Từ khoá: Số Hiệu, Tiêu đề hoặc Nội dung ngắn gọn của Văn Bản...

Đăng nhập

Quên mật khẩu?   Đăng ký mới
Đăng nhập bằng Google

Số hiệu: TCVN11131:2015 Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành: *** Người ký: ***
Ngày ban hành: Năm 2015 Ngày hiệu lực:
ICS:07.100.30 Tình trạng: Đã biết

Chất phản ứng

Nồng độ cuối cùng

Th tích từng mu (ml)

Plasmit pSC17

10 000 bản sao ~6 pg

2,0

Nước

 

31,8

Dung dịch đệm PCR 10x (không có MgCI2)

1x

5,0

Dung dịch MgCI2a, 25 mmol/l

2,5 mmol/l

5,0

Dung dịch dNTP, 10 mmol/l

0,2 mmol/l

1,0

Mồi M13 (-26), 5 mmol/l

0,25 mmol/l

2,5

Mồi M13 (-20), 5 mmol/l

0,25 mmol/l

2,5

Taq-ADN-polymerase, 5 U/ml

1 đơn vị cho một phản ứng

0,2

a Nếu dung dịch đệm PCR chứa sẵn MgCl2, thì nng độ cuối cùng của MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng phải được điều chnh cho đúng 2,5 mmol/l.

A.5.1.2. Chương trình thời gian nhiệt độ

Chương trình thời gian nhiệt độ được nêu trong Bảng A.2.

Chương trình này có th được thay đổi theo kiểu loại máy chu trình và/hoặc enzym sử dụng.

Bảng A.2 - Chương trình thời gian nhiệt độ

Biến tính ban đu

2 min/95 oC

Khuếch đại

10 s/95 oC

 

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

 

20 s/72 oC

Số chu trình

40

Kéo dài cuối cùng

2 min/72 oC

A.5.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR và xác định kết quả

Một lượng 5 ml của sản phm PCR được tách bằng điện di trên gel agarose và được nhuộm với etidi bromua để hiển thị sản phm PCR. Số thể tích sản phẩm còn lại sẽ được tinh sạch và kết quả được xác định bằng đo quang phổ hoặc phương pháp phù hợp bất kỳ[2].

A.5.1.4. Chuẩn b các nồng độ khuôn mẫu

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Các sản phẩm PCR được chuẩn bị trong nước ở 3 dung dịch có nồng độ khác nhau: 1 000 bản sao/ml, 100 bản sao/ml và 10 bản sao/ml.

Các nồng độ ADN đích được mã hóa như sau:

- a = 1 000 bản sao/ml (tương ứng với 5 000 bản sao cho một PCR);

- b = 100 bản sao/ml (tương ứng với 500 bản sao cho một PCR);

- c = 10 bản sao/ml (tương ứng với 50 bản sao cho một PCR).

A.5.2. Kiểm tra máy chu trình nhiệt

A.5.2.1. Cài đặt PCR

Phương pháp này sử dụng thể tích PCR cuối cùng là 50 ml cho một phản ứng. Chất phản ứng và nồng độ cuối được nêu trong Bng A.3.

Sử dụng ít nhất 16 phản ứng PCR cho máy chu trình nhiệt 96 giếng.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

- chuẩn bị hỗn hợp PCR;

- chia hỗn hợp PCR ra làm 3 phần và 1 kiểm soát âm tính;

- thêm ADN đích ở 3 nồng độ khác nhau vào 3 phần để tạo hỗn hợp đích PCR.

- chia mỗi hỗn hợp đích PCR ra làm 5 phần sao chép và đưa tất c vào đĩa đựng mẫu trong máy chu trình nhiệt ở những vị trí xác định.

Bng A.3 - Cht phản ứng b sung

Thuốc th

Nồng độ cui cùng

Thể tích cho một mẫu (ml)

Th tích khuyến cáo cho 16 mẫu (ml)

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

 

24,78

401,48b

Dung dịch đệm PCR 10x (không cha MgCl2)

1x

5,0

80,0

Dung dịch MgCI2a, 25 mmol/l

3 mmol/l

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

96,0

Dung dịch dNTP, 10 mmol/l

0,2 mmol/l

1,0

16,0

Mồi VAL1, 5mmol/l

0,4 mmol/l

4,0

64,0

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

0,4 mmol/l

4,0

64,0

Taq-ADN-polymerase, 5 U/ml

1,1 đơn vị cho một phản ứng

0,22

3,52

a Nếu dung dịch đệm PCR đã chứa MgCl2, thì nồng độ cuối cùng của MgCl2 trong hn hợp phn ứng phải được điu chnh đến 3 mmol/I.

b Thay nước cho 16 phn ứng và 5 ml cho kiểm chứng dương (5 ml khuôn mẫu được thay thế bởi 5 ml nước).

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Hình A.2 - Sơ đồ các ống PCR để kiểm tra máy chu trình nhiệt 96 giếng

A.5.2.2. Chương trình thời gian nhiệt độ

Chương trình thời gian nhiệt độ nêu trong Bảng A.4.

Bảng A.4 - Chương trình thời gian nhiệt độ

Biến tính ban đầu

2 min/95 oC

Khuếch đại

10 s/95 oC

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

20 s/63 oC

 

20 s/72 oC

Số chu trình

40

Kéo dài cuối cùng

5 min/72 oC

A.5.3. Phát hiện

A.5.3.1. Yêu cầu chung

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

A.5.3.2. Chuẩn bị thạch agarose, điện di và nhuộm

Cân một lượng agarose thích hợp (A.3.8) trộn với dung dịch đệm điện di (A.3.19 hoặc A.3.20) để có được nồng độ cuối cùng ρ = 20 g/l. Lớp gel không được dày quá 1cm.

Trộn 5 ml từng sn phẩm PCR với khoảng 1 ml dung dịch đệm để chạy mẫu (A.3.21) và cho vào gel.

Cho marker khối lượng phân tử vào một giếng riêng.

Tiến hành điện di ở nhiệt độ phòng. Sử dụng điện thế phù hợp để giữ điện thế ổn định tối đa là 5 V/cm giữa các điện cực.

Sau khi điện di hoàn tất, ủ gel ít nht 30 min trong dung dịch etidi bromua (A.3.22) ở nhiệt độ phòng, ở nơi tối.

Có thể sử dng các phương pháp nhuộm gel agarose khác nếu cho kết quả tương đương.

Chuyển thạch gel vào để soi bằng đèn cực tím (A.4.4). Bật đèn cực tím và ghi lại huỳnh quang của ADN bằng việc chụp ảnh hoặc quay phim.

A.6. Diễn giải kết qu

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Nếu trong tất cả các mẫu thử phát hiện được sản phẩm khuếch đại là các cặp base 116, thì sai số nhiệt độ gắn mồi ở 63 oC là nhỏ hơn 3 oC. Nếu không thấy sản phẩm nào, thì hoặc là có sự vưt quá nhiệt độ hoặc biến tính không đ. Cả hai trường hợp này là do việc kiểm soát chương trình nhiệt độ trong máy chu trình nhiệt không được tt.

Việc diễn giải kết quả được nêu trong Bảng A.5.

Bảng A.5 - Diễn giải kết quả

Số lượng bn sao

Hiệu năng chp nhận được: sn phm phát hiện thấy

Hiệu năng không chấp nhận được: sản phẩm không phát hiện

5 000

5 trên 5

< 5 trên 5

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

5 trên 5

< 5 trên 5

50

£ 5 trên 5a

 

a Các phản ứng với 50 bản sao cho 1 phản ứng có thể cho ra các dải ADN nhạt

Trong trường hợp kết quả hiệu năng không chấp nhận được (xem bng A.5), thì cần kiểm tra lại. Nếu kết quả được xác nhận, thì hiệu năng của máy chu trình nhiệt là có vấn đề và thiết bị phải được kiểm tra hiệu năng vật lý.

 

PHỤ LỤC B

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

KIỂM TRA HIỆU NĂNG VẬT LÝ

B.1. Yêu cu chung

Đây là phương pháp để kiểm tra chính xác nhiệt độ máy chu trình nhiệt trong các điều kiện hoạt động. Việc kiểm tra này ghi lại nhiệt độ chất lỏng trong ống mẫu.

B.2. Nguyên tắc

Nhiệt độ được đo bằng cặp nhiệt điện hay thiết bị khác có khả năng đo được nhiệt độ ở trong lọ có chứa nước.

Quy trình kiểm tra vật lý được tiến hành trong các điều kiện đang chạy PCR. Theo đó thì quá trình kiểm tra sẽ bao gồm loạt 3 cấp độ nhiệt độ được s dụng để biến tính, gn mồi và kéo dài mồi.

Nếu như máy chu trình nhiệt có nắp đậy, thì việc đo phải tiến hành khi nắp được đậy.

B.3. Chất phản ứng

B.3.1. Nước

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

B.4.1. Máy chu trình nhiệt

B.4.2. Thiết bị ghi nhiệt độ: đầu dò ghi nhiệt độ, dây dẫn và các thiết bị đo nhiệt độ.

Định kỳ hiệu chuẩn bộ phận đo nhiệt độ đi với dải nhiệt độ sử dụng.

B.5. Cách tiến hành

B.5.1. Bố trí phép thử

Đặt đầu dò nhiệt độ tại các vị trí đại diện cho dải kiểm soát nhiệt độ. Việc chọn v trí ti hạn phải được cân nhắc cn thận. Khi không xác định được vị trí tới hạn thì đặt ngẫu nhiên các cảm biến trong các giếng.

Ví dụ : Đối với máy chu trình 96 giếng, chia số giếng thành 6 vùng bằng nhau. Đặt ít nht 2 đu dò nhiệt đtại mỗi vùng. Do đó có ít nht 12 điểm nhiệt độ được ghi[1].

B.6. Ghi các giá trị nhiệt độ

Cn cài đặt tần suất ghi nhiệt độ sao cho ít nhất 1 giá trị nhiệt độ được ghi lại cho một vị trí trong một giây [1].

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Cho mỗi vị trí kiểm tra, tính trung bình giữa điểm nhiệt độ cao nht và thấp nhất ở điểm thời gian to (điểm thời gian khi chương trình nhiệt độ bắt đu) và tx (điểm thời gian lúc chương trình nhiệt độ kết thúc) cho các bước biến tính, gắn mồi và kéo dài [1].

B.7. Giải thích kết qu

Khảo sát nghiên cứu nhiệt độ ở vị trí cao nhất và thấp nhất. Cả 2 nhiệt độ này phải hoặc nằm trong dải nhiệt độ ghi của máy hoặc nếu không có quy định về độ chính xác của nhiệt độ, thì không được sai lệch ln hơn 0,5 oC so với nhiệt độ chương trình. Nhiệt độ phải nằm trong di quy định đi với mỗi bước trong chu trình và trong quá trình chạy.

Không sử dụng các máy chu trình nhiệt không đảm bảo được các điu kiện trên.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] SCHODER D., SCHMALWIESER A., SCHAUBERGER G., KUHN M., HOORFAR J. and WAGNER M. Physical characteristics of six new thermocyclers. Clin. Chem., 49, 6, 2003, pp. 960-963

[2] HEATON P.A. Quantification of total DNA by spectroscopy. In: Analytical Molecular Biology: Quality and Validation, ed. Sauders G. S and Parker H.C., RCS publications, 1999, UK

1) Đây là ví dụ v sn phm thich hợp có bán sẵn. Thông tin này được đưa ra để thun tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn mà không ấn định sử dụng sản phm này. Các sản phm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết qu tương đương.

Văn bản này chưa cập nhật nội dung Tiếng Anh

Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11131:2015 (ISO/TS 20836:2005) về Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Phép thử hiệu năng đối với máy chu trình nhiệt

Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


1.596

Địa chỉ: 17 Nguyễn Gia Thiều, P. Võ Thị Sáu, Q.3, TP.HCM
Điện thoại: (028) 3930 3279 (06 lines)
E-mail: info@ThuVienPhapLuat.vn

DMCA.com Protection Status
IP: 3.236.221.156