• Số hiệu: TCVN11133:2015
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2015

a) Mẫu dò chưa được lai trong dung dịch

b) Mẫu dò đã được lai tạo thành trong huỳnh quang nhận

CHÚ DẪN:

1  Cơ chất ADN

2  Phân tử nhận

3  Phân tử cho

Hình 2 - Nguyên tắc của mẫu dò lai

3.11 

Mẫu dò dạng kẹp tóc (molecular beacon)

Mẫu dò huỳnh quang bao gồm ba phần khác nhau: phần trung tâm bổ sung trình tự acid nucleic đích, cộng với đầu 5’ và đầu 3’ là bổ sung, phân tử phát và phân tử dập tắt được gắn vào hai đầu mút của mẫu dò.

CHÚ THÍCH: Nguyên lý của tín hiệu phân tử được minh họa ở Hình 3.

...

...

...

a) Mẫu dò dạng kẹp tóc không lai trong dung dịch

b) Mẫu dò dạng kẹp tóc tạo thành trong phân tử phát huỳnh quang

CHÚ DẪN:

1  Cơ chất ADN

2  Phân tử huỳnh quang (phân tử phát)

3  Phân tử dập tắt

Hình 3 - Nguyên tắc của mẫu dò dạng kẹp tóc

3.12  Mẫu dò phát hiện trình tự ADN vi sinh vật gây bệnh đặc hiệu (probe for detection of a specitic pathogen DNA sequence)

Mẫu dò với một trình tự bổ sung vào ADN vi sinh vật gây bệnh có phân tử phát ra tín hiệu với bước sóng xác định và được phát hiện bằng hệ thống phát hiện quang học.

...

...

...

Mẫu dò với phân tử phát huỳnh quang được thiết kế để xác nhận quá trình khuếch đại

CHÚ THÍCH 1: Mẫu dò phát ra tín hiệu sẽ phân biệt được rõ với tín hiệu của mẫu dò được thiết kế cho việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh cụ thể.

CHÚ THÍCH 2: Việc áp dụng nội kiểm cần phải sử dụng một thiết bị có thể phát hiện được tín hiệu có bước sóng khác nhau.

3.14 

Chuẩn tham chiếu (passive reference)

Các phân tử huỳnh quang có mặt trong hỗn hợp phản ứng được dùng để chuẩn hóa tín hiệu

CHÚ THÍCH: Là khi các phân tử huỳnh quang bắt cặp với các trình tự acid nucleic hoặc các phân tử khác không tham gia vào phản ứng.

3.15 

Mức độ phát hiện huỳnh quang nền (baseline fluorescence detection level)

...

...

...

Điểm mà phản ứng đạt được mức độ huỳnh quang trên mức nền.

3.16 

Huỳnh quang nền (background fluorescence)

Nền “background”

Mức độ huỳnh quang nội tại được tạo ra từ thuốc thử và vật liệu phụ đang dùng.

3.17 

Điểm cắt của chu kỳ ngưỡng (threshold cycle crossing point)

Điểm trên đường cong khuếch đại khi tín hiệu huỳnh quang tăng lên cao hơn mức ban đầu hoặc cắt tại một ngưỡng đã xác định trước.

4  Nguyên tắc

...

...

...

Phân tích real-time PCR nhìn chung bao gồm:

a) Khuếch đại trình tự đích đặc hiệu bằng PCR với sự có mặt của mẫu dò huỳnh quang

b) Gắn mẫu dò huỳnh quang trong mỗi chu trình khuếch đại

c) Tạo ra tín hiệu huỳnh quang bằng sự kích thích trong mỗi chu trình

d) Phát hiện tín hiệu huỳnh quang bằng hệ thống phát hiện huỳnh quang

e) Phân tích số liệu

CHÚ THÍCH: Đối với mục đích sàng lọc, có thể dùng tín hiệu huỳnh quang từ cơ chất gắn với ADN sợi đôi.

4.2  Mẫu dò dùng cho real-time PCR

4.2.1  Sử dụng mẫu dò thủy giải

...

...

...

Mẫu dò này lai với trình tự acid nucleic đích. Trong bước kéo dài, enzym polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease bám kết mẫu dò lai. Sau khi gắn kết, reporter sẽ tách ra khỏi quencher, làm tăng cường độ huỳnh quang của reporter. Tín hiệu huỳnh quang tạo thành tỷ lệ thuận với việc tạo thành sản phẩm PCR đặc hiệu.

Đầu 3’ của mẫu dò cần đóng để tránh bị kéo dài trong quá trình chạy PCR.

4.2.2  Sử dụng mẫu dò lai

Người ta dùng 2 mẫu dò lai có mặt trong phản ứng PCR theo các oligonucleotide đặc hiệu thêm vào các mồi PCR. Mỗi mẫu dò này chứa một phân tử huỳnh quang, một làm phát huỳnh quang (donor) và một làm chất nhận huỳnh quang (acceptor) lai với các trình tự axit nucleic đích. Sau khi lai, cả hai chất ở trong một khoảng cách gần sao cho việc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang xảy ra trên bước sóng kích thích và chất nhận huỳnh quang phát hiện được tín hiệu. Tín hiệu huỳnh quang tạo ra tỷ lệ thuận với sản phẩm PCR đặc hiệu.

Đầu 3’ của các mẫu dò cần đóng để tránh bị kéo dài trong quá trình chạy PCR.

4.2.3  Sử dụng mẫu dò dạng kẹp tóc

Mẫu dò dạng kẹp tóc là một oligonucleotide đặc hiệu có mặt trong phản ứng PCR cùng với các cặp mồi PCR.

Khi các mẫu dò dạng kẹp tóc liên kết với trình tự đích bổ sung tại nhiệt độ lai, chúng trải qua quá trình chuyển đổi thích nghi làm tách ra xa. Điều này dẫn đến quá trình lai-đích-mẫu dò dài hơn và ổn định hơn so với thân. Sự phân tách reporter và quencher làm cho reporter phát tín hiệu (xem Tài liệu tham khảo [3]). Tín hiệu huỳnh quang tạo ra tỷ lệ thuận với sản phẩm PCR đặc hiệu.

5  Yêu cầu chung trong phòng thử nghiệm

...

...

...

6  Thuốc thử và vật liệu thử

6.1  Yêu cầu chung

Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước tinh khiết tương đương không có axit nucleic và nuclease thích hợp cho phân tích sinh học phân tử.

Không sử dụng các thuốc thử, ví dụ các thành phần của canh thang tăng sinh, những chất này có thể ảnh hưởng đến việc phát hiện tín hiệu huỳnh quang của máy.

Những yêu cầu cụ thể áp dụng cho từng loại thuốc thử cụ thể được nêu trong 6.2 đến 6.6.

6.2  ADN polymerase và chất đệm cho phản ứng

6.2.1  ADN polymerase

Sử dụng polymerase chịu nhiệt (có thể có hoạt tính phiên mã ngược) cho PCR. Enzym này nên được dùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

CHÚ THÍCH: Enzym này có thể là tự nhiên hoặc là enzym tái tổ hợp về mặt di truyền, đã được tinh sạch.

...

...

...

Mỗi ADN polymerase cần có những điều kiện thực nghiệm khác nhau.

6.2.2  Chất đệm phản ứng

Chất đệm phản ứng phải phù hợp với TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006).

6.3  Deoxyribonucleotide triphosphat (dNTP) dùng cho phản ứng PCR

Các dNTP được sử dụng phải phù hợp với TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006).

6.4  Mồi

Các cặp mồi được dùng phải phù hợp với TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006).

6.5  Mẫu dò huỳnh quang dùng cho real-time PCR

Các oligonucleotide phải có chất lượng phù hợp, được thiết kế để phát hiện trình tự có mặt trong sản phẩm PCR đặc hiệu. Trình tự mẫu dò cần được bổ sung phù hợp với trình tự của ADN đích.

...

...

...

Hiệu quả khuếch đại của mẫu thử sẽ được kiểm tra bằng đoạn ADN kiểm chứng được bổ sung vào bình phản ứng như phần chiết ADN của mẫu thử. Có thể dùng cùng một cặp mồi để khuếch đại của đoạn ADN kiểm chứng và khuếch đại của đích ADN (kiểm soát khuếch đại bên trong đồng đẳng) hoặc một cặp mồi khác (kiểm soát khuếch đại bên trong không đồng đẳng). Hệ thống đích và hệ thống kiểm soát khuếch đại bên trong cần có hiệu quả khuếch đại giống nhau. Nồng độ đoạn ADN kiểm chứng được bổ sung nên càng thấp càng tốt để có thể phát hiện được hàm lượng chất ức chế nhỏ nhất và cho kết quả dương tính tương tự. Ngoài ra, cần biết chắc rằng kiểm soát khuếch đại bên trong không ảnh hưởng đến mức phát hiện của đoạn gen đích. Những lý do sau làm giảm những tương tác không tốt đến mức độ phát hiện

- Hiệu quả khuếch đại của đối chứng khuếch đại bên trong đồng đẳng hơi thấp hơn ADN đích;

- Nồng độ mồi đối với kiểm soát khuếch đại bên trong không đồng đẳng được giảm.

Chất kiểm soát khuếch đại bên trong có thể được đưa vào mẫu ở giai đoạn đầu của phép phân tích và ở cùng thời gian hoạt động để kiểm soát quy trình tách chiết.

6.7  Thuốc thử để ngăn ngừa lây nhiễm chéo

Ngăn ngừa nhiễm chéo theo TCVN 7682 (ISO 20838).

7  Thiết bị, dụng cụ

7.1  Yêu cầu chung

Trang thiết bị phần cứng được dùng theo TCVN 11134 (ISO 22174).

...

...

...

7.2  Các thiết bị, dụng cụ cụ thể

Ngoài các trang thiết bị của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ nêu trong TCVN 11134 (ISO 22174), cần sử dụng các thiết bị cụ thể như sau:

7.2.1  Máy chu trình nhiệt, được trang bị

a) nguồn năng lượng phù hợp để giải phóng các phân tử huỳnh quang

b) hệ thống phát hiện thích hợp để phát hiện tín hiệu huỳnh quang được sinh ra trong quá trình PCR

Việc sử dụng các kiểm chứng bên trong cần phải có những thiết bị có thể phát hiện được những tín hiệu với bước sóng khác nhau.

7.2.2  Bình phản ứng, nắp đậy phải chịu được việc gia nhiệt lặp lại ở nhiệt độ 100 °C sau đó làm lạnh xuống 4 °C mà không ảnh hưởng đến tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong quá trình khuếch đại.

8  Mẫu phòng thử nghiệm

Chất chiết có chứa các axit nucleic tách được từ nền mẫu thích hợp với phạm vi áp dụng phù hợp với mẫu phòng thử nghiệm với điều kiện đảm bảo không gây ức chế phản ứng PCR hay ảnh hưởng đến việc phát ra tín hiệu huỳnh quang.

...

...

...

9.1  Chuẩn bị mẫu

Việc tách chiết và/hoặc tinh sạch axit nucleic của mẫu thử cần thực hiện theo các phương pháp thích hợp, ví dụ ISO 20837.

Dung dịch axit nucleic được tạo ra cần có đủ lượng axit nucleic đích cho phân tích định lượng và có thể phát hiện được từ 1 đến 10 vi sinh vật đích hoặc đương lượng di truyền virus trong mẫu thử. Phương pháp làm giàu hoặc phương pháp cô đặc virus hoặc vi sinh vật đích dùng cho phương pháp định lượng chỉ cần một lượng nhỏ các đích trong mẫu thử.

Dung dịch axit nucleic được tạo nên chứa ít chất ức chế mà ảnh hưởng đến phản ứng PCR và các chất này không ảnh hưởng đến sự phát ra của tín hiệu huỳnh quang

CHÚ THÍCH: Huỳnh quang thường được giữ trong bình phản ứng tối màu cùng với một số chất phù hợp.

Phân tích định lượng cần có quy trình chuẩn bị mẫu để đảm bảo đủ số lượng axit nucleic của virus hoặc vi sinh vật đích có trong dung dịch axit nucleic được tạo ra được sao chép cao.

9.2  Khuếch đại

9.2.1  Yêu cầu chung

Việc khuếch đại axit nucleic đặc hiệu được thực hiện in vitro trong phòng thí nghiệm thông qua phản ứng chuỗi trùng hợp ADN polymerase với sự có mặt của các cặp mồi, oligonucleotide, chất đệm phản ứng và mẫu dò huỳnh quang trong chất đệm phản ứng xác định.

...

...

...

Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong quá trình khuếch đại.

ARN có thể được phát hiện khi dùng kỹ thuật real-time PCR nếu trình tự được chuyển thành trình tự ADN bổ sung bằng phương pháp phiên mã ngược.

9.2.2  Các tham số của chu trình

9.2.2.1  Mẫu dò thủy giải

Về cơ bản, quá trình khuếch đại sử dụng chu trình 2 bước bao gồm bước biến tính, gắn mồi, bắt cặp với mẫu dò và bước kéo dài. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong bước bắt cặp và kéo dài

9.2.2.2  Mẫu dò lai

Quá trình khuếch đại sử dụng chu trình 3 bước bao gồm bước biến tính, bắt cặp mồi và mẫu dò và bước kéo dài. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong bước bắt cặp

9.2.2.3  Mẫu dò dạng kẹp tóc

Về cơ bản, quá trình khuếch đại sử dụng chu trình 3 bước bao gồm bước biến tính, gắn mồi và mẫu dò dạng kẹp tóc và bước kéo dài. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong bước bắt cặp.

...

...

...

Các mẫu kiểm chứng được nêu trong TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005).

Real-time PCR cho phép phát hiện cùng một lúc tín hiệu huỳnh quang của vi sinh vật gây bệnh cụ thể và của mẫu kiểm soát khuếch đại bên trong. Do đó, khi thực hiện phương pháp này cần có mẫu kiểm soát khuếch đại bên trong.

9.4  Phân tích số liệu huỳnh quang

9.4.1  Đường khuếch đại

9.4.1.1  Yêu cầu chung

Trong quá trình khuếch đại, số sản phẩm PCR phát hiện được tăng lên. Việc tăng tín hiệu huỳnh quang liên quan đến tăng các sản phẩm PCR. Điều này được hiển thị trên đường cong khuếch đại (xem Hình 4).

Đường cong khuếch đại điển hình gồm ba giai đoạn đặc trưng cho quy trình PCR.

CHÚ DẪN:

...

...

...

v số lượng chu trình khuếch đại

1  Pha hàm số mũ

2  Pha tuyến tính

3  Pha ổn định

Hình 4 - Đường khuếch đại

9.4.1.2  Pha 1: Pha hàm mũ

Pha hàm mũ có dải chu trình độ chụm cao đặc trưng bởi hiệu quả khuếch đại cao và không đổi. Trong pha hàm mũ, mối tương quan giữa sản phẩm PCR với nhiệt độ ban đầu được thể hiện theo Công thức (1):

N_c = N (1 + η)^v                                                                           (1)

Trong đó:

...

...

...

N là số phân tử đích ban đầu

η là hiệu quả của hệ thống

v là số chu trình khuếch đại.

9.4.1.3  Pha 2: Pha tuyến tính

Pha tuyến tính đặc trưng bởi mức độ ảnh hưởng mà độ dốc của đường khuếch đại giảm đến độ ổn định. Ở thời điểm này một hoặc nhiều thành phần giảm xuống dưới nồng độ tới hạn và hiệu quả khuếch đại bắt đầu giảm. Pha được gọi là tuyến tính vì khuếch đại xấp xỉ cấp số cộng chứ không phải là cấp số nhân.

9.4.1.4  Pha 3: Pha ổn định

Ở giai đoạn này, việc khuếch đại PCR sẽ không còn và tín hiệu huỳnh quang duy trì ở trạng thái ổn định (xem Tài liệu tham khảo [4]).

9.4.2  Đánh giá dữ liệu huỳnh quang

Mẫu phân tích tạo ra đồ thị khuếch đại với ít nhất pha 1 của đường cong khuếch đại điển hình. Đường cong khuếch đại của các mẫu cắt ngang một ngưỡng xác định được thiết lập sau số chu trình nhất định. Mẫu với tính hiệu huỳnh quang trên ngưỡng được coi là dương tính.

...

...

...

9.4.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp định lượng xác định tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số lượng trình tự axit nucleic đích được tạo ra trong pha khuếch đại của phản ứng PCR. Phương pháp này được dùng để xác định lượng hoặc axit nucleic đích ban đầu trong mẫu

Axit nucleic đích được định lượng dựa trên đường chuẩn (stADNard curve)

Có thể dùng các phương pháp định lượng khác nếu giá trị của chúng được xác định.

9.4.3.2  Phương pháp đường chuẩn dùng cho định lượng

Có thể sử dụng gốc ADN hoặc ARN đích tinh sạch và ổn định với nồng độ đã biết để chuẩn bị đường chuẩn bằng một dãy pha loãng. Hiệu quả khuếch đại của đường cong chuẩn và axit nucleic đích phải gần giống nhau. ADN plasmid và ARN sao chép in vitro được dùng phổ biến khi xây dựng đường chuẩn.

Nồng độ đích cần nằm trong dải đường chuẩn.

Có thể áp dụng một số điểm hiệu chuẩn thích hợp và lặp lại bao trùm dải định lượng [ví dụ: có ít nhất bốn điểm với hai điểm lặp lại (tổng của các giá trị 4x2) hoặc sáu điểm hiệu chuẩn với một phép đo tại mỗi điểm (tổng là sáu giá trị)].

10  Đánh giá và tài liệu

...

...

...

Các kết quả PCR được liệt kê trong Bảng 2 của TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005).

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO 20837, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Requirements for sample preparation for qualitative detection [Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về chuẩn bị mẫu để phát hiện định tính]

[2] Forster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. Ann. Phys. 1948, 2, p.55-75

[3] Bustin, S.A. Quantification of mARN using real-time RT-PCR: Trends and problems. J. Mol. Endocrinol. 2002,29, p.23-39

[4] APPLIED BIOSYSTEMS, ABI Prism® 7900HT Sequence Detection System use’s manual. Applied Biosystems, Foster City, CA, 2001.