Có thể sử dụng tôm chết để làm mẫu chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm bằng phương pháp mô học không?

Nội dung chính

• Thiết bị, dụng dùng trong phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm gồm những thiết bị dụng cụ nào?
• Có thể sử dụng tôm chết để làm mẫu chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm bằng phương pháp mô học không?
• Có bao nhiêu bước thực hiện khi tiến hành chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm khi tiến hành phương pháp mô học?

Thiết bị, dụng dùng trong phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm gồm những thiết bị dụng cụ nào?

Tại tiết 3.2.2.2 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về thiết bị, dụng cụ dùng trong phương pháp mô học như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:

- Kính giải phẫu

- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen

- Lọ nhỏ cố định mẫu

- Bình rót parafin

- Bộ phận làm lạnh mẫu

- Máy cắt mẫu microtome

- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ

- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu

- Kính hiển vi quang học

- Cassete

- Khung đúc mẫu."

Theo đó cần chuẩn bị các thiết bị dụng cụ theo Tiêu chuẩn nêu trên để thực hiện chẩn đoán trong phương pháp mô học.

Có thể sử dụng tôm chết để làm mẫu chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm bằng phương pháp mô học không? (Hình từ Internet)

Có thể sử dụng tôm chết để làm mẫu chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm bằng phương pháp mô học không?

Tại tiết 3.2.2.3 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.2.3. Lấy mẫu

Thu những mẫu tôm có dấu hiệu không bình thường, cơ thể yếu, bơi lội lờ đờ, biếng ăn và ruột rỗng, giảm sức tăng trưởng rõ rệt, tỷ lệ trọng lượng, chiều dài thân thấp (mỏng đuôi).

Tôm có vỏ mềm và cơ thể nhũn; mang đen hoặc sẫm màu; bị nhiều vi sinh vật cơ hội bám trên mặt vỏ; vỏ bị nhiễm vi khuẩn, bao gồm các tổn thương loét lớp cutin hoặc phần phụ bị ăn mòn hóa đen; bị phồng rộp các tế bào sắc tố dẫn đến sự xuất hiện các rìa sẫm màu ở các náng đuôi và chân bụng. Khối gan tụy có thể bị teo.

Không dùng tôm chết hoặc tôm bảo quản đá để cắt mô.

Theo Tiêu chuẩn nêu trên thì không thể sử dụng tôm chết để làm mẫu chẩn đoán; chỉ chọn những mẫu tôm có dấu hiệu không bình thường, cơ thể yếu, bơi lội lờ đờ, biếng ăn và ruột rỗng, giảm sức tăng trưởng rõ rệt, tỷ lệ trọng lượng, chiều dài thân thấp (mỏng đuôi) để làm mẫu chẩn đoán.

Có bao nhiêu bước thực hiện khi tiến hành chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm khi tiến hành phương pháp mô học?

Tại tiết 3.2.2.4 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về cách tiến hành của phương pháp mô học như sau:

"3.2.2.4. Cách tiến hành

3.2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu

Cố định trong dung dịch Dadvison. Đối với ấu trùng hoặc tôm Postlarvae có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.

Đối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó có chứa gan tụy), dùng thuốc Davidson tiêm vào gan tụy và vùng xung quanh gan tụy. Lượng thuốc dùng từ 0,1 ml đến 10 ml (thay đổi tùy kích thước tôm), sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 3 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.

3.2.2.4.2. Khử mẫu cố định

Ngâm trong etanol 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong etanol tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.

3.2.2.4.3. Làm trong mẫu

Ngâm sang lọ xylen 1, để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm sang lọ xylen 2, để trong 30 min đến 60 min.

Sau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56 °C đến 58 °C trong 1 h.

Đúc khuôn: đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.

3.2.2.4.4. Cắt mẫu

Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.

Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước 30 °C đến 35 °C; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.

3.2.2.4.5. Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong etanol tuyệt đối, etanol 90 % và etanol 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ etanol 75 %, etanol 90 % và etanol tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada. Để khô và soi kính.

3.2.2.4.6. Đọc kết quả

Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao (100 X, 400 X, 1 000 X).

Mô học gan tụy của tôm bị bệnh hoại tử gan tụy thể hiện đặc điểm bệnh lý sau: Các vùng mô gan tụy bị hoại tử, bắt màu đồng đều của thuốc nhuộm, hoàn toàn không còn nhìn thấy cấu trúc tế bào và mô gan tụy đồng thời xuất hiện dày đặc những tế bào máu bao vây xung quanh những vùng bị hoại tử. Trên lát cắt mô học gan tụy với thuốc nhuộm haematoxylin và eosin cho thấy dấu hiệu của sự viêm teo từ trung bình tới rất nặng của ống gan tụy. Các tế bào biểu mô gan tụy khi bị viêm teo hoại tử chuyển từ hình trụ tròn sang hình khối, hoặc có thể bị phình to và chứa một số lớn vi khuẩn tự do giống với rickettsia, gram âm nằm trong nguyên sinh chất của các tế bào.

Ở tôm P, vannamei giai đoạn ấu niên bị nhiễm bệnh NHP nặng, mãn tính biểu mô tuyến gan tụy bị teo rõ rệt, dẫn đến phù thũng nặng (dịch tràn hoặc các khu vực có nước trong gan tụy).

Độ phóng đại 10000X tôm bị bệnh trong tế bào chất có nhiều vi khuẩn bệnh NHP dạng hình que và hình xoắn."

Theo đó, phương pháp mô học có 06 bước thực hiện: chuẩn bị mẫu; khử mẫu cố định; làm trong mẫu; cắt mẫu; nhuộm tiêu bản H&E và đọc kết quả.