Thực hiện tách chiết ADN trong phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm cần chuẩn bị những những gì?

Nội dung chính

• Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm gồm những loại nào?
• Thực hiện tách chiết ADN trong phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm cần chuẩn bị những những gì?
• Các bước tách chiết ADN trong phương pháp Realtime PCR được thực hiện ra sao?

Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm gồm những loại nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-20:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm quy định về thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp Realtime PCR như sau:

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1 Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0 °C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

4.1.2 Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

4.1.3 Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

4.1.4 Máy nghiền mẫu hoặc cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, vô trùng;

4.1.5 Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

4.2 Thiết bị, dụng cụ cho phương pháp PCR, realtime PCR

4.2.1 Máy nhân gen (PCR, realtime PCR);

4.2.2 Máy ly tâm lạnh, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

4.2.3 Máy lắc ủ nhiệt;

4.2.4 Máy spindown, ly tâm lắng;

4.2.5 Máy chiết tách ADN/ARN tự động (nếu có);

4.2.6 Bộ điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel;

Ngoài ra, còn có các loại đầu típ, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

Như vậy, thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp Realtime PCR gồm:

- Máy ly tâm lạnh, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

- Máy lắc ủ nhiệt;

- Máy spindown, ly tâm lắng;

- Máy chiết tách ADN/ARN tự động (nếu có);

- Bộ điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel;

Ngoài ra, còn có các loại đầu típ, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

Chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm (Hình từ Internet)

Thực hiện tách chiết ADN trong phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm cần chuẩn bị những những gì?

Theo Mục B1 Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-20:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm quy định về bước chuẩn bị như sau:

B.1 Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

Theo đó, để tiến hành tách chiết ADN trong phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm thì cần chuẩn bị:

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

Các bước tách chiết ADN trong phương pháp Realtime PCR được thực hiện ra sao?

Theo mục B2 Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-20:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm quy định về việc tiến hành tách chiết ADN như sau:

B.2 Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

- Hút 200 µl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 µl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 µl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 µl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 µl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

Như vậy, các bước tách chiết ADN trong phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.

Sau khi tách chiết ADN thành công thì mẫu ADN cần được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR. Trong trường hợp mẫu ADN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.