Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11925:2017 yêu cầu về cách tiến hành tăng sinh và xử lý mẫu vi khuẩn trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi như thế nào?

Nội dung chính

• Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11925:2017 yêu cầu về cách tiền hành tăng sinh và xử lý mẫu vi khuẩn trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi như thế nào?
• Yêu cầu về việc tách chiết axit nucleic theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11925:2017 về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi như thế nào?
• Các tiêu chuẩn liên quan đến việc tăng sinh các vi sinh vật bao gồm những tiêu chuẩn nào?

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11925:2017 yêu cầu về cách tiền hành tăng sinh và xử lý mẫu vi khuẩn trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi như thế nào?

Tại tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11925:2017 về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi yêu cầu cách tiến hành tăng sinh và xử lý mẫu vi khuẩn như sau:

Các mẫu thực phẩm phải được tăng sinh theo các tiêu chuẩn tương ứng hoặc các tiêu chuẩn thích hợp khác. Có thể sử dụng môi trường tăng sinh khác thích hợp hơn với PCR, nếu sử dụng, các môi trường này cần được đánh giá xác nhận, để có hiệu năng ít nhất là tương đương với hiệu năng của môi trường quy định trong các tiêu chuẩn cụ thể.

Một số môi trường tăng sinh được khuyến cáo trong các tiêu chuẩn có chứa ít chất ức chế-phản ứng PCR hơn so với môi trường khác, nên cần được xem xét cẩn thận khi chọn phương pháp chuẩn bị mẫu.

Đối với một số sản phẩm, cần đặc biệt chú ý để ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật cạnh tranh (ví dụ bằng cách bổ sung hóa chất hoặc kháng sinh chọn lọc).

Các phương pháp ít gây hại nhất, ví dụ như pha loãng, ly tâm, phân hủy protein, lọc, ly tâm bằng trọng lực, tách từ tính miễn dịch, v.v... có thể được thực hiện. Trong trường hợp thiếu đáp ứng PCR, có thể thực hiện các phương pháp chính xác hơn như đun sôi, sử dụng các chất tạo phức hoặc hóa chất mạnh như cloroform và etanol hoặc dùng các bộ kit thử có tác dụng tương tự. Có thể sử dụng các phương pháp vật lý đơn giản để làm giảm hàm lượng chất béo của các mẫu có hàm lượng chất béo cao. Có thể sử dụng các chất tạo phức để làm giảm hàm lượng canxi cao trong các sản phẩm sữa mà có thể gây ức chế.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11925:2017 yêu cầu về cách tiền hành tăng sinh và xử lý mẫu vi khuẩn như thế nào? (Hình từ Internet)

Yêu cầu về việc tách chiết axit nucleic theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11925:2017 về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi như thế nào?

Tại tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11925:2017 về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi yêu cầu về việc tách chiết axit nuclei như sau:

* Tách chiết ADN

- Giải phóng ADN và tinh sạch

Một số nguyên tắc tách chiết ADN có thể được kết hợp. Ví dụ, có thể thực hiện các bước sau đây:

+ Phân hủy các protein trong dịch chiết tế bào bằng các protease (ví dụ proteinase K) và ARN bằng các ribonuclease.

+ Kết tủa các peptid tạo thành bằng các dung môi hữu cơ (ví dụ: hỗn hợp của phenol và cloroform) để lại ADN trong pha nước.

+ Tinh sạch dung dịch ADN và làm đặc tiếp bằng cách kết tủa trong etanol với sự có mặt của các cation hóa trị một.

+ Thu lấy ADN kết tủa bằng cách ly tâm.

+ Rửa ADN bằng etanol và hòa lại trong dung dịch đệm [ví dụ: dung dịch đệm tris(hydroxymetyl) aminometan/EDTA (dung dịch đệm Tris-EDTA) hoặc dung dịch đệm Tris].

Đồng kết tủa ADN là glycogen, polyetylen glycol (PEG) hoặc ARN vận chuyển (t-ARN) có thể được sử dụng để cải thiện sự thu nhận ADN trong các bước kết tủa. Chỉ sử dụng các đồng kết tủa không có bất kỳ hoạt tính nuclease, không có chất ức chế/cạnh tranh PCR và không có bất kỳ tương đồng trình tự với các đích PCR tiềm năng được nghiên cứu.

Chú thích: Sử dụng các máy sấy đóng băng chân không để làm khô các viên ADN thu được sau bước kết tủa có thể gây nhiễm chéo.

ADN có thể được giải phóng khi phá vỡ tế bào nhiệt (ví dụ bằng cách đun sôi trong 10 min). Sau khi đun sôi, ly tâm mẫu được làm lạnh và sử dụng phần nồi phía trên để chạy PCR. Trước khi đun sôi, để tạo thuận tiện cho việc phá vỡ tế bào, có thể xử lý bằng enzym (ví dụ: sử dụng lysozym, mutanolysin cho các vi khuẩn Gram dương) sau đó ủ protease/proteinase. Có thể cần đến các phương pháp khác như khuấy trộn mạnh các hạt khi sinh vật có thành tế bào khó phá vỡ (ví dụ: Mycobacterium spp.).

Có thể sử dụng phương pháp bất kỳ khác kể cả dùng bộ kit thử thương mại để tách chiết axit nucleic nếu cho các kết quả tương đương.

- Số lượng và chất lượng ADN

Số lượng và chất lượng của ADN tách chiết được sử dụng phương pháp đã cho trên một nền mẫu nhất định cần cho độ lặp lại và độ tái lập tốt trong quá trình khuếch đại bằng PCR, cung cấp đủ ADN có mặt trong nền mẫu. Đặc biệt, phương pháp được sử dụng phải cho độ thu hồi các đoạn ADN có kích thước trung bình tương đương hoặc lớn hơn so với các sản phẩm PCR được nghiên cứu.

Nồng độ và độ tinh khiết của ADN phân lập được có thể được ước tính bằng các phương pháp huỳnh quang hoặc điện di gel. ADN đã tinh sạch có thể được định lượng bằng các phương pháp quang phổ.

Cách đánh giá nhanh chất lượng và số lượng ADN là điện di trên gel agarose, sau đó nhuộm etidi bromua và đo huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím (UV) (xem Tài liệu tham khảo [1]).

Đối với một số phương pháp chuẩn bị mẫu (ví dụ đun sôi), cần sử dụng trực tiếp dung dịch axit nucleic sau khi chuẩn bị khi các axit nucleic được giải phóng không ổn định.

Nhìn chung, cần tránh lặp lại việc làm đông và rã đông dung dịch axit nucleic.

Sử dụng dụng cụ bằng chất dẻo thích hợp để bảo quản axit nucleic có các lượng bản sao thấp.

Chú thích: Một số vật liệu làm ống nghiệm có thể liên kết các axit nucleic.

Các tiêu chuẩn liên quan đến việc tăng sinh các vi sinh vật bao gồm những tiêu chuẩn nào?

Tại phụ lục A ban hành kèm theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11925:2017 về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi yêu cầu các tiêu chuẩn liên quan đến việc tăng sinh các vi sinh vật như sau:

Theo đó, các tiêu chuẩn được liệt kê trong Bảng A.1 bao gồm thông tin liên quan đến việc tăng sinh các vi sinh vật (vi khuẩn).