Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10781:2015 về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi gây bệnh - O157, O111

• Số hiệu: TCVN10781:2015
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2015

Gen đích	Giới hạn phát hiện Số lần sao chép/phản ứng	Hiệu suất %
stx1	5	94,7
stx2	5	94
rfbE	1	94,2
wbdl	5	94
wzx	5	97,7
ihp1	5	99,6

Một nghiên cứu khác (Tài liệu tham khảo [17]) đã xem xét hiệu năng của các phương pháp tiếp cận real-time PCR trong quá trình sàng lọc hỗn hợp chủng cấy STEC thuộc các nhóm huyết thanh trong phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn này, với chủng phòng thí nghiệm K-12 (C600). Các kết quả được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Phát hiện số lượng STEC thấp trong môi trường hỗn hợp (phù hợp với Tài liệu tham khảo [15])

Kiểu huyết thanh STEC

CFU/ml

Giá trị Ct

stx1/stx2

eae

rfbE (O157)

wbd1 (O111)

...

...

...

ihp1 (O145)

fliC (H7)

wzx

(O26)

O26:H11

2 đến 3

28 đến 31

31 đến 32

—

...

...

...

—

—

—

31 đến 33

...

...

...

10 đến 20

25 đến 27

28 đến 29

—

—

—

...

...

...

—

29

O103:H2

2 đến 3

29 đến 30

31 đến 32

—

—

32 đến 33

...

...

...

—

—

...

...

...

10 đến 20

26 đến 27

29 đến 30

—

—

29 đến 31

—

—

...

...

...

O111:[H8]

2 đến 3

26 đến 27

30 đến 31

—

30 đến 31

—

—

—

...

...

...

...

...

...

24 đến 25

29 đến 30

_

27 đến 28

—

—

—

—

O145:[H28]

...

...

...

32 đến 33

31 đến 32

—

_

31 đến 34

—

—

...

...

...

10 đến 20

30 đến 32

...

...

...

—

—

—

30

—

—

O157:H7

2 đến 3

29 đến 30

...

...

...

31 đến 32

—

—

—

33 đến 38

—

...

...

...

.

10 đến 20

26 đến 28

26 đến 29

29 đến 31

...

...

...

—

—

31 đến 33

—

11.3. Tiêu chuẩn này được sử dụng trong nghiên cứu cộng tác lần thứ ba do Phòng thí nghiệm chuẩn của Liên minh Châu Âu (EURL) tổ chức năm 2009 về E. coli bao gồm cả STEC. Nghiên cứu này bao gồm việc kiểm tra tập hợp năm mẫu gạc bông mô phỏng (bọt biển đã được làm ẩm) có chứa các vi sinh vật cần nghiên cứu, bao gồm cả STEC O157 và STEC O26, cùng với hệ vi sinh vật nền (Bảng 3). Chọn các mẫu gạc bông mô phỏng làm nền mẫu để phân tích trong các phép thử thành thạo theo nguyên tắc có trong các hướng dẫn của Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu cho các kế hoạch thử nghiệm tiếp theo đối với STEC [TCVN 7686 (ISO 16654)]^[19].

Có 14 phòng thử nghiệm đạt chuẩn quốc gia (NRL) về E. coli tham gia nghiên cứu. Việc đánh giá hiệu quả của phương pháp đối với STEC không phải O157 (STEC O26) cho các giá trị như sau:

Độ nhạy (Se): 100 % [95 % trong khoảng tin cậy (Cl) từ 96,97 % đến 100 %];

Độ nhạy (Sp): 99,62 % [95 % trong khoảng tin cậy (Cl) từ 97,5 % đến 100 %].

Các kết quả phân tích của mỗi NRL được nêu trong Bảng 4.

...

...

...

Báo cáo các kết quả phân tích đầy đủ của nghiên cứu cộng tác EU-RL-STEC lần thứ 3 được công khai rộng rãi.^[9]

Bảng 3 - Thành phần mẫu trong nghiên cứu cộng tác EURL-STEC lần thứ 3

Các giá trị tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mililít

Mẫu/chất nhiễm bẩn

Mẫu A

Mẫu B

Mẫu C

Mẫu D

Mẫu E

...

...

...

stx1, stx2, eae

2

2 x 10^3

20

0

0

STEC O26

stx1, eae

0

...

...

...

4 x 10^3

40

0

E. coli

10^2

10^2

10^2

10^2

10^2

...

...

...

2 x 10^2

2 x 10^2

2 x 10^2

2 x 10^2

2 x 10^2

S. faecalis

5 x 10^2

5 x 10^2

5 x 10^2

...

...

...

5 x 10^2

Độ không đảm bảo đo mở rộng, U, có liên quan với mức chủng cấy là 0,22 log₁₀(CFU/ml) đối với các chủng E. coli xác định được theo TCVN 9332:2012 (ISO/TS 19036:2006).^[20]

Bảng 4 - Phát hiện các gen độc và các gen có liên quan đến nhóm huyết thanh trong các mẫu được tăng sinh bằng phương pháp real-time PCR

(phần sàng lọc của phương pháp; nghiên cứu cộng tác EURL-STEC lần thứ ba)

Gen đích

Mẫu

Phòng thử nghiệm tham gia

L₁

L₂

...

...

...

L₇

L₈

L₉

L₁₂

L₁₄

L₁₅

L₁₇

L₂₁

L₂₂

...

...

...

L₃₀

stx^a

A

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

+

B

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

C

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

D

+

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

E

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

eae

A

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

C

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

D

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

E

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

+

-

...

...

...

-

-

-

O26

A

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

B

+

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

C

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

D

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

+

E

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

O111

A

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

B

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

C

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

D

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

O103

A

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

B

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

C

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

D

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

E

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

O145

A

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

B

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

D

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

E

-

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

-

-

-

-

-

-

^a Bảng này bao gồm cả stx1 hoặc stx2.

Bảng 5 - Phân lập STEC O26 từ các mẫu được tăng sinh dương tính với RT PCR

...

...

...

Phép thử

Mẫu

Giá trị đúng

Phòng thử nghiệm tham gia

L₁

L₂

L₄

L₇

L₈

...

...

...

L₁₂

L₁₄

L₁₅

L₁₇

L₂₁

L₂₂

L₂₅

L₃₀

Phân lập O26

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

C

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

D

+

+

+

+

+

+

+

...

...

...

+

+

+

+

+

+

+

PHỤ LỤC A

...

...

...

Sơ đồ quy trình sàng lọc

Hình A.1 - Sơ đồ quy trình sàng lọc

PHỤ LỤC B

(Quy định)

Sơ đồ quy trình phân lập và khẳng định3)

Nếu mẫu là dương tính đối với một trong các gen có liên quan đến nhóm huyết thanh nêu trong phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn này thì có thể tăng sinh một nhóm huyết thanh đặc hiệu (SSE) để tạo thuận tiện cho quá trình phân lập.

...

...

...

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

Nhận biết Escherichia coli sinh độc tố Shiga (STEC) bằng phương pháp khuếch đại PCR đa mồi các gen độc và phát hiện các sản phẩm của phản ứng PCR bằng điện di trên gel agarose

C.1. Yêu cầu chung

STEC là các chủng Escherichia coli có chứa thể thực khuẩn phân giải mang các gen mã hóa sinh độc tố Shiga (Tài liệu tham khảo [12]). Thực hiện phương pháp quy định trong Phụ lục này để phát hiện sự có mặt các gen mã hóa Stx trong chủng cấy E. coli bằng PCR đa mồi, để nhận biết chúng là STEC. Việc xác định sự có mặt các gen eae mã hóa intimin cũng bao gồm trong phụ lục này vì nó liên quan đến các chủng STEC gây bệnh ở người.

Sử dụng các cặp mồi stx1Flstx1R và stx2Flstx2R (Tài liệu tham khảo [11]), có thể phát hiện được các gen stx1 và stx2, tương ứng. Gen stx2 xác nhận tất cả các biến thể của stx2, trừ stx2f. Tuy nhiên, biến thể này không được coi là ảnh hưởng được đến sức khỏe cộng đồng, mà phần lớn quan sát được trong STEC được phân lập từ các loài chim (ISO/TS 19036[20]). Các mồi được sử dụng để phát hiện eae (Tài liệu viện dẫn [11]) xác nhận tất cả các biến thể đa hình ghi được của gen này.

CẢNH BÁO - Phương pháp nêu trong phụ lục này sử dụng các dịch cấy vi khuẩn thuần khiết chỉ để khẳng định các chủng phân lập được.

C.2. Chữ viết tắt

...

...

...

C.3 Cách tiến hành

C.3.1 Nguyên tắc của phương pháp

Phương pháp này dựa trên sự khuếch đại các vùng ADN đặc hiệu bằng PCR từ một khuôn mẫu ADN, với các oligonucleotid khởi động bước đầu phản ứng PCR.

Việc phát hiện các gen stx1, stx2 và eae được thực hiện bằng phản ứng PCR đa mồi sử dụng các mồi đặc hiệu (Bảng C.1). Phương pháp này bao gồm các bước dưới đây:

- chuẩn bị khuôn mẫu;

- chuẩn bị phản ứng PCR;

- xác định các kết quả PCR bằng điện di trên gel agarose.

C.3.2 Chuẩn bị khuôn mẫu

Dịch nuôi cấy được cấy vạch trên môi trường rắn, ví dụ: thạch trypton-đậu tương (TSA), được thực hiện như sau:

...

...

...

- chuẩn bị khuôn mẫu bằng cách tạo huyền phù vi khuẩn trong 100 μl nước milliQ4) đã lọc qua bộ lọc vô trùng cỡ lỗ 0,22 μm và đun sôi trong 10 min.

C.3.3. Chuẩn bị phản ứng PCR

Đối với mỗi mẫu thử, chuẩn bị 50 μl cho phản ứng [chất đệm phản ứng 1×, MgCl₂ 1,2 mmol/l, mỗi deoxynucleotidetriphosphat (dNTP) 0,2 mmol/l, mỗi mồi 50 pmol, 2 đơn vị Taq polymerase và 10 μl khuôn mẫu ADN]. Xác định thể tích thuốc thử theo thể tích cuối của phản ứng. Sử dụng nước milliQ cho các phản ứng PCR.

Trong mỗi phép phân tích PCR, gồm có một kiểm soát dương tính và hai kiểm soát âm tính. Kiểm soát dương tính là một khuôn mẫu ADN thu được từ một chủng E. coli có các gen độc cần thử nghiệm, một kiểm soát âm tính là ADN từ chủng E. coli không gây bệnh (không có các gen độc tiềm ẩn) và một kiểm soát âm tính còn lại là từ khuôn mẫu không có ADN mẫu thử.

Giữ các mẫu phản ứng trong chu trình nhiệt đã được cài đặt theo chương trình nhiệt nêu trong Tài liệu tham khảo [11] (Bảng C.1).

C.3.4. Điện di trên gel agarose

Chuẩn bị 20 g/l gel agarose trong 1× tris/borat/EDTA (TBE) hoặc tris/axetat/EDTA (TAE). Cho vào mỗi giếng gel với 15 μl mỗi loại thuốc thử hỗn hợp PCR với chất nhuộm ở nồng độ cuối 1×. Cho chạy các mẫu chất đệm 1× (TBE hoặc TAE) ở điện áp không đổi (100 V). Sử dụng chất đánh dấu có khối lượng phân tử phù hợp với khối lượng phân tử chính xác cần khuếch đại (xem Bảng C.1).

CẢNH BÁO - Cần lưu ý rằng sự phân bố chính xác dải băng là một điểm rất quan trọng trong việc đánh giá sự có mặt của các gen độc. Cần đảm bảo các dải băng được tạo ra bởi các chủng đối chứng phù hợp chính xác với khối lượng phân tử dự kiến.

Ethidi bromua cần được bổ sung vào gel agarose để hiển thị ADN. Thuốc thử này là chất xen giữa gây đột biến ADN thường được sử dụng làm chất nhuộm màu axit nucleic trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Khi tiếp xúc với ánh sáng UV, thuốc thử phát huỳnh quang có màu đỏ-da cam. Trước khi rót gel agarose vào khuôn gel điện di, nồng độ cuối của ethidi bromua được bổ sung phải là 0,5 μg/ml. Ngoài ra, gel agarose có thể được nhuộm màu sau khi điện di trong dung dịch ethidi bromua 0,5 μg/ml.

...

...

...

C.3.5. Thiết bị, dụng cụ

Chỉ sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

C.3.5.1. Tủ hút vô trùng, loại dùng cho PCR.

C.3.5.2. Pipet vô trùng, dung tích 1 ml.

C.3.5.3. Vòng cấy vô trùng, dùng cho vi khuẩn.

C.3.5.4. Lọ thủy tinh borosilicat, dung tích 500 ml.

C.3.5.5. Xyranh thủy tinh borosilicat, dung tích 500 ml.

C.3.5.6. Xyranh thủy tinh borosilicat, dung tích 1 lít.

C.3.5.7. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 ^oC ± 1 ^oC.

...

...

...

C.3.5.9. Nồi hấp áp lực.

C.3.5.10. Giá đỡ Pipet.

C.3.5.11. Micropipet.

C.3.5.12. Đầu tip micropipet, vô trùng.

C.3.5.13. Ống li tâm nhỏ, dung tích 1,5 ml.

C.3.5.14. Ống PCR, dung tích 0,2 ml hoặc 0,5 ml.

C.3.5.15. Chu trình nhiệt.

C.3.4.16. Máy khuấy từ.

C.3.5.17. Que khuấy từ.

...

...

...

C.3.5.19. Thiết bị điện di.

C.3.5.20. Máy rọi UV.

C.3.5.21. Máy làm đá lạnh.

C.3.5.22. Lò vi sóng.

C.3.6. Thuốc thử và môi trường

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương dương, trừ khi có quy định khác.

C.3.6.1. Đĩa thạch.

C.3.6.2. Dung dịch gốc dNTP.

C.3.6.3. Dung dịch oligonucleotid tổng hợp.

...

...

...

C.3.6.5. Dung dịch đệm chạy điện di.

C.3.6.6. Chất đánh dấu khối lượng phân tử ADN.

C.3.6.7. Chất nhuộm màu.

C.3.6.8. Agarose

C.3.6.9. Dung dịch ethidi bromua hoặc chất nhuộm gel ADN khác.

C.3.7. An toàn và thiết bị bảo vệ

Một số chủng STEC có thể lây nhiễm sang người với liều lượng rất thấp và có thể gây bệnh nghiêm trọng. Các bệnh truyền nhiễm bị mắc từ phòng thử nghiệm phải được báo cáo. Vì vậy thao tác với STEC cần phải có thực hành phòng thử nghiệm tốt và sử dụng các thiết bị bảo vệ. Ethidi bromua là chất gây đột biến gen và là chất độc, vì vậy cần sử dụng các tấm bảo vệ cùng với các thiết bị bảo vệ phù hợp (áo choàng phòng thử nghiệm và găng tay cao su). Ánh sáng UV có thể gây hại cho mắt vì vậy việc sử dụng các màn chắn polymetylmeacrylat và kính bảo hộ là bắt buộc.

C.3.8. Các chủng đối chứng và kiểm soát quá trình

Sử dụng chủng STEC có chứa các gen stx1, stx2 và eae làm chủng kiểm soát dương tính đối với tất cả các gen này. Ví dụ: chủng đối chứng E. coli O157 EDL933 (WDCM 00188) (Tài liệu tham khảo [12][13]).

...

...

...

Việc kiểm soát phương pháp PCR được thực hiện theo quy định trong C.3.2. Mẫu kiểm soát có thể được chuẩn bị trước và được bảo quản trong 10 μl dung dịch chuẩn bị sẵn, mẫu này dùng được trong 8 tháng ở − 20 ^oC.

C.3.9. Diễn giải các kết quả

Các mẫu cho các phân đoạn khuếch đại có kích thước dự kiến (xem C.3.4 và Bảng C.1) được coi là dương tính đối với các gen đích có liên quan.

Trong mỗi phản ứng, bao gồm cả các mẫu kiểm soát dương tính và kiểm soát âm tính, cho các kết quả dương tính và âm tính tương ứng. Nếu các mẫu kiểm soát cho các kết quả không chính xác thì lặp lại toàn bộ quy trình.

Đánh giá, xác nhận sản phẩm khuếch đại bằng trình tự trực tiếp hoặc bằng các phương pháp thích hợp khác có thể là không cần thiết vì phương pháp này dùng để khẳng định các chủng phân lập được và phụ thuộc vào phương pháp real-time PCR đối với các đặc tính tương tự.

Việc xác nhận các sản phẩm khuếch đại (ví dụ: bằng trình tự trực tiếp hoặc bằng cách phân tích endonuclease giới hạn) cần được thực hiện khi thu được các kết quả không rõ ràng.

Bảng C.1 - Các phân đoạn khuếch đại có kích thước dự kiến

Gen đích

Tên mồi^[11]

...

...

...

Cỡ sản phẩm khuếch đại

eae

eaeAF

GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC

384

eaeAR

CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG

stx1

stx1F

...

...

...

180

stx1R

AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC

stx2 (nhóm)

stx2F

GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC

255

stx2R

TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCTG

...

...

...

Phụ lục D

(Tham khảo)

Kiểm soát độ khuếch đại bên trong

Có thể sử dụng ba phép kiểm soát độ khuếch đại bên trong phản ứng real-time PCR:

- TaqMan^®5) là kiểm soát dương tính bên trong ngoại sinh. Bộ kit thuốc thử bao gồm tất cả các thuốc thử cần thiết (mồi, Vic^TM6), mẫu dò, ADN đích IAC và dung dịch ức chế). Cần pha loãng AND đích IAC 10 lần để thu được khoảng 100 bản sao trên một phản ứng PCR. Chiều dài sản phẩm PCR không được công khai với khách hàng.

- Đối với phép tính pUC 19 thông thường dựa vào kiểm soát độ khuếch đại bên trong IAC, xem Tài liệu tham khảo [27]. Nên sử dụng khoảng 100 bản sao ADN đích (pUC 19) trên phản ứng PCR. Cỡ IAC là 119 bp.

- Có thể sử dụng plasmid tái tổ hợp (được gọi là pIAC-STEC) trong thử nghiệm real-time PCR đối với gen stx đặc hiệu7). IAC này có chứa phân đoạn ADN đơn dòng vô tính trong vùng EcoRI của pUC 19 dưới đây:

5’-ATTTTTGTTACTGTGACAGCTGAAGCTTTACGTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAGATGTTGATCTTACATTGAACTGGGGAATT-3’ (các chữ in đậm: các mồi xuôi và mồi ngược của gen stx1/stx2 liên kết trình tự các vị trí liên tiếp; trình tự gạch chân: các vị trí liên kết IAC- mẫu dò).

...

...

...

Cũng có thể sử dụng hệ các thống thứ hai và thứ ba làm kiểm soát quá trình chiết bằng cách bổ sung 100 bản sao plasmid pUC 19 hoặc pIAC-STEC vào mẫu dạng lỏng trước bước tinh sạch ADN.

PHỤ LỤC E

(Tham khảo)

Mồi và mẫu dò dùng cho phép phân tích PCR

Nguyên tắc real-time PCR được quy định dựa trên việc sử dụng các mồi và các mẫu dò dưới đây làm thuốc thử đối chứng. Tuy nhiên, các phương pháp khác bao gồm cả việc sử dụng các mồi và các mẫu dò khác với điều kiện các mồi và các mẫu dò đó đã được công nhận tương đương với các mồi và các mẫu dò nêu trong Bảng E.1 và E.2, phù hợp với các nguyên tắc nêu trong ISO 16140:2003[17].

E.1. Mồi và mẫu dò

Bảng E.1 và E.2 cung cấp các trình tự mồi và trình tự mẫu dò, tương ứng đối với:

- Việc phát hiện các gen stx và eae bằng phương pháp real-time PCR (PCA A);

...

...

...

Trong Bảng E.1 và Bảng E.2, các chất chỉ thị huỳnh quang và chất hấp thụ huỳnh quang không được nhận biết vì điều này phụ thuộc lớn vào các thiết bị real-time PCR có sẵn trong từng phòng thử nghiệm.

Bảng E.1 - Các mồi và mẫu dò thoái hóa được dùng cho phản ứng PCR 5’-nuclease

Gen đích

Trình tự mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò

(từ đầu 5’ đến đầu 3’)^a

Kích thước amplicon

bp

Vị trí trong trình tự

Bổ sung vào Ngân hàng Gen Số

...

...

...

Tài liệu tham khảo [3]

TTT GTY ACT GTS ACA GCW GAA GCY TTA CG

CCC CAG TTC ARW GTR AGR TCM ACR TC

Mẫu dò-CTG GAT GAT CTC AGT GGG CGT TCT TAT GTAA

131

878 đến 906

938 đến 1008

941 đến 971

M16625

...

...

...

Tài liệu tham khảo [3]

TTT GTY ACT GTS ACA GCW GAA GCY TTA CG

CCC CAG TTC ARW GTR AGR TCM ACR TC

Mẫu dò -TCG TCA GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC

128

785 đến 813

887 đến 912

838 đến 864

X07865

...

...

...

Tài liệu tham khảo [2]

CAT TGA TCA GGA TTT TTC TGG TGA TA

CTC ATG CGG AAA TAG CCG TTA

Mẫu dò-ATA GTC TCG CCA GTA TTC GCC ACC AAT ACC

102

899 đến 924

1000 đến 979

966 đến 936

Z11541

...

...

...

^b Quá trình tổ hợp mồi/mẫu dò này nhận dạng tất cả các biến thể của gen stx2 trừ gen stx2f.

Bảng E.2 - Mồi và mẫu dò được dùng để khuếch đại các gen đặc hiệu kháng nguyên O trong phản ứng PCR 5’-nuclease

Gen đích (nhóm huyết thanh)

Trình tự mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò

(từ đầu 5’ đến đầu 3’)^a

Kích thước amplicon

bp

Vị trí trong trình tự

Bổ sung vào Ngân hàng Gen Số

...

...

...

Tài liệu tham khảo [3]

TTT CAC ACT TAT TGG ATG GTC TCAA

CGA TGA GTT TAT CTG CAA GGT GAT

Mẫu dò-AGG ACC GCA GAG GAA AGA GAG GAA TTA AGG

88

348 đến 372

412 đến 435

381 đến 410

AF163329

...

...

...

Tài liệu tham khảo [3]

CGA GGC AAC ACA TTA TAT AGT GCT TT

TTT TTG AAT AGT TAT GAA CAT CTT GTT TAGC

Mẫu dò-TTG AAT CTC CCA GAT GAT CAA CAT CGT GAA

146

3464 đến 3489

3579 đến 3609

3519 đến 3548

AF078736

...

...

...

Tài liệu tham khảo [3]

CGC GAC GGC AGA GAA AATT

AGC AGG CTT TTA TAT TCT CCA ACT TT

Mẫu dò-CCC CGT TAA ATC AAT ACT ATT TCA CGA GGT TGA

135

5648 đến 5666

5757 đến 5782

5692 đến5724

AF529080

...

...

...

Tài liệu tham khảo [3]

CGA TAA TAT TTA CCC CAC CAG TAC AG

GCC GCC GCA ATG CTT

Mẫu dò-CCG CCA TTC AGA ATG CAC ACA ATA TCG

132

1383 đến 1408

1500 đến 1514

1472 đến 1498

AF531429

...

...

...

Tài liệu tham khảo [4]

CAA GGT GAT TAC GAA AAT GCA TGT

GAA AAA AGC ACC CCC GTA CTT AT

Mẫu dò-CAT AGC CTG TTG TTT TAT

99

4299 đến 4323

4397 đến 4375

4356 đến 4373

AY532664

...

...

...

PHỤ LỤC F

(Quy định)

Phân lập các chủng STEC

Áp dụng các quy trình quy định để phân lập các chủng STEC từ các mẫu dương tính bằng phương pháp real-time PCR.

a) Trong trường hợp dương tính với một trong các gen liên kết với các nhóm huyết thanh trong phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn này, thì có thể tăng sinh nhóm huyết thanh đặc hiệu (SSE) trên dịch cấy tăng sinh còn lại để tạo điều kiện thuận tiện cho quá trình phân lập STEC (xem Chú thích 1).

b) Cấy vạch dịch cấy tăng sinh hoặc SSE trên TBX hoặc môi trường thích hợp khác (xem Chú thích 2). Ủ trong 18 h đến 24 h ở 37 ^oC ± 1 ^oC.

c) Lấy 50 khuẩn lạc có hình thái E. coli hoặc có hình dạng đặc trưng (xem Chú thích 5) và cấy điểm trên thạch dinh dưỡng (NA) (xem Chú thích 3) và nước (các khuẩn lạc có thể được khoanh vùng thành tổng số 10 khuẩn lạc mỗi vùng trong nước).

d) Tiến hành phát hiện các gen mã hóa stx trên các khuẩn lạc phân lập được hoặc trên các vùng nước (xem Chú thích 4).

e) Nếu vùng nước là dương tính, quay ngược lại NA và phân tích các khuẩn lạc đơn lẻ tạo thành nhóm dương tính để lựa chọn một khuẩn lạc dương tính đơn lẻ.

...

...

...

g) Các mẫu phân lập có thể được gửi đến các phòng thử nghiệm chuẩn để phân tích các đặc tính tiếp theo.

CHÚ THÍCH 1: Có thể thực hiện tăng sinh nhóm huyết thanh đặc hiệu bằng cách sử dụng các hệ thống thu nạp miễn dịch như IMS hoặc tương đương. Nhìn chung, cần tham khảo các hướng dẫn của nhà sản xuất.

CHÚ THÍCH 2: Đối với các mẫu dương tính O157, có thể các phương pháp nêu trong TCVN 7686 (ISO 16654)^[19] hoặc các phương pháp khác được đánh giá, xác nhận theo ISO 16140-2^[18] là thích hợp. Chủng E. coli O157 lên men đường sorbitol nhạy với telurit có trong môi trường CT SMAC được chỉ ra trong OSP 1664.^[19] Vì vậy, sử dụng đĩa phân lập SMAC thứ hai không có các chất kháng sinh là thích hợp. Khi không có các khuẩn lạc âm tính với đường sorbitol trên đĩa thạch, thì nêu rõ phương pháp sàng lọc các khuẩn lạc dương tính với đường sorbitol.

Để phân lập chủng STEC O26 có thể dùng môi trường rắn khác (MacConkey) có chứa ramnose thay vì chứa lactose thương mại có bán sẵn (RMAC). Điều này rất hiệu quả trong việc phân biệt các chủng STEC O26 không lên men ramnose từ các vi khuẩn E. coli khác.

CHÚ THÍCH 3: Một số loại môi trường thạch dinh dưỡng thương mại có bán sẵn để dùng cho đĩa hoặc tự chuẩn bị từ bột khô. Môi trường thạch dinh dưỡng không chọn lọc (ở đây là: TSA) là thích hợp để duy trì các khuẩn lạc cho phân tích các đặc tính tiếp theo. Thạch enterohemolizin cũng có thể được sử dụng, loại thạch này có lợi thế phát hiện quá trình enterohemolizin phổ biến của STEC gây bệnh trên người.

CHÚ THÍCH 4: Phương pháp real-time PCR được quy định trong tiêu chuẩn này có thể được dùng để khẳng định sự có mặt các gen stx và gen eae trong các chủng phân lập được. Phương pháp PCR thông thường có thể được sử dụng làm phương án thay thế (Phụ lục C).

CHÚ THÍCH 5: Có thể khẳng định khuẩn lạc là E. coli bằng cách sử dụng nhiều kit thử sinh hóa thương mại hoặc bằng cách đánh giá quá trình sinh indol. Có thể khẳng định nhóm huyết thanh bằng phương pháp PCR hoặc bằng sự ngưng kết với kháng huyết thanh thương mại.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] NIELSEN, E.M., ANDERSEN, M.T. Detection and characterization of verocytotoxin-producing Escherichia coli by automated 5' nuclease PCR assay. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, pp. 2884-2893

[3] PERELLE, S., DILASSER, F., GROUT, J., FACH, P. Detection by 5' nuclease PCR of Shiga-toxin producing Escherichia coli O26, O55, O91, O103, O111, O113, O145 and O157:H7, associated with the world's most frequent clinical cases. Mol. Cell Probes 2004,18, pp. 185-192

[4] PERELLE, S., DILASSER, F., GROUT, J., FACH, P. Detection of Escherichia coli serogroup O103 by realtime polymerase chain reaction. J. Appl. Microbiol. 2005, 98, pp. 1162-1168

[5] VIMONT, A., DELIGNETTE-MULLER, M.L., VERNOZY-ROZAND, C. Supplementation of enrichment broths by novobiocin for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli from food: A controversial use. Lett. Appl. Microbiol. 2007, 44, pp. 326-331

6] UEMURA, R., SUEYOSHI, M., NAGAYOSHI, M., NAGATOMO, H. Antimicrobial susceptibilities of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from pigs with edema disease in Japan. Microbiol. Immunol. 2003, 47, pp. 57-61

[7] GENESYSTEMS. Validation AFNOR des méthodes alternatives d'analyse: Application à la microbiologie alimentaire [AFNOR validation of alternative analytical methods: Application to food microbiology]. Quimper: Adria Développement. 56 p. Available (viewed 2012-10-17) at: http://www.afnor-validation.org/rapports-synthese/GENESYSTEMS/Synt%20GEN%2025-06%2011-08%20(fr).pdf

[8] KAGKLI, D.-M, WEBER, T.P., VAN DEN BULCKE, M., FOLLONI, S., TOZZOLI, R., MORABITO, S., ERMOLLI, M., GRIBALDO, L, VAN DEN EEDE, G. Application of the modular approach to an in-house validation study of real-time PCR methods for the detection and serogroup determination of verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, pp. 6954-6963

[9] EUROPEAN UNION REFERENCE LABORATORY VTEC. Proficiency tests and ring trials on detection and typing methods. Rome: Istituto Superiore di Sanita. Available (viewed 2012-10-17) at: http://www.iss. it/vtec/neww/cont.php?id=147&lanq=2&tipo=15

[10] SAMBROOK, J., RUSSEL., D.W. Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition, 3 vols. Cold Sprin Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001

...

...

...

[12] O'BRIEN, A.D., NEWLAND, J.W., MILLER, S.F., HOLMES, R.K., SMITH, H.W., FORMAL, S.B. Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science 1984, 226, pp. 694-696

[13] PERNA, NT., PLUNKETT, III, G., BURLAND, V., MAU, B., GLASNER, J.D., ROSE, D.J., et al. Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature 2001, 409, pp. 529-533

[14] HOORFAR, J., MALORNY, B., ABDULMAWJOOD, A., COOK, N., WAGNER, M., FACH, P. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, pp. 1863-1868

[15] BEUTIN, L, JAHN, S., FACH, P. Evaluation of the 'GeneDisc' real-time PCR system for detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O26, O103, O111, O145 and O157 strains according to their virulence markers and their O-and H-antigen-associated genes. J. Appl. Microbiol. 2009, 106, pp. 1122-32

[16] ISO 7550, Laboratory glassware - Disposable micropipettes

[17] ISO 16140:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Protocol for the validation of alternative methods

[18] ISO 16140-28), Microbiology of food and animal feeding stuffs - Method validation - Part 2: Protocol for the validation of proprietary methods against a reference method

[19] TCVN 7686 (ISO 16654), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Escherichia coli O157

[20] TCVN 9332:2012 (ISO/TS 19036:2006, With Amd. 1:2009), Vi sinh vật thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn ước lượng độ không đảm bảo đo đối với các phép phân tích định lượng

...

...

...

[22] SCHEUTZ, F., TEEL, L.D., BEUTIN, L, PlERARD, D., BUVENS, G., kARCH, H., MELLMANN, A., CAPRIOU, A., TOZZOLI, R., MORABITO, S., STROCKBINE, N.A., MELTON-CELSA, A.R., SANCHEZ, M., PERSSON, S., O'BRIEN, A.D. A multi-center evaluation of a sequence-based protocol to subtype Shiga toxins and standardize Stx nomenclature. J. Clin. Microbiol. 2012 Jul 3

[23] NATIONAL CENTER FOR EMERGING AND ZOONOTIC INFECTIOUS DISEASES. DIVISION OF FOODBORNE, WATERBORNE, AND ENVIRONMENTAL DISEASES. National Enteric Disease Surveillance: Shiga toxinn producing Escherichia coli (STEC) Annual Summary, 2009. Bethesda, MD: CDC, 2012

[24] EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY AND EUROPEAN CENTRE FOR DISEASE PREVENTION AND CONTROL. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2010. Eur. Food Saf. Author. J. 2012, 10, p. 2597

[25] EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY. Technical specifications for the monitoring and reporting of verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) on animals and food (VTEC surveys on animals and food). Eur. Food Saf. Author. J. 2009, 7, p. 1366

[26] SCHMIDT, H., SCHEEF, J., MORABITO, S., CAPRIOLI, A., WIELER, L.H., KARCH, H. A new Shiga toxin 2 variant (Stx2f) from Escherichia coli isolated from pigeons. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, pp. 1205-8.

[27] FRICKER, M., MESSELHUSSER, U., BUSCH, U., SCHERER, S., EHLING-SCHULZ, M. Diagnostic real- time PCR assays for the detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73, pp. 1892-1898

1) XX cho thấy nhóm huyết thanh được xác định bởi sự có mặt của các gen đang nghiên cứu.

2) XX cho thấy nhóm huyết thanh chủng phân lập được thuộc vào việc nghiên cứu sự có mặt của các gen tương ứng hoặc việc xác định.

3) Xem Phụ lục F.

...

...

...

5) TaqMan là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Applied Bioystems. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho các kết quả tương đương.

6) Vic là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Applied Bioystems. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho các kết quả tương đương.

7) Gồm thông tin riêng.

8) Sẽ được xuất bản (soát xét ISO 16140:2003 [17]).