Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11201:2016 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng sulfamethazin

• Số hiệu: TCVN11201:2016
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2016

Nồng độ SMT, μg/mL^a	Thể tích dung dịch chuẩn trung gian^b (4.14.2), ml	Thể tích dung dịch chuẩn nội A (4.13.2.1), ml	Pha loãng đến, ml	Thể tích dung dịch pha loãng của chất chuẩn, Ds^c, ml
1,1	2,0	5,00	100,0	100 000
2,2	4,0	5,00	100,0	50 000
5,5	10,0	5,00	100,0	20 000
6,6	12,0	5,00	100,0	16667
^a Nồng độ thực tế của SMT, ^b Dung dịch chuẩn trung gian SMT (khoảng 55 μg/ml). ^c Ds là tổng thể tích pha loãng của chất chuẩn, ml.

4.16  Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột, nồng độ DMAB (4.8) 15 mg/ml và nồng độ HQ (4.9) 0,5 mg/ml

Hòa tan 3,0 g DMAB (4.8) và 0,1 g HQ (4.9) trong 100 ml axit axetic băng (nồng độ không nhỏ hơn 99,7%). Cẩn thận thêm 60 ml metanol (4.2) và trộn đều. Thêm 40 ml nước (4.1), trộn đều và lọc chân không. Loại khí khoảng từ 2 min đến 3 min bằng chân không trong vẫn khi khuấy. Khi được bảo quản ở nơi tối, dung dịch này có thể bền được hơn một tháng.

CHÚ THÍCH: Nếu tiến hành phân tích nhiều hơn vài mẫu thì tăng lượng thuốc thử sử dụng.

CẢNH BÁO: Tránh tiếp xúc thuốc thử này với da hoặc quần áo.

4.17  Pha động, hỗn hợp axetonitril (4.4) và axit axetic 2% (4.3) (tỷ lệ thể tích 17 : 83) hoặc được điều chỉnh để tối ưu hóa cho sắc kí.

Có thể sử dụng pha động thay thế: hỗn hợp của axetonitril (4.4), metanol (4.2) và axit axetic 2% (4.3) (tỷ lệ thể tích 4 : 16 : 80) hoặc hỗn hợp của [A] axetonitril (4.4) và metanol (4.2) (tỷ lệ thể tích 2 : 3), cộng với [B] axit axetic 2% (4.3), với tỷ lệ thể tích A : B = 20 : 80 nếu pha trộn bằng thiết bị. Các tỷ lệ khác giữa axetonitril và metanol có thể được tối ưu cho các loại cột cụ thể. Việc sử dụng pha động thay thế có thể gây ra sự thay đổi đáng kể các yếu tố gây nhiễu pic và do đó tăng độ phân giải pic sulfonamid. Độ phân giải sulfonamid trên một số cột cũng có thể được cải thiện bằng cách sử dụng các pha động thay thế.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Máy sắc kí lỏng, có thể duy trì được dòng ổn định của pha động với bộ lấy mẫu tự động. Thể tích bơm từ 10 μl đến 200 μl (xem 8.1); tốc độ dòng pha động từ 1 ml/min đến 1,3 ml/min.

...

...

...

5.3  Cột sắc kí

Cột pha đảo C18 hoặc C8, đáp ứng yêu cầu nêu trong 8.1. Sử dụng cột bảo vệ. Ví dụ: Spherisorb ODS22) (dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm, cỡ hạt 5 μm), GL Science's Inertsil ODS2, 5 μm, 25 cm và Macherey-Nagel’s Nucleosil 120A, 5 μm, 25 cm là các loại cột phù hợp.

5.4  Hệ thống bơm thuốc thử sau cột, có thể duy trì dòng ổn định của thuốc thử từ 0,5 ml/min đến 1.5 ml/min. Có thể cần làm kín bơm bằng Teflon. Áp lực tối đa > 14 MPa (2000 psi) là thích hợp.

5.5  Vòng phản ứng, ống Teflon có đường kính ngoài 1,5 mm, đường kính trong 0,5 mm x 3048 mm, sử dụng cho hệ sau cột.

5.6  Ống trộn chữ T

Ống chữ T có đường kính 1,5 mm, thể tích chết bằng 0 để chất phân tích qua cột được trộn đều với thuốc thử vào vòng phản ứng trước khi vào detector.

5.7  Xyranh lọc mẫu, có thể dùng xyranh Nylon 66 có đầu lọc (cỡ lỗ 0,2 μm).

5.8  Máy ly tâm, có thể ly tâm các ống 50 ml ở lực ly tâm 1200g.

6  Lấy mẫu

...

...

...

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thúc ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.

7  Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498).

8  Cách tiến hành

8.1 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống

CHÚ THÍCH: Nếu thực hiện phép xác định bằng thủ công thì các thông số sử dụng về độ phân giải và tính độ nghiêng pic cần được đo từ sắc kí đồ được ghi ở tốc độ nhanh (khoảng 5 cm/min) và độ nhạy được điều chỉnh để cho các pic bằng hoặc lớn hơn 80% trên toàn thang đo.

8.1.1  Độ phân giải của hệ thống

Chuẩn bị chất chuẩn để phân giải hệ thống như chất chuẩn làm việc không bao gồm sulfathiazol ở cùng nồng độ như SMR. Dung dịch này dùng kiểm tra chất lượng và có thể bền trong vài tháng nếu được bảo quản ở nơi tối. Khi bắt đầu và cuối mỗi dãy phân tích, cần kiểm tra độ phân giải của sulfonamid. Thứ tự rửa giải là STZ, SMR, SMT (xem Hình A.1). Hệ thống (máy sắc kí lỏng, cột và detector) cần cho phép tách các pic STZ, SMR và SMT ra khỏi nhau và ra khỏi các chất được chiết cùng. Cặp pic SMR-SMT phải có độ phân giải đường nền tốt và các pic không có đuôi kéo dài. Nếu STZ (k’ ≥ 1) có mặt trong mẫu SMT như chất nhiễm bẩn thì phải tách STZ ra khỏi SMR để đo.

8.1.2  Độ chụm của thể tích bơm

...

...

...

8.1.3  Độ tuyến tính của hệ thống

Chuẩn bị đường chuẩn bốn điểm trên khắp dải nồng độ SMT trong khoảng từ 1 μg/ml đến 6 μg/ml (xem Bảng 1). Sử dụng cùng một nồng độ chất chuẩn nội. Dựng đường chuẩn của tín hiệu pic chất phân tích với chất chuẩn nội so với nồng độ chát phân tích. Đường chuẩn phải tuyến tính và đi qua gốc tọa độ.

8.1.4  Độ nhạy của hệ thống

Khi độ nhạy của detector được thiết lập để tạo ra chiều cao pic của dung dịch chuẩn làm việc SMT từ 50% đến 80% trên toàn thang đo, thì chiều cao pic SMT của dung dịch chuẩn làm việc có độ pha loãng 1/10 phải bằng hoặc lớn hơn bốn lần độ nhiễu đường nền.

8.2  Chiết

Cân từ 4,75 g đến 5,25 g mẫu thử đã nghiền và trộn kỹ (W_u), chính xác đến 0,001 g, chuyển sang bình nón 250 ml. Mẫu thức ăn chăn nuôi chứa SMT thường được nghiền nhỏ để thu được độ lặp lại tốt. Nghiền khoảng 5 g mẫu cho lọt qua sàng cỡ lỗ 0,75 mm, sau đó nghiền lần hai để mẫu lọt qua sàng cỡ lỗ 0,5 mm. Kiểm tra quá trình nghiền và trộn để thu được độ chụm thích hợp.

Thêm khoảng 100 ml dung môi chiết (4.11), sau đó thêm một lượng dung dịch thêm chuẩn nội (xem Bảng 2 và 4.13.2). Đậy bình bằng nắp polyetylen (có thể để qua đêm). Thể tích dung môi chiết không cần thiết phải chính xác 100 ml vì phép tính dựa trên lượng chất chuẩn nội được bổ sung; thứ tự bổ sung dung môi chiết và dung dịch chuẩn nội rất quan trọng.

Bàng 2 - Dung dịch thêm chất chuẩn nội/độ pha loãng của dịch chiết

Hàm lượng SMT công bố trên nhãn mg/kg

...

...

...

Thể tích dung dịch chuẩn nội, ml

Dịch chiết pha loãng tiếp theo

Thể tích dung dịch pha loãng của mẫu thử, D_u^b, ml

50 đến 160

A (4.13.2.1)

5,00

Không

100

170 đến 300

...

...

...

5,00

25/50

200

310 đến 600

C (4.13.2.3)

5,00

25/100

400

1100

...

...

...

5,00

10/100

1000

2200

Gốc (4.13.1)

10,00

10/200

2000

^a Xem 4.13.

...

...

...

Lắc 1 h (lắc bằng tay và xả áp trước khi lắc bằng máy). Dùng băng dính để giữ nắp.

Để cho các hạt to lắng xuống và rót dịch chiết sang ống ly tâm 50 ml. Có thể giữ qua đêm ở 4 °C (để làm trong) hoặc ở nhiệt độ phòng.

Dịch chiết được làm trong nhanh hơn nếu trước đó được làm lạnh trong bể nước đá từ 30 min đến 60 min. Ly tâm 5 min ở 2000 r/min (khoảng 1200g). Tiếp tục pha loãng dịch chiết có chứa hàm lượng chất phân tích cao hơn so với dịch pha loãng (theo Bảng 2). Lọc một phần qua bộ lọc (5.7) và bơm.

8.3  Chạy sắc kí

8.3.1  Cấu hình LC-PCD

8.3.2 Điều kiện sắc kí

- Cột (5.3);

- Pha động (4.17);

...

...

...

- Thể tích bơm: 10 μl;

- Dung dịch chuẩn làm việc đậm đặc (4.15), nồng độ SMT (C_s) khoảng 5,5 pg/ml;

- Bước sóng detector: 450 nm.

Ổn định cột: cột được bảo quản trong dung môi hữu cơ (axetonitril hoặc metanol), bơm axetonitril trong vài phút, sau đó bằng axetonitril 17% trong axit axetic 2%.

Cần có các điều kiện phù hợp để đáp ứng phép thử sự phù hợp của hệ thống.

8.3.3  Khởi động hệ thống LC-PCD

Trong khi bơm pha động, đưa hệ thống sau cột vào vận hành. Để cho hệ thống cân bằng cho đến khi thu được đường nền ổn định (từ 10 min đến 30 min).

Tốc độ dòng tối ưu là từ 1 ml/min đến 1,5 ml/min đối với pha động, 0,5 ml/min đến 1 ml/min đối với thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột, còn tốc độ dòng pha động là 1,1 ml/min và tốc độ dòng của thuốc thử khoảng 0,7 ml/min là đạt yêu cầu. Cần chỉnh để có được đường nền và độ đáp ứng của chất phân tích tối ưu.

Nguyên nhân gây nhiễu đường nền có thể là:

...

...

...

- giảm xung của bơm LC không đáp ứng yêu cầu;

- thời gian đáp ứng của detector được cài đặt không đúng;

- van bơm bị rò rỉ;

- đèn của detector không ổn định (đặc biệt là nếu sử dụng đèn hydro);

- có mặt bọt khí trong cuvet dòng chảy của detector;

- vòng phản ứng đã cũ;

- tốc độ dòng của pha động và thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột được chỉnh chưa đúng (với pha động khoảng 1,3 ml/min, tăng tốc độ dòng thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột trong khoảng từ 0,5 ml/min đến 0,75 ml/min để hiệu chỉnh độ nhiễu đường nền).

8.4  Xác định

- Bơm dung dịch chuẩn phân giải hệ thống (xem 8.1.1) và chỉnh độ nhạy/thể tích bơm để có chiều cao pic từ 50% đến 80% trên toàn thang đo. Ghi lại hình dạng pic và độ phân giải đạt yêu cầu.

...

...

...

- Tiến hành bơm dung dịch chuẩn làm việc từ hai lần trở lên để đảm bảo tín hiệu pic (độ lệch chuẩn tương đối của tín hiệu pic < 2%).

- Bơm các dung dịch chuẩn làm việc rồi bơm tiếp các dung dịch thử nghiệm. Cứ hai lần bơm mẫu lại bơm dung dịch chuẩn làm việc. Trong hệ thống ổn định, có thể bơm nhiều dung dịch thử giữa các lần bơm dung dịch chuẩn.

- Nghiên cứu sắc kí đồ để xác định kết quả đo pic bằng điện tử (độ chụm, pic phân tích, đường nền), nếu không thì xác định chiều cao pic theo phương pháp thủ công.

- Tính tỷ lệ tín hiệu pic SMT/SMR. Nếu các tỷ lệ tín hiệu của dung dịch chuẩn làm việc chạy ngẫu nhiên thì sử dụng giá trị trung bình để tính kết quả, nếu không phải ngẫu nhiên thì gộp các tỷ số của dung dịch chuẩn làm việc của từng giai đoạn lấy trung bình để tính kết quả.

8.5  Làm sạch cột LC sau khi phân tích

Tháo cột ra khỏi bộ trộn chữ T (5.6), cài đặt chương trình từ pha động sang 100% nước và để từ 20 ml đến 30 ml nước chảy qua, sau đó cài đặt để 100% pha dung môi hữu cơ chảy qua (khoảng 10 min). Cho khoảng 20 ml đến 30 ml pha hữu cơ đi qua cột trước khi dừng máy LC và bảo quản cột trong pha hữu cơ.

Nếu cột có độ phân giải và hình dạng pic bị suy giảm thì có thể sử dụng dung dịch axit oxalic 0,2 M (4.5) để làm mới cột. Cài đặt chương trình để bảo quản cột: bơm từ 20 ml đến 30 ml nước; bơm 20 ml đến 30 ml axit oxalic 0,2 M, rồi bơm 20 ml đến 30 ml nước và bảo quản trong pha hữu cơ.

8.6  Làm sạch hệ thống sau cột (kể cả vòng phản ứng và detector)

Sau khi tháo cột LC ra khỏi bộ trộn chữ T, nối đầu ra của bơm LC vào bộ chữ T và bơm metanol (khoảng 10 min) tiếp theo bơm isopropanol (từ 10 min đến 15 min) qua hệ thống.

...

...

...

9  Tính kết quả

Hàm lượng sulfamethazin có trong mẫu, X₁, tính bằng phần trăm (%) khối lượng theo công thức sau:

X₁ =

R_u x W_s x D_u x P_s x 100

R_s x W_u x D_s

Hàm lượng sulfamethazin có trong mẫu, X₂, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg) theo công thức sau:

X₂ =

R_u x W_s x D_u x P_s x 10^6

R_s x W_u x D_s

...

...

...

R_s là tỷ lệ tín hiệu của thiết bị đối với chất chuẩn;

R_u là tỷ lệ tín hiệu của thiết bị đối với mẫu thử;

W_s là khối lượng chất chuẩn (4.14.1), tính bằng gam (g);

W_u là khối lượng mẫu thử (8.2), tính bằng gam (g);

D_s là thể tích dung dịch chuẩn pha loãng (tổng số), tính bằng mililit (ml);

D_u là thể tích dung dịch mẫu thử pha loãng (tổng số), tính bằng mililit (ml);

P_s là độ tinh khiết của chất chuẩn.

Tính thể tích dung dịch pha loãng:

Thể tích dung dịch pha loãng của chất chuẩn (D_s), từ W_s (g) chất chuẩn được hòa tan trong dung môi, pha loãng đến 100 ml và tiếp tục được pha loãng theo tỷ lệ 10/200 và 10/100, được tính như sau:

...

...

...

100 x 200 x 100

= 20 000 ml

10 x 10

Thể tích dung dịch pha loãng của mẫu thử: D_u = 100 ml hoặc được lấy theo Bảng 2.

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

...

...

...

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Sắc kí đồ chuẩn phân giải hệ thống

Hình A.1 - Sắc kí đồ chuẩn phân giải hệ thống của sulfathiazol (STZ), chất chuẩn nội sulfamerazin (SMR) và sulfamethazin (SMT), sử dụng các điều kiện trong 8.1

Phụ lục B

...

...

...

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Bảng B.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng về xác định sulfamethazin trong thức ăn cho lợn và thức ăn cho trâu, bò bằng sắc kí lỏng có tạo dẫn xuất sau cột

Thức ăn cho lợn 1

Thức ăn cho lợn 2

Thức ăn cho trâu, bò 1

Thức ăn cho lợn 3

Thức ăn cho lợn 4

Thức ăn cho trâu, bò 2

...

...

...

10 (1)^a

10

10

10

10

10 (1)

SMT trung bình ghi trên nhãn,%

0,22 (0,19)

...

...

...

(0,11)

0,0154

(0,014)

0,011

(0,010)

0,011

(0,010)

0,0077

(0,0068)

...

...

...

0,00052

0,0036

0,00043

0,00049

0,00015

0,00014

Giới hạn lặp lại, r (2,8 x s_r)

0,0015

0,0099

...

...

...

0,0014

0,00041

0,00039

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r

0,28

3,1

3,1

4,7

1,4

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R

0,0023

0,0036

0,00044

0,00049

0,00037

0,00032

Giới hạn tái lập, R(2,8 x s_R)

0,0065

...

...

...

0,0012

0,0014

0,0010

0,00093

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R

1,3

3,2

3.1

4,7

...

...

...

4,9

Chỉ số HorRat

0,25

0,57

0,41

0,59

0,45

0,58

^a Số trong ngoặc đơn là ngoại lệ.

...

...

...

1) Sigma D 2004 là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.

2) Cột pha đảo Spherisorb ODS2 là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này