE (Tris - acetate - EDTA) hoặc TBE (Tris - brorate - EDTA) (xem A.1).

3.2.12 Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.13 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X

...

Như vậy, để thực hiện quy trình tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR thì cần sử dụng đến kit tách chiết ARN

Quy trình tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá được tiến hành như thế nào?

Theo Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển quy định về việc tiến hành tách chiết ARN như sau:

B.1 Chuẩn bị hóa chất

VÍ DỤ: Bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNAMini Kit, Cat. No: 12280-050.

Các hóa chất cần được chuẩn bị và bảo quản theo đúng hướng dẫn của bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit, với thể tích vừa đủ cho số lượng mẫu chiết tách, bao gồm:

- Proteinase K

- Dung dich đệm Lysis Buffer

- Dung dịch Carrier ARN

- Dung dịch Wash buffer (W5)

- Nước RNAse-free (E3)

- Cách pha hỗn hợp dung dịch Carrier và Lysis Buffer

N x 0,21 mL = A mL

A mL x 28 µL/mL = B µL

Trong đó: N là số mẫu cần tách chiết

A là tổng số mL Lysis Buffer cần cho N mẫu;

B là tổng số µL Carrier ARN cần cho N mẫu.

B.2 Tiến hành

- Cho 25 µL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml;

- Cho 200 µL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K;

(Nếu thể tích mẫu < 200 µL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 µL bằng dung dịch PBS hoặc 0.9% NaCl).

- Cho hỗn hợp dung dịch Lysis Buffer và Carrier ARN vào ống chứa mẫu; đóng nắp ống và vortex 15s;

- Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;

- Cho thêm 250 µL cồn 96 - 100 % vào ống mẫu; đóng nắp và vortex 15s;

- Để ở nhiệt độ phòng 5 min;

(Mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên).

- Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc;

- Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 2 đến 3 min; chuyển cột lọc sang ống thu mới;

- Cho 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) vào cột lọc; ly tâm 12.000 vòng trong 2 đến 3 min; Chuyển cột lọc sang ống thu mới;

- Lặp lại bước 9 với 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) một lần nữa;

- Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới;

- Ly tâm khô 12000v trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5;

- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 µL;

- Cho 10 - 50 µL nước ARNse-free (E3) (có sẵn trong bộ kít) vào cột lọc;

- Để ở nhiệt độ phòng 1 min; Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 1 đến 2 min. Lấy sản phẩm dưới cột lọc;

- Bảo quản ARN ở nhiệt độ âm 80° C.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây bệnh VNN.

Theo đó, việc tiến hành tách chiết ARN trong phương pháp Nested RT PCR chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá được thực hiện theo Tiêu chuẩn nêu trên.