Môi trường tế bào chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân của cá chép quy định như thế nào về thành phần để nuôi dưỡng tế bào EPC trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút?

Nội dung chính

• Những loại thuốc thử và vật liệu thử nào cần dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào?
• Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào gồm những loại thiết bị dụng cụ nào?
• Thành phần môi trường để nuôi dưỡng tế bào EPC trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân của cá chép gồm những thành phần nào?

Những loại thuốc thử và vật liệu thử nào cần dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về thuốc thử và vật liệu thử như sau:

"3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung )

3.1.1 Etanol, từ 70 % đến 100 % (C2H6O)

3.1.2 Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS) (xem A.2)

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT- nested PCR (Reverse Transcription nested Polymerase Chain Reaction) và realtime RT-PCR (realtime Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

3.2.1 Mồi (primers) RT - nested PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.2.2 Agarose

3.2.3 Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate - EDTA) hoặc TBE (Tris-brorate - EDTA) (xem A.1)

3.2.4 Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe

3.2.5 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

3.2.6 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic)

3.2.7 Kít nhân gen RT-PCR

3.2.8 Nước tinh khiết, không có nuclease

3.2.9 Kít tách chiết ARN

3.2.10 Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit)

3.2.11 Kít nhân gen (Realtime RT-PCR)

3.2.12 Cặp mồi (primers) realtime RT-PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.2.13 Đoạn Dò (Probe)

3.2.14 Thang chuẩn ADN (Ladder)

3.3 Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào

3.3.1 Thuốc khử trùng: Virkon 1%

3.3.2 PBS 1X (Phosphate Buffered Saline)

3.3.3 Kháng sinh Penicillin

3.3.4 Kháng sinh streptomycin

3.3.5 Môi trường L-15 (L-15 Leibovitz medium)

3.3.6 FBS (Fetal bovine serum)

3.3.7 Glutamine

3.3.8 Dòng tế bào EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini)"

Như vậy, thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào bao gồm:

- Etanol, từ 70 % đến 100 % (C2H6O)

- Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS)

- Thuốc khử trùng: Virkon 1%

- PBS 1X (Phosphate Buffered Saline)

- Kháng sinh Penicillin

- Kháng sinh streptomycin

- Môi trường L-15 (L-15 Leibovitz medium)

- FBS (Fetal bovine serum)

- Glutamine.

Bệnh xuất huyết mùa xuân của cá chép (Hình từ Internet)

Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào gồm những loại thiết bị dụng cụ nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về thiết bị dụng cụ như sau:

"4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng chung

4.1.1 Tủ lạnh

4.1.2 Tủ âm sâu

4.1.3 Cân phân tích có thể cân chính xác 0,1 mg

4.1.4 Pipet đơn kênh các loại

4.1.5 Ống đong, dung tích 100ml; 500ml; 1000ml

4.1.6 Máy ly tâm

4.1.7 Lò vi sóng

4.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT- nested PCR và realtime RT- PCR

4.2.1 Máy nhân gen PCR

4.2.2 Máy nhân gen Realtime PCR

4.2.3 Máy lắc trộn vortex

4.2.4 Máy spindown

4.2.5 Khay đựng đá lạnh

4.2.6 Bộ khuôn và lược đổ thạch

4.2.7 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

4.2.8 Máy đọc gel

4.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên môi trường tế bào

4.3.1 Đĩa nuôi cấy 24 giếng (hoặc dĩa nuôi cấy 96 giếng)

4.3.2 Chai nuôi cấy

4.3.3 Màng lọc

4.3.4 Tủ ấm lạnh

4.3.5 Kính hiển vi soi ngược"

Từ Tiêu chuẩn vừa nêu trên thì thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào gồm:

- Tủ lạnh

- Tủ âm sâu

- Cân phân tích có thể cân chính xác 0,1 mg

- Pipet đơn kênh các loại

- Ống đong, dung tích 100ml; 500ml; 1000ml

- Máy ly tâm

- Lò vi sóng

- Đĩa nuôi cấy 24 giếng (hoặc dĩa nuôi cấy 96 giếng)

- Chai nuôi cấy

- Màng lọc

- Tủ ấm lạnh

- Kính hiển vi soi ngược

Thành phần môi trường để nuôi dưỡng tế bào EPC trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân của cá chép gồm những thành phần nào?

Theo Mục 6.4.1 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về chuẩn bị tế bào một lớp như sau:

"6.4.1 Chuẩn bị tế bào một lớp

Chuẩn bị tế bào EPC (3.3.8) một lớp trên đĩa 24 giếng hay 96 giếng (4.3.1) hoặc chai nuôi tế bào 25 cm2 (4.3.2) ở 22 °C đến 25 °C khoảng 48 h trước khi thực hiện quá trình phân lập vi rút. Mật độ tế bào nuôi cấy với đĩa 24 giếng là khoảng 420.000 tế bào/ giếng (mỗi giếng chứa 1,5 ml môi trường nuôi cấy tế bào); với đĩa 96 giếng là 62.500 tế bào/ giếng (mỗi giếng chứa 150 µl môi trường nuôi cấy tế bào); chai 25 cm2 là 3.000.000 tế bào/chai (5ml môi trường nuôi cấy tế bào/chai). Thành phần môi trường tế bào (xem Phụ lục C). Sau 2 ngày, tế bảo phủ đều khoảng 80 đến 90% diện tích đáy chai hay giếng nuôi cấy tế bào, môi trường nuôi cấy tế bào trong, mầu đỏ cam là đạt yêu cầu."

Dẫn chiếu Phục lục C.1 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về thành phần môi trường nuôi dưỡng tế bào EPC như sau:

"C.1 Môi trường có thành phần cơ bản là môi trường L-15 Leibovitz:

- L-15 Leibovitz medium;

- 2mM Glutamine;

- 10% (v/v) foetal bovine serum, (FBS);

- 100IU penicillin/100µg streptomycin per ml hay 50µg/mL Gentamycin.

C.2 Môi trường có thành phần cơ bản là Minimum Essential Medium (MEM)

- MEM (Earles);

- 2mM Glutamine;

- 1% Non Essential Amino Acids (NEAA);

- 120 mg/L Sodium Pyruvate;

- 10% (v/v) foetal bovine serum (FBS);

- 100IU penicillin/100µg streptomycin per mL hay 50µg/mL Gentamycin."

Theo đó, thành phần môi trường để nuôi tế bào EPC trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân của cá chép gồm những thành phần theo Phục lục C Tiêu chuẩn quốc gia Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 nêu trên.