Phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn được tiến hành như thế nào? Cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR là cặp mồi nào?

Nội dung chính

• Để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn bằng phương pháp PCR thì cần dùng thuốc thử và vật liệu thử nào để hỗ trợ?
• Phương pháp PCR dùng để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn cần được sử dụng với cặp mồi nào?
• Phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn được tiến hành như thế nào?

Để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn bằng phương pháp PCR thì cần dùng thuốc thử và vật liệu thử nào để hỗ trợ?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-20:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn quy định về thuốc thử và vật liệu thử như sau:

Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1. Môi trường nước thịt

3.2. Môi trường thạch máu, thạch cơ bản được bổ sung từ 5 % đến 7 % máu cừu, máu bê, hoặc máu thỏ (pha chế thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

3.3. Huyết thanh ngựa.

3.4. Động vật thí nghiệm: chuột bạch hoặc chim bồ câu.

3.5. Bộ thuốc nhuộm Gram (Phụ lục A).

3.6. Thuốc nhuộm Giemsa (Phụ lục B).

3.7. Bộ giám định sinh hóa (Phụ lục C).

3.8. Nguyên liệu cho PCR (Phụ lục D).

Dẫn chiếu điểm D.1 Mục D Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-20:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn quy định về nguyên liệu cho phương pháp PCR như sau:

PHỤ LỤC D

(Quy định)

Phát hiện vi khuẩn E. rhusiopathiae bằng phương pháp PCR

D.1. Nguyên liệu PCR

D.1.1. Taq PCR Master Mix Kit

D.1.2. Cặp mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2)

D.1.3. Nước tinh khiết không có nuclease

D1.4. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

D.1.5. Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green

D.1.6. Loading dye

D.1.7. DNA chuẩn (Ladder, marker)

Theo đó, thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn gồm những loại như sau:

- Môi trường nước thịt

- Môi trường thạch máu, thạch cơ bản được bổ sung từ 5 % đến 7 % máu cừu, máu bê, hoặc máu thỏ (pha chế thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

- Huyết thanh ngựa.

- Động vật thí nghiệm: chuột bạch hoặc chim bồ câu.

- Taq PCR Master Mix Kit

- Cặp mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2)

-. Nước tinh khiết không có nuclease

- Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

-. Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green

- Loading dye.

Phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn được tiến hành như thế nào? (Hình từ Internet)

Phương pháp PCR dùng để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn cần được sử dụng với cặp mồi nào?

Theo tiết 5.2.5.3 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-20:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn quy định về việc xác định vi khuẩn E. rhusiopathiae bằng phương pháp PCR như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

5.2.5.3. Xác định vi khuẩn E. rhusiopathiae bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 2.

Tiến hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ lục D.

Như vậy, để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn bằng phương pháp PCR thì cần sử dụng cặp mồi ER1 (CGATTATATTCTTAGCACGCAACG) và cặp mồi ER2 (TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG). Cả hai cặp mồi đều có Gen đích là 16s rRNA và có kích cở sản phẩm là 937 (bp).

Phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn được tiến hành như thế nào?

Theo điểm D.2,D.3, D.4 và điểm D.5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-20:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn quy định về cách tiến hành phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn như sau:

PHỤ LỤC D

(Quy định)

Phát hiện vi khuẩn E. rhusiopathiae bằng phương pháp PCR

...

D.2. Chuẩn bị mẫu

Mẫu vi khuẩn kiểm tra là vi khuẩn nghi ngờ là E. rhusiopathiae đã nuôi cấy thuần khiết trên môi trường thạch máu (xem 3.2) trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1) từ 24 h đến 48 h.

Mẫu vi khuẩn làm đối chứng dương: chủng vi khuẩn đã được giám định là E. rhusiopathiae hoặc sử dụng các chủng E. rhusiopathiae chuẩn.

D.3. Tách chiết DNA

Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại hoặc bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Dùng que cấy (xem 4.5) lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 nl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

D.4. Phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn E. rhusiopathiae

Sử dụng cặp mồi ở Bảng 2 và chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng dẫn của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau:

- Taq PCR Master Mix Kit 12,5 μl

- Mồi xuôi 20 μ 1 μl

- Mồi ngược 20 μM 1 μl

- Nước không có nuclease 8,5 μl

- Mẫu DNA 2 μ

Tổng thể tích 25 μ

Chu trình nhiệt trong Bảng 2.

Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn E. rhusiopathiae (xem D.2).

Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA của vi khuẩn.

D.5. Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 8 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch.

Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian 30 min đến 40 min, ở 100 V.

Sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidi bromua 0,2 mg /100 ml.

Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo qui định của nhà sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen).

D.6. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Phản ứng âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra không có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Như vậy, phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.