Tách chiết DNA của nấm trong quá trình giám định nấm gây bệnh thực vật được thực hiện theo mấy bước?

Nội dung chính

• Thiết bị, dụng cụ nào được sử dụng để giám định nấm gây bệnh thực vật?
• Việc lấy mẫu giám định nấm gây bệnh thực vật đối với cây trồng ngoài đồng ruộng được thực hiện thế nào?
• Tách chiết DNA của nấm trong quá trình giám định nấm gây bệnh thực vật được thực hiện theo mấy bước?

Thiết bị, dụng cụ nào được sử dụng để giám định nấm gây bệnh thực vật?

Thiết bị, dụng cụ được sử dụng để giám định nấm gây bệnh thực vật được quy định tại Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12195-1:2019 về Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 1: Yêu cầu chung, cụ thể gồm:

- Túi chứa mẫu;

- Tủ lạnh: nhiệt độ từ 3 °C đến 8 °C;

- Giấy bản;

- Bìa các tông;

- Kẹp ép mẫu thực vật;

- Tủ lưu trữ mẫu;

- Hộp lưu trữ mẫu;

- Lọ đựng mẫu: Trong suốt, trơ với hóa chất, có nắp kín khí;

- Hộp chứa mẫu: sạch, kín khí;

- Hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam;

- Kim khêu nấm;

- Dao cắt mẫu;

- Lam kính;

- Kính hiển vi: độ phóng đại 40 lần đến 1 000 lần;

- Lamen;

- Đèn cồn;

- Giấy lọc kích thước lỗ lọc 11 μm;

- Hộp petri;

- Lưới nhựa;

- Dụng cụ để ẩm;

- Tủ cấy, tủ hút khí;

- Chày, cối: bằng sứ hoặc nhựa;

- Ống eppendorf;

- Máy trộn dịch;

- Máy chu trình nhiệt (PCR);

- Kính lúp soi nổi độ phóng đại 40 lần đến 130 lần;

- Máy ly tâm: tốc độ từ 1 000 đến 4 000 vòng/phút.

Tách chiết DNA của nấm trong quá trình giám định nấm gây bệnh thực vật được thực hiện theo mấy bước? (hình từ internet)

Việc lấy mẫu giám định nấm gây bệnh thực vật đối với cây trồng ngoài đồng ruộng được thực hiện thế nào?

Việc lấy mẫu giám định nấm gây bệnh thực vật đối với cây trồng ngoài đồng ruộng được thực hiện theo quy định tại tiểu mục 5.1 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12195-1:2019 về Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 1: Yêu cầu chung, cụ thể như sau:

- Diện tích điều tra: phụ thuộc vào loại cây trồng, điều kiện cụ thể tại vùng điều tra và mục đích điều tra.

- Chọn điểm điều tra: Có thể chọn điểm điều tra theo một trong số các phương pháp sau

+ Chọn điểm theo đường chéo góc

+ Chọn điểm theo ô bàn cờ

+ Chọn điểm hình rẻ quạt

+ Chọn điểm ngẫu nhiên

+ Điều tra toàn bộ ruộng theo băng. Tại ruộng điều tra, điều tra toàn bộ ruộng theo phương pháp cuốn chiếu theo băng. Mỗi ruộng được chia ra làm các băng nhỏ, mỗi băng có chiều rộng 2 m, điều tra lần lượt từ đầu tới cuối băng và kiểm tra toàn bộ cây trồng trong mỗi băng điều tra.

- Số lượng mẫu: số lượng mẫu phụ thuộc vào mục đích điều tra và phương pháp lấy mẫu.

+ Cây ăn quả, cây lâu năm, cây công nghiệp: số lượng cây điều tra tại một điểm tối thiểu từ 3 cây đến 5 cây.

+ Cây hàng năm, rau màu, cây ngắn ngày: mỗi điểm có diện tích tối thiểu là 1 m2.

Tách chiết DNA của nấm trong quá trình giám định nấm gây bệnh thực vật được thực hiện theo mấy bước?

Tách chiết DNA của nấm trong quá trình giám định nấm gây bệnh thực vật được thực hiện theo quy định tại tiết 7.2.1 tiểu mục 7.1 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12195-1:2019 về Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 1: Yêu cầu chung, cụ thể như sau:

DNA của nấm có thể tách chiết bằng kít thương mại hoặc có thể tách chiết bằng các phương pháp sau:

- Tách chiết DNA tổng số từ mô cây

Bước 1: Nghiền 500 mg mô cây bằng chày và cối sứ (3.22) trong nitơ lỏng.

Bước 2: Chuyển 100 mg mô nghiền vào ống eppendorf (3.23) chứa 450 μl dịch chiết cây (NaCl0,4 M (4.8); Tris-HCl 10 mM pH 8,0 (4.17); EDTA 2,0 mM pH 8,0 (4.18); proteinase K400 μg/ mL (4.19); SDS2 % (4.20)).Trộn đều bằng máy trộn dịch (3.24).

Bước 3: Ủ ở 65 °C trong 1 giờ.

Bước 4: Thêm vào ống 300 μl NaCl 6M (4.21) và trộn đều bằng máy trộn dịch (3.24).

Bước 5: Ly tâm 12 000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch nổi vào ống mới.

Bước 6: Thêm phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) (4.22) vào ống với một thể tích tương đương và trộn đều bằng máy trộn dịch (3.24).

Bước 7: Ly tâm 12 000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch nổi.

Bước 8: Thêm chloroform (4.23) vào ống với một thể tích tương đương và trộn đều bằng máy trộn dịch (3.24).

Bước 9: Ly tâm 12 000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch nổi.

Bước 10: Thêm isopropanol (4.25) vào ống một thể tích tương đương.

Bước 11: Ly tâm 12 000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa DNA loại bỏ dịch.

Bước 12: Thêm vào ống 100 μl Cồn 70% (4.3) để rửa tủa DNA.

Bước 13: Loại bỏ Cồn 70 % (4.3) để kết tủa DNA khô tự nhiên trong 10 phút.

Bước 14: Hòa tan kết tủa DNA trong 100 μl TE (4.26) pH8 bảo quản ở 4 °C.

- Tách chiết DNA tổng số từ sợi nấm nuôi cấy trên môi trường

Bước 1: Dùng kim khêu nấm (3.11) vô trùng chuyển sợi nấm từ đĩa nuôi cấy vào ống eppendorf (3.23).

Bước 2: Nghiền nhỏ nấm bằng chày (3.22) nhựa vô trùng trong nitơ lỏng.

Bước 3: Chuyển hỗn hợp nghiền vào ống eppendorf mới đã chứa 400 μl dịch chiết nấm (NaCl 0,4 M(4.8); Tris-HCl 10 mM pH 8,0 (4.17); EDTA 2 mM (4.18); SDS20 g/l (4.20)). Trộn đều bằng máy trộn dịch (3.24).

Bước 4: Thêm vào ống 8 μl Proteinase K 20 mg/ml (4.18) lắc nhẹ.

Bước 5: Ủ ở 65 °C trong 2 giờ hoặc qua đêm.

Bước 6: Thêm vào 300 μl NaCl 6M (4.21) trộn bằng máy trộn dịch trong 30 giây.

Bước 7: Ly tâm 13 000 vòng/phút trong 30 phút thu dịch phía trên.

Bước 8: Thêm isopropanol (4.25) vào ống với một thể tích tương đương lắc nhẹ.

Bước 9: Ủ ở âm 20 °C trong 1 giờ hoặc lâu hơn.

Bước 10: Ly tâm 13 000 vòng/phút trong 15 phút thu tủa DNA loại bỏ dịch.

Bước 11: Thêm vào 100 μl cồn 70 % (4.3) để rửa kết tủa DNA.

Bước 12: Loại bỏ cồn 70 % (4.3), để tủa DNA khô tự nhiên trong 10 phút.

Bước 13: Hòa tan tủa DNA trong 100 μl TE (4.26) pH8 bảo quản ở 4 °C.