Tiêu chuẩn TCVN 13635:2023 về Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Phát hiện vi sinh vật và vi sinh vật chỉ định

• Số hiệu: TCVN13635:2023
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2023

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13635:2023

ISO 18415:2017

WITH AMENDMENT 1:2022

MỸ PHẨM - VI SINH VẬT - PHÁT HIỆN VI SINH VẬT VÀ VI SINH VẬT CHỈ ĐỊNH

Cosmetics - Microbiology - Detection of non-specified and specified microorganisms

Lời nói đầu

TCVN 13635:2023 hoàn toàn tương đương với ISO 18415:2017 và sửa đổi 1:2022.

TCVN 13635:2023 do Viện Kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

...

...

...

Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh cho sản phẩm mỹ phẩm được thực hiện tùy theo mức độ phân tích rủi ro vi sinh nhằm đảm bảo chất lượng và an toàn cho người tiêu dùng.

Phân tích rủi ro vi sinh phụ thuộc vào một số đặc điểm như:

- Độ ổn định của các sản phẩm mỹ phẩm;

- Khả năng gây bệnh của vi sinh vật;

- Vị trí sử dụng sản phẩm mỹ phẩm (tóc, da, mắt, niêm mạc);

- Độ tuổi người sử dùng (người lớn, trẻ em dưới 3 tuổi).

Đối với mỹ phẩm và các sản phẩm sử dụng tại chỗ khác, phát hiện các mầm bệnh trên da như Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans là cần thiết, vì những vi sinh vật này có thể gây bệnh nhiễm khuẩn da hoặc mắt. Ngoài ra, việc phát hiện các loại vi sinh vật khác cũng được quan tâm vì sự xuất hiện của những vi sinh vật này như Escherichia coli cho thấy sự không đảm bảo vệ sinh trong quá trình sản xuất.

MỸ PHẨM - VI SINH VẬT - PHÁT HIỆN VI SINH VẬT VÀ VI SINH VẬT CHỈ ĐỊNH

...

...

...

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn đưa ra hướng dẫn chung phát hiện và định danh các vi sinh vật chỉ định trong sản phẩm mỹ phẩm cũng như phát hiện và định danh các loại vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt khác trong các sản phẩm mỹ phẩm.

Các vi sinh vật được chỉ định trong tiêu chuẩn này có thể khác tùy theo thực tế và quy định riêng của mỗi quốc gia. Đa số các vi sinh vật được chỉ định bao gồm một hoặc nhiều loài sau: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Candida albicans.

Để đảm bảo chất lượng sản phẩm và sự an toàn cho người tiêu dùng, cần thực hiện phân tích rủi ro vi sinh thích hợp để xác định loại sản phẩm mỹ phẩm áp dụng tiêu chuẩn này. Các sản phẩm được coi là có rủi ro vi sinh thấp, dựa trên đánh giá rủi ro được mô tả trong TCVN 13641:2023 (ISO 29621) như các sản phẩm có hoạt độ nước thấp, sản phẩm chứa cồn hoặc giá trị pH cực đoan, v.v.

Các phương pháp được mô tả trong tiêu chuẩn này dựa trên việc phát hiện sự sinh trưởng vi sinh vật trong môi trường lỏng không chọn lọc thích hợp (môi trường tăng sinh) để phát hiện sự nhiễm khuẩn, tiếp theo là phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch không chọn lọc. Các phương pháp khác có thể phù hợp phụ thuộc vào mức độ phát hiện theo yêu cầu.

Tiêu chuẩn này chỉ dẫn chi tiết phương pháp định danh Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Candida albicans. Các vi sinh vật khác phát triển trong các điều kiện được mô tả trong tiêu chuẩn này, có thể được định danh bằng việc sử dụng các thử nghiệm phù hợp theo một quy trình chung (xem Phụ lục A). Có thể áp dụng các tiêu chuẩn khác như TCVN 13636 (ISO 18416), TCVN 12974 (ISO 21150), TCVN 13639 (ISO 22717), TCVN 13640 (ISO 22718).

Do có rất nhiều dạng sản phẩm mỹ phẩm nên trong phạm vi áp dụng, phương pháp này có thể không phù hợp với một số sản phẩm cụ thể (ví dụ như các sản phẩm không thấm nước). Các phương pháp khác (ví dụ như phương pháp tự động) có thể thay thế cho các thử nghiệm sinh hóa trình bày ở đây với điều kiện phương pháp đó được chứng minh là tương đương hoặc phù hợp.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây là rất cần thiết khi áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

...

...

...

EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics - Preservation of test organisms used for the determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal (including bacteriophages) activity (Thuốc khử khuẩn và chất khử khuẩn hoá học - Bảo quản các sinh vật thử nghiệm dùng để xác định hoạt tính diệt khuẩn (bao gồm Legionella), diệt khuẩn nấm, diệt bào tử khuẩn, diệt virus (bao gồm cả thực khuẩn thể)

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau.

3.1

Sản phẩm (product)

Phần sản phẩm mỹ phẩm xác định nhận được trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm.

3.2

Mẫu (sample)

Một phần của sản phẩm (3.1) (ít nhất 1 g hoặc 1 ml) được dùng để chuẩn bị hỗn dịch ban đầu (3.3).

...

...

...

Hỗn dịch ban đầu (initial suspension)

Hỗn dịch hay dung dịch của mẫu (3.2) trong thể tích nhất định của môi trường tăng sinh lỏng phù hợp (3.8).

3.4

Mẫu pha loãng (sample dilution)

Mẫu được pha loãng từ hỗn dịch ban đầu (3.3).

3.5

Vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt (Aerobic mesophilic microorganism)

Vi khuẩn hay nấm men ưa nhiệt phát triển trong điều kiện hiếu khí được chỉ rõ trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH 1: Trong các điều kiện được mô tả, các vi sinh vật khác (ví dụ như nấm mốc) có thể được phát hiện.

...

...

...

Vi sinh vật chỉ định (specified microorganism)

Vi khuẩn ưa nhiệt hiếu khí hoặc nấm men không được có trong một sản phẩm mỹ phẩm và được xác định là một loài gây bệnh trên da có thể gây hại cho sức khoẻ con người hoặc là vi sinh vật chỉ thị của việc không đảm bảo vệ sinh trong quá trình sản xuất.

3.6.1

Pseudomonas aeruginosa

Trực khuẩn gram âm (khuẩn hình que), di động, khuẩn lạc tròn, trơn, nhầy, có sắc tố nâu hoặc xanh lục.

CHÚ THÍCH 1: Các đặc tính chính để định danh là sự phát triển trên môi trường thạch cetrimid chọn lọc, phản ứng oxidase dương tính, sản sinh sắc tố huỳnh quang tán xạ và sắc tố phenazin hòa tan (pyocyanin) trên môi trường thích hợp.

CHÚ THÍCH 2: Pseudomonas aeruginosa có thể được phân lập từ nhiều nguồn môi trường khác nhau trong tự nhiên, đặc biệt trong nước và có khả năng cao làm hư hỏng nhiều cơ chất khác nhau. Nó có thể gây nhiễm khuẩn trên vùng da và mắt người. Đó là vi khuẩn không mong muốn trong các sản phẩm mỹ phẩm vì khả năng gây bệnh và ảnh hưởng lên tính chất lý hóa của công thức mỹ phẩm.

3.6.2

Escherichia coli

...

...

...

CHÚ THÍCH 1: Các đặc tính chính là phản ứng catalase dương tính, phản ứng oxidase âm tính, lên men lactose, sản xuất indol, và phát triển trên môi trường chọn lọc chứa muối mật hình thành các khuẩn lạc đặc trưng.

CHÚ THÍCH 2: Escherichia coli có thể được phân lập từ các nguồn môi trường ẩm (không khí, nước, đất) và là một chỉ thị cho sự nhiễm phân.

3.6.3

Staphylococcus aureus

Cầu khuẩn gram dương, phần lớn tập trung lại thành những cụm như chùm nho, khuẩn lạc tròn, trơn, thường có sắc tố vàng.

CHÚ THÍCH 1: Các đặc tính chính để định danh là sự phát triển trên môi trường chọn lọc đặc biệt, phản ứng catalase dương tính, phản ứng coagulase dương tính.

CHÚ THÍCH 2: Staphylococcus aureus là vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên người, chúng cũng có thể thường xuất hiện trên da của những người khỏe mạnh, mà không gây ra bất kỳ chứng bệnh rõ ràng nào. Nó là vi sinh vật chỉ định không được có trong các sản phẩm mỹ phẩm.

3.6.4

Candida albicans

...

...

...

CHÚ THÍCH: Các đặc tính chính để định danh là tạo thành ống mầm (germ tube) và / hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium) và bào tử vách dày (chlamydospore) khi thử nghiệm được thực hiện theo phương pháp được mô tả trong tiêu chuẩn này.

3.7

Vi sinh vật (non-specified microorganism)

Các loại vi khuẩn hoặc nấm men hiếu khí, ưa nhiệt được tìm thấy trong các sản phẩm mỹ phẩm mà không được nêu ở mục 3.6.

3.8

Môi trường tăng sinh lỏng (enrichment broth)

Môi trường lỏng không chọn lọc chứa các chất trung hòa và / hoặc các chất phân tán thích hợp và đã được chứng minh là phù hợp với sản phẩm (3.1) được thử nghiệm.

4  Nguyên tắc

Bước đầu tiên của quy trình là làm tăng số lượng vi sinh vật trong môi trường lỏng không chọn lọc và đảm bảo vi sinh vật này không bị ức chế bởi các tác nhân chọn lọc có trong môi trường chọn lọc / phân biệt.

...

...

...

Phải trung hòa khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật của mẫu thử để cho phép phát hiện các vi sinh vật sống. Trong mọi trường hợp và bất kể phương pháp nào, phải kiểm tra và chứng minh sự trung hòa các đặc tính kháng khuẩn của sản phẩm.

5  Dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy

5.1  Quy định chung

Hướng dẫn chung được đưa ra trong TCVN 13637 (ISO 21148). Nước đề cập trong tiêu chuẩn này là nước cất hoặc nước tinh khiết theo TCVN 13637 (ISO 21148).

Môi trường tăng sinh lỏng được sử dụng để phân tán mẫu thử và tăng số lượng vi sinh vật ban đầu. Môi trường có chứa chất trung hòa nếu mẫu được kiểm tra có chứa chất kháng khuẩn. Hiệu lực của phương pháp trung hòa cần được chứng minh (Điều 11). Thông tin về chất trung hòa phù hợp được đưa ra trong Phụ lục C.

Theo tiêu chuẩn này, môi trường tăng sinh lỏng (5.3.2.1) hay bất kì môi trường nào được liệt kê trong Phụ lục B đều phù hợp để kiểm tra sự có mặt của các vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật khác dựa theo tiêu chuẩn này với điều kiện chúng đã được chứng minh phù hợp với Điều 11.

Những dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy khác cũng có thể được sử dụng nếu nó được chứng minh là phù hợp.

5.2  Dung dịch pha loãng hỗn dịch vi khuẩn (dung dịch tryptone natri chloride)

5.2.1  Quy định chung

...

...

...

5.2.2  Thành phần

Trypton, Casein thủy phân bởi pancreatin

1,0 g

Natri clorid

8,5 g

Nước

1 000 ml

5.2.3  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích chứa thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng khoảng 7,0 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

...

...

...

5.3.1  Quy định chung

Môi trường nuôi cấy có thể được chuẩn bị như sau đây, hoặc từ môi trường nuôi cấy khô hoàn chỉnh theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Môi trường để sử dụng ngay có thể được sử dụng khi các thành phần của chúng và / hoặc hiệu suất sinh trường có thể so sánh được với các công thức đã được đưa ra.

5.3.2  Môi trường tăng sinh lỏng

5.3.2.1  Môi trường Eugon LT100 lỏng

5.3.2.1.1  Quy định chung

Môi trường này chứa các thành phần gồm các chất trung hòa các tác nhân ức chế có trong mẫu: lecithin, polysorbate 80, và chất phân tán: octoxynol 9. Môi trường Eugon LT lỏng cải tiến có thể được chọn sử dụng thay thế.

5.3.2.1.2  Thành phần

Casein thủy phân bởi prancreatin

...

...

...

Bột đậu tương thủy phân bởi papain

5,0 g

L-cystine

0,7 g

Natri clorid

4,0 g

Natri sulfit

0,2 g

Glucose

...

...

...

Lecithin từ trứng

1,0 g

Polysorbat 80

5,0 g

Octoxynol 9

1,0 g

Nước

1 000 ml

5.3.2.1.3  Chuẩn bị

...

...

...

5.3.2.2  Môi trường Eugon LT lỏng cải tiến

5.3.2.2.1  Thành phần

Casein thủy phân bởi prancreatin

15,0 g

Bột đậu tương thủy phân bởi papain

5,0 g

L-cystine

0,7 g

Natri clorid

...

...

...

Natri sulfit

0,2 g

Glucose

5,5 g

Lecithin từ trứng

1,0 g

Polysorbat 80

5,0 g

Natri lauryl eter sulphate

...

...

...

Nước

1 000 ml

5.3.2.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan lần lượt từng thành phần polysorbate 80, lecithin từ trứng trong nước sôi để tan hoàn toàn. Hòa tan các thành phần khác bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng khoảng 7,0 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

5.3.2.3  Các môi trường tăng sinh lỏng khác

Có thể sử dụng các môi trường tăng sinh lỏng khác nếu phù hợp (xem Phụ lục B).

5.3.3  Môi trường thạch không chọn lọc

5.3.3.1  Quy định chung

Các môi trường này được sử dụng để phân lập và phát hiện các chủng vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật khác có trong hỗn dịch mẫu ban đầu sau khi được tăng sinh và được sử dụng để chuẩn bị chủng chuẩn cho quy trình kiểm tra tính phù hợp của phương pháp.

...

...

...

5.3.3.3  Môi trường thạch không chọn lọc khác

Có thể sử dụng các môi trường thạch không chọn lọc khác nếu phù hợp (xem Phụ lục B).

6  Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm và dụng cụ theo mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148).

7  Các chủng vi sinh vật

Ba chủng vi sinh vật chỉ định được sử dụng cho thử nghiệm khả năng phục hồi trong các điều kiện thử nghiệm: hai chủng vi khuẩn đại diện cho vi khuẩn gram âm, gram dương và một chủng nấm men.

- Pseudomonas aeruginosa ATCC1) 9027 (các chủng tương đương: CIP2) 82.118 hay NCIMB3) 8626 hay NBRC4) 13275 hay KCTC5) 2513 hoặc bộ sưu tập chủng quốc gia tương đương khác).

- Có thể thay bằng: Escherichia coli ATCC^1)8739 (các chủng tương đương: CIP^2) 53.126 hay NCIMB^3) 8545 hay NBRC^4) 3972 hay KCTC^5) 2571 hoặc bộ sưu tập chủng quốc gia tương đương khác).

- Staphylococcus aureus ATCC^1) 6538 (các chủng tương đương: CIP^2) 4.83 hay NCIMB^3)9518 hay NBRC^4)13276 hay KCTC^5) 1916 hoặc bộ sưu tập chủng quốc gia tương đương khác).

...

...

...

Việc nuôi cấy nên tuân theo các quy trình được cung cấp bởi nhà sản xuất của chủng chuẩn.

Các chủng chuẩn có thể được lưu trữ trong phòng thí nghiệm theo EN 12353.

8  Xử lý mẫu mỹ phẩm và mẫu thử trong phòng thí nghiệm

Giữ sản phẩm thử nghiệm ở nhiệt độ phòng, nếu cần. Không được ủ, làm lạnh hoặc cấp đông sản phẩm và mẫu thử nghiệm trước hoặc sau khi phân tích.

Quá trình lấy mẫu thử nghiệm từ các sản phẩm mỹ phẩm để phân tích cần được tiến hành như mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148) và theo quy trình đưa ra trong Điều 9.

9  Quy trình

9.1  Khuyến cáo chung

Sử dụng vật liệu vô khuẩn, thiết bị và kỹ thuật vô khuẩn để chuẩn bị mẫu thử nghiệm, pha hỗn dịch mẫu ban đầu và mẫu pha loãng. Khi chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu, sử dụng dung dịch pha loãng hợp lý, khoảng thời gian từ lúc hoàn tất việc chuẩn bị đến lúc hỗn dịch mẫu ban đầu và / hoặc mẫu pha loãng bắt đầu tiếp xúc với môi trường tăng sinh không nên quá 45 min, trừ khi có yêu cầu đặc biệt khác trong quy trình hoặc tiêu chuẩn đã thiết lập.

9.2  Chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu trong môi trường tăng sinh lỏng

...

...

...

Mẫu thử được tăng sinh từ ít nhất 1 g hoặc 1 ml sản phẩm (đã được trộn đều) được phân tán trong ít nhất 9 ml môi trường tăng sinh lỏng.

CHÚ THÍCH: S, khối lượng hay thể tích chính xác của mẫu thử nghiệm.

Phương pháp thử nghiệm nên được kiểm tra để chắc rằng các thành phần (chất trung hòa được thêm vào) và thể tích của môi trường lỏng là phù hợp cho thử nghiệm (11.3).

CHÚ THÍCH: Trong một số trường hợp, khi có thể, lọc sản phẩm mỹ phẩm qua một màng lọc và sau đó, màng lọc này được cấy vào môi trường tăng sinh lỏng nhằm tạo điều kiện thuận lợi trong việc trung hòa các chất kháng khuẩn của sản phẩm (11.3.3).

9.2.2  Các sản phẩm trộn lẫn được trong nước

Chuyển mẫu, S, của sản phẩm vào trong một bình chứa một lượng thích hợp (ít nhất 9 ml) môi trường tăng sinh lỏng.

9.2.3  Các sản phẩm không trộn lẫn được trong nước

Chuyển lượng mẫu, S, của sản phẩm vào trong một bình chứa một lượng thích hợp tác nhân phân tán (ví dụ polysorbate 80).

Phân tán mẫu thử trong tác nhân phân tán và thêm một lượng thích hợp (ít nhất 9 ml) môi trường tăng sinh lỏng.

...

...

...

Sử dụng màng lọc có kích thước lỗ lọc không quá 0,45 μm.

Chuyển lượng mẫu, S, lên màng lọc của bộ lọc (TCVN 13637(ISO 21148)). Lọc nhanh và rửa màng lọc bằng một lượng nước và / hoặc dung dịch pha loãng xác định. Chuyển màng lọc và nhúng ngập màng lọc vào ống hoặc bình có chứa một lượng thích hợp (ít nhất 9 ml) môi trường tăng sinh lỏng. Sự chuẩn bị này tương đương với hỗn dịch ban đầu.

9.3  Ủ dịch hỗn dịch ban đầu

Ủ hỗn dịch ban đầu được chuẩn bị trong môi trường lỏng ( 9.2) ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong vòng ít nhất 20 h và tối đa không quá 72 h.

9.4  Phân lập vi sinh vật chỉ định và vi sinh vật khác

Sử dụng que cấy vòng vô khuẩn, lấy một quai cấy từ môi trường tăng sinh lỏng đã được ủ trước đó lên bề mặt của đĩa Petri (đường kích 85 mm đến 100 mm) có chứa khoảng 15 ml đến 20 ml môi trường thạch không chọn lọc. Nếu sử dụng đĩa Petri lớn hơn, phải tăng tương ứng lượng thể tích của môi trường thạch.

Úp ngược đĩa Petri và ủ ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong 48 h đến 72 h. Quy trình định danh các khuẩn lạc được mô tả sau đây cho Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans và các vi sinh vật khác mô tả trong 9.9.

9.5  Quy trình định danh vi sinh vật chỉ định; Pseudomonas aeruginosa

9.5.1  Nhuộm gram

...

...

...

Quan sát dưới kính hiển vi sau khi nhuộm gram phải là trực khuẩn gram âm.

9.5.2  Phản ứng Oxidase

Tiến hành theo quy trình được nêu trong TCVN 13637 (ISO 21148).

Kiểm tra xem có phải phản ứng oxidase dương tính không.

9.5.3  Phép thử định danh

Sử dụng quy trình định danh phù hợp cho trực khuẩn gram âm không lên men (nghĩa là hệ thống sinh hóa tiêu chuẩn và / hoặc hệ thống sinh hóa thu nhỏ) với cơ sở dữ liệu riêng (hay tương đương như một danh mục) bao gồm những đặc trưng điển hình của Pseudomonas aeruginosa.

Khi sử dụng bộ kit định danh, làm theo các chỉ dẫn được đưa ra bởi nhà sản xuất (việc cấy chủng, ủ, đọc kết quả) và so sánh kết quả cuối cùng trên cơ sở dữ liệu. Tên của vi sinh vật được định danh là Pseudomonas aeruginosa với mức độ tin cậy được xem xét là phù hợp bởi hệ thống định danh.

9.6  Quy trình định danh vi sinh vật chỉ định: Escherichia coli

9.6.1  Nhuộm gram

...

...

...

Quan sát dưới kính hiển vi sau khi nhuộm gram phải là trực khuẩn gram âm.

9.6.2  Phản ứng Oxidase

Kiểm tra phản ứng oxidase âm tính như mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148).

9.6.3  Phép thử định danh

Sử dụng quy trình định danh phù hợp cho trực khuẩn gram âm không lên men (nghĩa là hệ thống sinh hóa tiêu chuẩn và / hoặc hệ thống sinh hóa thu nhỏ) với cơ sở dữ liệu riêng (hay tương đương như một danh mục) bao gồm những đặc trưng điển hình của Escherichia coli.

Khi sử dụng bộ kit định danh, làm theo các chỉ dẫn được đưa ra bởi nhà sản xuất (việc cấy chủng, ủ, đọc kết quả) và so sánh kết quả cuối cùng trên cơ sở dữ liệu. Tên của vi sinh vật được định danh là Escherichia coli với mức độ tin cậy được xem xét là phù hợp bởi hệ thống định danh.

9.7  Quy trình định danh vi sinh vật chỉ định: Staphylococcus aureus

9.7.1  Nhuộm gram

Tiến hành nhuộm gram theo mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148) với 1 phần khuẩn lạc nghi ngờ được phân lập từ bề mặt của môi trường thạch casein đậu tương.

...

...

...

9.7.2  Phản ứng Catalase

Kiểm tra phản ứng catalase dương tính như mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148).

9.7.3  Phép thử định danh

Sử dụng quy trình định danh phù hợp cho trực khuẩn gram âm không lên men (nghĩa là hệ thống sinh hóa tiêu chuẩn và / hoặc hệ thống sinh hóa thu nhỏ) với cơ sở dữ liệu riêng (hay tương đương như một danh mục) bao gồm những đặc trưng điển hình của Staphylococcus aureus.

Khi sử dụng bộ kit định danh, làm theo các chỉ dẫn được đưa ra bởi nhà sản xuất (việc cấy chủng, ủ, đọc kết quả) và so sánh kết quả cuối cùng trên cơ sở dữ liệu. Tên của vi sinh vật được định danh là Staphylococcus aureus với mức độ tin cậy được xem xét là phù hợp bởi hệ thống định danh.

9.8  Quy trình định danh vi sinh vật chỉ định: Candida albicans

9.8.1  Nhuộm gram

Tiến hành nhuộm gram theo mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148), với 1 phần khuẩn lạc nghi ngờ được phân lập từ bề mặt môi trường thạch không chọn lọc.

Quan sát dưới kính hiển vi sau khi nhuộm gram xem có phải các tế bào màu tím, hình trứng (bầu dục), ngắn hoặc kéo dài, đôi khi có những tế bào đang nảy chồi.

...

...

...

Sử dụng quy trình định danh phù hợp cho trực khuẩn gram âm không lên men (nghĩa là hệ thống sinh hóa tiêu chuẩn và / hoặc hệ thống sinh hóa thu nhỏ) với cơ sở dữ liệu riêng (hay tương đương như một danh mục) bao gồm những đặc trưng điển hình của Candida albicans.

Khi sử dụng bộ kit định danh, làm theo các chỉ dẫn được đưa ra bởi nhà sản xuất (việc cấy chủng, ủ, đọc kết quả) và so sánh kết quả cuối cùng trên cơ sở dữ liệu. Tên của vi sinh vật được định danh là Candida albicans với mức độ tin cậy được xem xét là phù hợp bởi hệ thống định danh.

9.9  Quy trình định danh vi sinh vật khác

9.9.1  Nhuộm gram

Tiến hành nhuộm gram theo mô tả trongCVN 13637 (ISO 21148), với 1 phần khuẩn lạc được phân lập từ bề mặt của môi trường thạch casein đậu tương.

Ghi nhận hình thái học và phản ứng nhuộm gram khi quan sát dưới kính hiển vi.

9.9.2  Phản ứng Oxidase

Nếu kết quả nhuộm soi là trực khuẩn gram âm, tiến hành thử phản ứng Oxidase như mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148), với 1 phần khuẩn lạc được phân lập từ bề mặt của môi trường thạch casein đậu tương.

Ghi nhận kết quả của phản ứng.

...

...

...

Nếu kết quả nhuộm soi là cầu khuẩn gram dương, tiến hành thử phản ứng catalase như mô tả trong TCVN 13637 (ISO 21148), với 1 phần khuẩn lạc được phân lập từ bề mặt của môi trường thạch casein đậu tương.

Ghi nhận kết quả của phản ứng.

9.9.4  Phép thử định danh

Dựa trên kết quả của các phép thử ban đầu (9.9.1, 9.9.2 và 9.9.3), chọn quy trình định danh phù hợp (nghĩa là hệ thống sinh hóa tiêu chuẩn và / hoặc hệ thống sinh hóa thu nhỏ) với cơ sở dữ liệu riêng (hay tương đương như một danh mục) bao gồm những đặc trưng điển hình của chủng vi sinh vật nghi ngờ (xem Phụ lục A).

Khi sử dụng bộ kit định danh, làm theo các chỉ dẫn được đưa ra bởi nhà sản xuất (việc cấy chủng, ủ, đọc kết quả) và so sánh kết quả cuối cùng trên cơ sở dữ liệu. Ghi nhận tên của vi sinh vật được xác định và mức độ tin cậy được xem xét là thích hợp bởi hệ thống định danh.

10  Biểu thị kết quả

10.1  Phát hiện các vi sinh vật chỉ định

Với mỗi chủng vi sinh vật chỉ định, nếu kết quả định danh khẳng định sự có mặt của chúng, biểu thị kết quả như sau:

- Phát hiện (tên loài) trong mẫu, S.

...

...

...

10.2  Phát hiện các vi sinh vật khác

Nếu quan sát thấy có sự phát triển sau khi tăng sinh và nếu khuẩn lạc được phân lập và được định danh là loài vi sinh vật khác, biểu thị kết quả như sau:

- Phát hiện (tên loài và / hoặc đặc điểm hình thái chính) trong mẫu, S, và không phát hiện vi sinh vật chỉ định.

10.3  Không có các vi sinh vật

Nếu quan sát không có sự phát triển sau khi tăng sinh và phân lập, thể hiện kết quả như sau:

- Không phát hiện vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt (bao gồm cả các vi sinh vật chỉ định) trong mẫu, S.

11  Sự trung hòa thuộc tính kháng vi sinh vật của sản phẩm

11.1  Quy định chung

Các phép thử khác nhau được mô tả sau đây chứng minh rằng các vi sinh vật có thể phát triển trong điều kiện thử nghiệm.

...

...

...

11.2  Chuẩn bị hỗn dịch chủng cấy

Trước khi tiến hành thử nghiệm, cấy từng chủng trên bề mặt thạch casein đậu tương (SCDA) hoặc môi trường thích hợp khác (không chọn lọc, không chất trung hòa). Ủ ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong 18 h đến 24 h. Để gặt vi sinh vật đã nuôi cấy, sử dụng que cấy vòng vô khuẩn, gặt khuẩn lạc trên bề mặt môi trường và phân tán trong dung dịch pha loãng để được hỗn dịch hiệu chỉnh chứa khoảng 1 x 10^8 CFU/ml cho vi khuẩn và khoảng 1 x 10^6 CFU/ml cho nấm (có thể sử dụng máy đo quang phổ để xác định nồng độ tương đối như Phụ lục C trong TCVN 13637 (ISO 21148:2017). Sử dụng hỗn dịch vi sinh vật này và các hỗn dịch pha loãng trong vòng 2 h.

11.3  Tính phù hợp của phương pháp phát hiện bằng môi trường tăng sinh

11.3.1  Nguyên tắc

Đối với từng chủng vi sinh thử nghiệm, trộn mẫu đã trung hòa (hỗn dịch mẫu ban đầu) với hỗn dịch chủng vi sinh vật pha loãng ở nồng độ xác định, sau đó đem ủ. Sau khi ủ, cấy một quai cấy sang môi trường thạch không chọn lọc để phân lập. Tiến hành song song một mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật.

Sau khi ủ, quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên các đĩa kiểm tra sự phù hợp và đĩa đối chứng. Đánh giá kết quả.

11.3.2  Cách tiến hành

Pha loãng hỗn dịch chủng vi sinh vật gốc trong các ống nghiệm chứa sẵn 9 ml dung dịch pha loãng để được hỗn dịch chủng cuối cùng trong khoảng 100 CFU/ml đến 500 CFU/ml. Để đếm vi sinh vật sống lại trong hỗn dịch này, hút 1 ml hỗn dịch vào đĩa Petri và cho 15 ml đến 20 ml môi trường thạch được làm nóng chảy và giữ trong bể ổn nhiệt không quá 48 °C. Ủ đĩa ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong 20 h đến 24 h.

Chuẩn bị hai ống hoặc bình chưa hỗn dịch ban đầu theo điều kiện đã lựa chọn cho thử nghiệm (ít nhất 1 g hoặc 1 ml sản phẩm trong một thể tích xác định của môi trường tăng sinh lỏng). Khi sử dụng phương pháp màng lọc, tiến hành lọc 2 lần, ít nhất 1 ml sản phẩm và chuyển mỗi màng lọc vào một ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường tăng sinh lỏng trong điều kiện đã lựa chọn cho thử nghiệm.

...

...

...

Sau khi ủ, tiến hành phân lập trên từng ống hay bình (thử nghiệm sự phù hợp và mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật). Sử dụng que cấy vòng vô khuẩn, lấy một quai cấy hỗn dịch đã được ủ cấy lên bề mặt đĩa Petri (đường kính 85 mm -100 mm) có chứa sẵn 15 ml đến 20 ml môi trường thạch không chọn lọc. Ủ đĩa ở 32,5 °C ± 2,5 °C trong 24 h đến 48 h.

11.3.3  Giải thích các kết quả thử nghiệm tính phù hợp

Xác định lại xem nồng độ vi khuẩn hay nấm men trong hỗn dịch pha loãng cuối cùng có nằm trong khoảng 100 CFU/ml đến 500 CFU/ml.

Phương pháp trung hòa và phương pháp phát hiện là phù hợp nếu có khuẩn lạc đặc trưng8) phát triển trên đĩa kiểm tra sự phù hợp và không có khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa kiểm tra.

Khi trên đĩa kiểm tra có vi sinh vật phát triển, phương pháp trung hòa và phương pháp phát hiện là phù hợp nếu có khuẩn lạc đặc trưng của vi sinh vật thêm vào trên đĩa kiểm tra sự phù hợp (trên đĩa này có thể có cả dạng khuẩn lạc mọc trên đĩa kiểm tra).

Nếu không có khuẩn lạc đặc trưng được phát hiện trên các đĩa thử nghiệm sự phù hợp, bất kể trên đĩa kiểm tra có vi sinh vật phát triển, phương pháp trung hòa và phương pháp phát hiện là không phù hợp. Khi không thấy sự phát triển của vi sinh vật ở các đĩa kiểm tra tính phù hợp thì chứng tỏ hoạt tính kháng khuẩn vẫn còn và cần phải điều chỉnh các điều kiện của phương pháp như tăng thể tích môi trường dinh dưỡng lỏng mà vẫn giữ nguyên lượng mẫu, hoặc bằng cách kết hợp một lượng đủ tác nhân khử hoạt tính trong môi trường tăng sinh lỏng hoặc sự kết hợp các biện pháp điều chỉnh khác để vi khuẩn và nấm men phát triển được.

Nếu có sự kết hợp của các tác nhân khử hoạt tính thích hợp và sự gia tăng đáng kể thể tích của môi trường lỏng, nhưng nhưng vi sinh vật không phục hồi được số lượng như mô tả ở trên, điều này chứng tỏ rằng mẫu thử không bị nhiễm loài vi khuẩn và nấm men được thử nghiệm.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin sau:

...

...

...

b) Tất cả các thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ của sản phẩm

c) Phương pháp đã sử dụng;

d) Các kết quả đã thu được;

e) Chi tiết các bước tiến hành chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu;

f) Mô tả phương pháp với chất trung hòa và môi trường đã sử dụng;

g) Chứng minh sự phù hợp của phương pháp, ngay cả khi thử nghiệm đã được thực hiện riêng rẽ;

h) Bất kỳ điểm nào không được nêu trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn (không bắt buộc), cùng với các chi tiết về bất kỳ sự cố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

...

...

...

Sơ đồ chung cho việc định danh vi sinh vật

^a Một số loài Pseudomonas hay những loài tương đồng có thể cho phản ứng oxidase âm tính, mặc dù các kít định danh cho vi khuẩn lên men bao gồm các vi sinh vật loại này.

^b Việc định danh vi sinh gây bệnh có thể được dùng để xác định nguồn lây nhiễm trong một khu vực sản xuất hoặc để tuân thủ tiêu chuẩn nội bộ.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Môi trường khác

B.1  Môi trường tăng sinh lỏng khác

...

...

...

B.1.1.1  Thành phần

Pepton từ thịt

20,0 g

Casein thủy phân bởi pancreatin

5,0 g

Cao thịt bò

5,0 g

Cao nấm men

...

...

...

Lecithin

0,7 g

Polysorbate 80

5,0 g

Natri clorid

5,0 g

Natri bisulfit

0,1 g

Nước

...

...

...

B.1.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan hoàn toàn lần lượt polysorbate 80 và lecithin trong nước sôi. Hòa tan các thành phần còn lại vào bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

B.1.2  Môi trường casein digest-soy lecithin-polysorbate 20 lỏng (FCDLP 20)

B.1.2.1  Thành phần

Casein thủy phân bởi pancreatin

20,0 g

Lecithin đậu tương

5,0 g

Polysorbate 20

...

...

...

Nước

960 ml

B.1.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan casein thủy phân bởi pancreatin và lecithin đậu tương trong 960 ml nước, gia nhiệt trong bể điều nhiệt từ 48 °C đến 50 °C trong khoảng 30 min để hòa tan. Thêm 40 ml polysorbat 20, vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH sẽ phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

B.1.3  Môi trường soybean-casein-digest-lecithin-polysorbate 80 (SCDLP 80 lỏng)

B.1.3.1  Thành phần

Pepton casein

17,0 g

Pepton đậu tương

...

...

...

Natri clorid (NaCl)

5,0 g

Dikali hydrophotphat (K₂HPO₄)

2,5 g

Glucose

2,5 g

Lecithin

1,0 g

Polysorbate 80

...

...

...

Nước

1 000 ml

B.1.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan lần lượt tất cả các thành phần trên hoặc môi trường khô hoàn chỉnh trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH sẽ phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

B.1.4  Môi trường trung hòa D/E lỏng (Môi trường trung hòa Dey/Engley lỏng)

B.1.4.1  Thành phần

Glucose

10,0 g

Lecithin đậu tương

...

...

...

Natri thiosulfat pentahydrat (H₁₀Na₂O₈S₂)

6,0 g

Polysorbate 80

5,0 g

Casein thủy phân bởi pancreatin

5,0 g

Natri sunfit (NaHSO₃)

2,5 g

Cao nấm men

...

...

...

Natri thioglycolat (C₂H₃NaO₂S)

1,0 g

Bromcresol

0,02 g

Nước

1 000 ml

B.1.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan tất cả các thành phần trên hoặc môi trường khô hoàn chỉnh trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH sẽ phải đạt 7,6 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

B.2  Môi trường thạch không chọn lọc khác - Môi trường casein đậu tương lỏng bổ sung thạch (SCD lỏng bổ sung thạch)

...

...

...

Peptone casein

17,0 g

Peptone đậu tương

3,0 g

Natri clorid (NaCl)

5,0 g

Dikali hydrophotphat (K₂HPO₄)

2,5 g

Glucose

...

...

...

Thạch

15,0 g

Nước

1 000 ml

B.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan tất cả các thành phần trên hoặc môi trường khô hoàn chỉnh trong nước bằng cách vừa khuấy vừa đun nóng. Phân phối môi trường vào các bình có thể tích thích hợp. Hấp tiệt khuẩn ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min. Sau khi hấp và để nguội, pH sẽ phải đạt 7,3 ± 0,2 khi đo ở nhiệt độ phòng.

Phụ lục C

(Tham khảo)

...

...

...

Chất bảo quản

Hợp chất hóa học có thể trung hòa hoạt tính kháng khuẩn của chất bảo quản

Ví dụ về thành phần chất trung hòa thích hợp và các dung dịch rửa

(dùng cho phương pháp màng lọc)

Các hợp chất phenol:

Các paraben, phenoxyethanol,

Phenylethanol, v.v...

Các anilin

Lecithin,

...

...

...

Ethylen oxid ngưng tụ của cồn béo (fatty alcohol)

Chất hoạt động bề mặt không ion

30 g/l Polysorbat 80 + 3 g/l lecithin

7 g/l Ethylen oxid ngưng tụ của cồn béo + 20 g/l lecithin + 4 g/l polysorbate 80

Môi trường lỏng trung hòa D/E^a

Dung dịch rửa: nước cất vô khuẩn; 1 g/l trypton, + 9 g/l NaCl; 5 g/l polysorbat 80

Các hợp chất amoni bậc bốn

Các chất hoạt động bề mặt cation

Lecithin, saponin, polysorbat 80, natri dodecyl sulphat

...

...

...

30 g/l Polysorbat 80 + 4 g/l natri dodecyl sulphat + 3 g/l lecithin

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 3 g/l lecithin

Môi trường lỏng trung hòa D/E^a

Dung dịch rửa: nước cất vô khuẩn; 1 g/l trypton, + 9 g/l NaCl; 5 g/l polysorbat 80

Các andehit

Các chất giải phóng formaldehyd

Glycin, histidin

3 g/l Lecithin + 30 g/l polysorbat 80+1 g/l L-histidin

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 1 g/l L- histidin + 1 g/l L-cystein

...

...

...

Dung dịch rửa: nước cất vô khuẩn; 3 g/l polysorbat 80 + 0,5 g/l L-histidin

Các hợp chất oxy hóa

Natri thiosulfat

5 g/l Natri thiosulfat

Dung dịch rửa: 3 g/l Natri thiosulfat

Các isothiazolinon, imidazol

Lecithin, saponin

Các amin, sulfat, mercaptan, natri bisulfit, natri thioglycolat

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 3 g/l lecithin

...

...

...

Các biguanide

Lecithin, saponin, polysorbat 80

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l saponin + 3 g/l lecithin

Dung dịch rửa: 1 g/l trypton + 9 g/l NaCl; 5 g/l polysorbat 80

Các muối kim loại (Cu, Zn, Hg)

Các muối thủy ngân hữu cơ

Natri bisulfat, L-cystein

Các hợp chất sulfhydryl, axit thioglycolic

0,5 g/l hay 5 g/l Natri thioglycolat

...

...

...

Môi trường lỏng trung hòa D/E^a

Dung dịch rửa: 0,5 g/l Natri thioglycolat

^a Môi trường lỏng trung hòa D/E (Môi trường lỏng trung hòa Dey/Engley) - xem Phụ lục B

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ISO 16212, Cosmetics - Microbiology - enumeration of yeast and mould

[2] ISO 18416, Cosmetics - Microbiology - Detection of Candida albicans

[3] I SO 21149, Cosmetics -Microbiology - Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria

[4] ISO 21150, Cosmetics - Microbiology - Detection of Escherichia coli

...

...

...

[6] ISO 22718, Cosmetics - Microbiology - Detection of Staphylococcus aureus

[7] EN 1040, Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension test for the evaluation of basic bactericidal activity of chemical disinfectants and antiseptics - Test method and requyrements (phase 1)

[8] COLIPA, Guidelines on Microbial Quality Management, European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association (COLIPA), 1997

[9] CTFA, Microbiology Guidelines, Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, 2001, ISBN 1- 882621-32-8

[10] EP, Microbiological Examination of non-sterile products, 4^th edition, European Pharmacopoeia, 2002

[11] FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8^thedition, U.S. Food and Drug Administration, 1995, http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-23.html.

[12] JP 14, General Tests-Microbial Limit test, Japanese Pharmacopoeia, 2001

[13] USP 28, Microbial Limit test <61>, U.S. Pharmacopoeia, 2005

[14] ATLAS R.M., Handbook of Microbiological Media, CRC Press, ISBN 0-8493-2944-2, 1993

...

...

...

[16] KELLY J.P. and FUNIGIELLO F., Candida albicans: a study of media designed to promote chlamydospore production, J. Lab. & Clin. Med., 1959, 53, pp.807-809

[17] GORDON M.A. and LITTLE G.N., Effective dehydrate media with surfactants for identification of Candida albicans, J. of Int. Soc. for Human and Animal Mycol, 1963, 2, pp. 171-175

[18] ISO 29621, Cosmetics - Microbiology - Guidelines for the risk assessment and identification of microbiologically low-risk products

Mục lục

Lời nói đầu

Lời giới thiệu

1  Phạm vi áp dụng

2  Tài liệu viện dẫn

...

...

...

3.1  Sản phẩm (product)

3.2  Mẫu (sample)

3.3  Hỗn dịch ban đầu (initial suspension)

3.4  Mẫu pha loãng (sample dilution)

3.5  Vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt (Aerobic mesophilic microorganism)

3.6  Vi sinh vật chỉ định (specified microorganism)

3.7  Vi sinh vật (non-specified microorganism)

3.8  Môi trường tăng sinh lỏng (enrichment broth)

4  Nguyên tắc

...

...

...

5.1  Quy định chung

5.2  Dung dịch pha loãng hỗn dịch vi khuẩn (dung dịch tryptone natri chloride)

5.3  Môi trường nuôi cấy

6  Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

7  Các chủng vi sinh vật

8  Xử lý mẫu mỹ phẩm và mẫu thử trong phòng thí nghiệm

9  Quy trình

9.1  Khuyến cáo chung

9.2  Chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu trong môi trường tăng sinh lỏng

...

...

...

9.4  Phân lập vi sinh vật chỉ định và vi sinh vật khác

9.5  Quy trình định danh vi sinh vật chỉ định: Pseudomonas aeruginosa

9.6  Quy trình định danh vi sinh vật chỉ định: Escherichia coli

9.7  Quy trình định danh vi sinh vật chỉ định: Staphylococcus aureus

9.8  Quy trình định danh vi sinh vật chỉ định: Candida albicans

9.9  Quy trình định danh vi sinh vật khác

10  Biểu thị kết quả

10.1  Phát hiện các vi sinh vật chỉ định

10.2  Phát hiện các vi sinh vật khác

...

...

...

11  Sự trung hòa thuộc tính kháng vi sinh vật của sản phẩm

11.1  Quy định chung

11.2  Chuẩn bị hỗn dịch chủng cấy

11.3  Tính phù hợp của phương pháp phát hiện bằng môi trường tăng sinh

12  Báo cáo thử nghiệm

Phụ lục A (Tham khảo)_Sơ đồ chung cho việc định danh vi sinh vật

Phụ lục B (Tham khảo)_Môi trường khác

Phụ lục C (Tham khảo)_Các chất trung hòa hoạt tính kháng vi sinh vật của chất bảo quản và các dung dịch rửa/ lọc

Thư mục tài liệu tham khảo