Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11203:2016 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng oxytetracyclin

• Số hiệu: TCVN11203:2016
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2016

Dung dịch chuẩn trung gian		Dung tích bình định mức, ml	Dung dịch chuẩn LC
Dung dịch sử dụng	Thể tích, ml		Nồng độ, µg/ml	Dung dịch sử dụng
4.16	1,0	50	0,20	Dung dịch chuẩn LC 1
4.16	3,0	50	0,60	Dung dịch chuẩn LC 2
4.16	3,0	25	1,2	Dung dịch chuẩn LC 3
4.16	6,0	25	2,4	Dung dịch chuẩn LC 4
4.16	10,0	25	4,0	Dung dịch chuẩn LC 5
4.15	5,0	100	5,0	Dung dịch chuẩn LC 6

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Bình nón, dung tích 250 ml.

5.2  Pipet, ống đong chia độ, bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml

5.3  Chai và ống ly tâm bằng polyproetylen, dung tích 50 ml và 250 ml.

5.4  Bộ lọc dung dịch thử bằng nylon, đường kính 25 mm, cỡ lỗ 0,45 µm.

5.5  Bộ lọc bằng thủy tinh, để lọc dung môi và bộ lọc bằng nylon đường kính 47 mm, cỡ lỗ 0,45 µm hoặc loại tương đương.

5.6  Máy lắc.

5.7  Cân phân tích, có thể đọc đến 0,0001 g.

...

...

...

- Bơm có độ xung thấp hoặc bơm được trang bị bộ giảm xung, duy trì tốc độ dòng từ 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min;

- Bộ lấy mẫu tự động, có vòng bơm để bơm các thể tích 20 µl;

- Cột phân tích C18, kích thước 4,6 mm x 150 mm, cỡ hạt 5 µm hoặc loại tương đương có cột bảo vệ C18.

- Detector huỳnh quang, làm việc ở bước sóng kích thích 390 nm và bước sóng phát xạ 512 nm;

- Hệ thống tích phân hoặc hệ thống phân tích dữ liệu LC;

- Bộ khử khí (tùy chọn).

5.9  Máy ly tâm, có thể vận hành ở lực ly tâm 1230g.

6  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

...

...

...

7  Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498).

Mẫu thức ăn khô được nghiền cho đến khi lọt hết qua sàng cỡ lỗ 1 mm, không làm nóng mẫu.

8  Cách tiến hành

8.1  Chiết mẫu

Cân một lượng mẫu thử thích hợp, lấy đến hai chữ số thập phân, cho vào ống ly tâm 250 ml (5.3). Cân 20 g phần mẫu thử đối với các mẫu bị nhiễm OTC ở mức nhỏ hơn 10 mg/kg, cân 10 g mẫu thử đối với mẫu chứa hàm lượng OTC từ 10 mg/kg đến 1 000 mg/kg và cân 2 g mẫu thử đối với mẫu chứa hàm lượng OTC trên 1 000 mg/kg.

Đối với các mẫu có thuốc, chuẩn bị mẫu kiểm soát (50 mg/kg) bằng cách bổ sung 5 ml dung dịch chuẩn trung gian A [100 µg/ml (4.15)] vào 10 g mẫu trắng, cần phân tích mẫu kiểm soát với mỗi dãy mẫu bổ sung thuốc khi có thể. Đối với các mẫu bị nhiễm, chuẩn bị mẫu kiểm soát bằng cách bổ sung 4 ml dung dịch chuẩn trung gian B [10 µg/ml] (4.16) vào 20 g mẫu trắng. Mẫu trắng cần được phân tích mỗi khi bắt đầu phương pháp để kiểm tra các chất gây nhiễu.

Bổ sung 100 ml dung môi chiết (3.10), lắc trên máy lắc (5.6) trong 45 min đến 60 min. Ly tâm 5 min ở lực ly tâm 1230g hoặc cho đến khi phần phía trên trong suốt. Pha loãng phần dịch chiết bằng nước (4.4) và/hoặc dung môi chiết sao cho nồng độ OTC trong dung dịch thử xấp xỉ như trong dung dịch chuẩn LC và dung dịch pha loãng cuối cùng của dịch chiết chứa ít nhất 50 % nước.

CHÚ THÍCH: Các dung dịch thử pha loãng cuối cùng trong một mẻ cần chứa cùng một tỷ lệ nước và phải phù hợp với các dung dịch hiệu chuẩn. Khi tỷ lệ nước tăng thì hình dạng pic được cải thiện.

...

...

...

Đối với mẫu có hàm lượng OTC nhỏ hơn hoặc bằng 110 mg/kg thì pha loãng 5 ml dịch chiết bằng nước (4.4) đến 10 ml. So sánh với dung dịch chuẩn làm việc LC thích hợp có nồng độ gần giống nồng độ dịch pha loãng nhất. Đối với các mẫu có hàm lượng OTC lớn hơn 110 mg/kg thì xác định độ pha loãng, DF, theo công thức sau:

Trong đó:

C₁  là hàm lượng chất phân tích có trong mẫu, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg);

C₂  là nồng độ chất chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);

w  là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V  là thể tích dịch chiết, tính bằng mililit (ml).

Sử dụng giá trị 4 µg/ml làm nồng độ chuẩn, nồng độ dung dịch thử cuối cùng không lớn hơn 5 µg/ml vì nếu không sẽ nằm ngoài dải đường chuẩn (đối với các mẫu chứa hàm lượng vượt quá lượng dự kiến), tuy nhiên, trong phép phân tích cần sử dụng dung dịch chuẩn LC phù hợp nhất (4,0 µg/ml hoặc 5,0 µg/ml).

VÍ DỤ: Nếu C₁ = 440 mg/kg, C₂ = 4 µg/ml, w = 10 g và V= 100 ml thì độ pha loãng là:

...

...

...

Chọn thể tích cuối cùng thích hợp, ví dụ: 50 ml (dung tích bình định mức) thì thể tích dịch chiết, V₁, tính theo mililit (ml) bằng:

  (có thể làm tròn đến 5)

Cho 5,0 ml dịch chiết vào bình định mức 50 ml (5.2), thêm 20 ml dung môi chiết (4.10) và thêm nước (4.4) đến vạch. Hệ số pha loãng (DF) = 50/5. Lọc các dung dịch thử qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm (5.4).

Tốt nhất là chuẩn bị dịch chiết và phân tích trong ngày, nếu không, dịch chiết và dung dịch chuẩn làm việc cần được bảo quản trong tủ tạnh để phân tích vào ngày hôm sau.

8.2  Phép xác định LC

8.2.1  Điều kiện LC như sau:

- Tốc độ dòng: 1,5ml/min;

- Thể tích bơm: 20 µl;

- Thông số detector: bước sóng kích thích 390 nm và bước sóng phát xạ 512 nm;

...

...

...

Bảng 2 - Điều kiện gradient pha động

Thời gian, min

Metanol (4.2), phần thể tích

Dung dịch gradient pha động (4.9), phần thể tích

0

15

85

1

15

...

...

...

9

35

65

16

35

65

16,1

15

85

...

...

...

15

85

8.2.2  Yêu cầu về sự phù hợp của hệ thống như sau:

- Thời gian lưu: từ 6 min đến 8 min;

- Độ tuyến tính của đường chuẩn cần có hệ số tương quan ≥ 0,999 với giới hạn tin cậy 95 % của giao điểm trục y bao gồm điểm zero và sai số chuẩn nhỏ hơn 0,1;

- Hệ số kéo đuôi, T_f (hệ số kéo đuôi USP hoặc hệ số đối xứng EP) phải nhỏ hơn hoặc bằng 1,5.

Tính T_f theo công thức sau:

Trong đó:

...

...

...

t₁  là thời gian tương ứng với điểm 5 % phía trước pic cực đại (điểm 5 % là vị trí mà đáp ứng của một bên pic đạt đến chiều cao bằng 5 % so với chiều cao pic cực đại);

t₂  là thời gian tương ứng với điểm 5 % phía sau pic cực đại.

CHÚ THÍCH: Hệ thống dữ liệu sắc kí đồ sẽ tính như trên cùng với các thông số pic khác.

Ổn định cột bằng pha động [hỗn hợp metanol (4.2) và dung dịch gradient pha động (4.9) với tỉ lệ thể tích 15 : 85] trong 60 min ở tốc độ 1,5 ml/min trước khi bơm dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Kiểm tra xác nhận các thông số thích hợp của hệ thống. Điều chỉnh các điều kiện gradient pha động để đạt được các thông số phù hợp của hệ thống, nếu cần. Nếu gặp phải các vấn đề về áp suất hoặc kết tủa thì có thể giảm lượng EDTA trong dung dịch pha động, cần xem xét về khả năng mất tín hiệu và có thể làm cho pic OTC rộng ra. Tốc độ dòng cũng có thể phải giảm để giảm thiểu áp suất cao.

Bơm 20 µl mỗi dung dịch thử. Pha loãng nếu cần, để có diện tích pic OTC tương tự diện tích pic của chất chuẩn. Bơm 20 µl dung dịch chuẩn LC sau 3 hoặc 4 lần bơm dung dịch mẫu thử. Để sử dụng hiệu chuẩn một điểm, dựa vào diện tích pic trung bình của các chất chuẩn trong từng mẫu để tính nồng độ của mẫu thử. Đối với các mẫu dạng vết, sử dụng các dung dịch chuẩn LC 1, dung dịch chuẩn LC 2 hoặc dung dịch chuẩn LC 3 (4.17).

Cách khác, có thể sử dụng đường chuẩn 5 điểm để định lượng các dung dịch mẫu thử nếu không có độ lệch trong quá trình vận hành. Bơm 5 dung dịch chuẩn LC (4.17) thích hợp khi bắt đầu và cuối mỗi dãy mẫu, tính trung bình các diện tích pic của từng dung dịch chuẩn và dựng đường chuẩn. Từng dung dịch chuẩn (4,0 µg/ml hoặc 5,0 µg/ml) cần bơm định kỳ để kiểm tra độ trôi.

Các ví dụ về sắc kí đồ đối với dung dịch chuẩn hiệu chuẩn OTC 2,4 µg/ml nêu trong Hình A.1; sắc kí đồ của mẫu thức ăn cho gà giò chứa hàm lượng OTC 49 mg/kg nêu trong Hình A.2; sắc kí đồ của mẫu thức ăn cho trâu bò chứa 430 mg/kg nêu trong Hình A.3 và sắc kí đồ của chất thay thế sữa chứa 310 mg/kg nêu trong Hình A.4.

Khi kết thúc một dãy mẫu thử, rửa hệ thống LC bằng hỗn hợp metanol trong nước (tỉ lệ thể tích 15 : 85) ít nhất 1 h rồi bằng metanol 70 % trong 30 min, sau đó tắt hệ thống. Đối với bơm có khóa thổi ngược, rửa pittong bằng nước sau mỗi dãy mẫu.

CHÚ THÍCH: Pic của epi-OTC tách tốt trước pic OTC, pic ở khoảng thời gian lưu 4,8 min có thể có mặt của epi-OTC.

...

...

...

Kiểm tra độ tuyến tính của hệ thống, sử dụng ít nhất 5 dung dịch chuẩn LC (4.17). Dựng đường chuẩn diện tích pic theo nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml). Độ tuyến tính của đường chuẩn cần có hệ số tương quan ≥ 0,999 với giới hạn tin cậy 95 % của giao điểm trục y bao gồm điểm 0 và sai số chuẩn nhỏ hơn 0,1: hệ số kéo đuôi T_f (hệ số kéo đuôi USP hoặc hệ số đối xứng EP) phải nhỏ hơn hoặc bằng 1,5.

9  Tính và biểu thị kết quả

9.1  Tính kết quả

Hàm lượng OTC.HCl trong mẫu thử dạng rắn, X₁, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg) theo công thức sau:

Hàm lượng OTC trong mẫu thử dạng lỏng, X₂, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml) theo công thức sau:

Trong đó:

A  là diện tích pic của chất phân tích;

...

...

...

C_s  là nồng độ của chất chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);

w  là khối lượng mẫu thử dạng rắn, tính bằng gam (g);

V  là thể tích của dung dịch mẫu thử dạng lỏng, tính bằng mililit (ml);

1,08  là hệ số chuyển đổi OTC.HCl sang OTC;

V_E  là thể tích của dung môi chiết dùng cho các mẫu thêm chuẩn, tính bằng mililit (trong trường hợp này V_E = 100 ml);

DF  là hệ số pha loãng.

VÍ DỤ: Mẫu dạng rắn có hàm lượng OTC 220 mg/kg cần được pha loãng bốn lần để phù hợp với dung dịch chuẩn làm việc. Diện tích pic của mẫu = 19 626; diện tích pic của dung dịch chuẩn = 21 598; nồng độ của dung dịch chuẩn = 5,00 µg/ml; tổng thể tích = 100 ml; DF = 25/6, khối lượng phần mẫu thử = 10,01 g thì hàm lượng OTC.HCl tính được như sau:

Các phép tính có thể được thực hiện sử dụng giá trị trung bình của các lần bơm dung dịch chuẩn riêng rẽ như trên hoặc sử dụng đường hồi quy tuyến tính.

...

...

...

Báo cáo kết quả đến ba chữ số sau dấu phẩy đối với hàm lượng OTC.HCl bằng hoặc lớn hơn 10 mg/kg và đến hai chữ số có nghĩa đối với hàm lượng OTC.HCl nhỏ hơn 10 mg/kg.

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

...

...

...

(Tham khảo)

Các ví dụ về sắc kí đồ đặc trưng

Hình A.1 - Ví dụ về sắc kí đồ của dung dịch chuẩn hiệu chuẩn OTC 2,4 µg/ml

Hình A.2 - Ví dụ về sắc kí đồ của mẫu thức ăn cho gà giò chứa hàm lượng OTC 49 mg/kg

Hình A.3 - Ví dụ về sắc kí đồ của mẫu thức ăn cho trâu bò chứa hàm lượng OTC 430 mg/kg

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Bảng B.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng về xác định oxytetracyclin trong thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản

Thức ăn cho cá hồi

Thức ăn cho bê AAFCO-200425

Thức ăn cho cá da trơn AAFCO

...

...

...

Thức ăn cho lợn

Thức ăn cho gà thịt AAFCO-200331

Thức ăn cho lợn AAFCO

Hàm lượng trung bình, mg/kg

11 600

293

1070

215

4,82

...

...

...

46,2

Số lượng phòng thử nghiệm

10

11

10

9

8

10

9

...

...

...

1

0

1

2

3

1

2

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r, mg/kg

181

...

...

...

42,5

7,98

0,44

1,31

2,3

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r, %

1,56

3,08

3,96

...

...

...

9,2

9,21

4,98

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R, mg/kg

570

13,6

42,5

8,31

0,59

...

...

...

3,3

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

4,92

4,65

3,96

3,87

12,3

12,9

7,16

...

...

...

1,26

0,68

0,71

0,54

0,97

1,2

0,8

Hàm lượng công bố trên nhãn, mg/kg

11 000

...

...

...

1250

220

-

-

55

Độ thu hồi, %

105,5

66,6

85,6

...

...

...

-

-

84,0