Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8275-1:2010 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

5.1.3. Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng)

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25⁰C, nếu cần.

5.2. Môi trường nuôi cấy

5.2.1. Thạch dichloran-rose bengal chloramphenicol (DRBC) [3],[4]

5.2.1.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzym

5,0 g

D-Glucoza (C₆H₁₂O₆)

...

...

...

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

1,0  g

Magie sulfat (MgSO₄.H₂O)

0,5 g

Dichloran (2,6-dicloro-4-nitroanilin)

0,002 g

Rose bengal

0,025 g

Thạch

...

...

...

Chloramphenicol

0,1 g

Nước cất hoặc nước đã loại ion

1 000 ml

^a Tùy vào sức đông của thạch.

5.2.1.2. Chuẩn bị

5.2.1.2.1. Yêu cầu chung

Hòa các thành phần trên vào nước bằng cách đun sôi để hòa tan, trừ chloramphenicol. Chỉnh pH (6.4) sao cho sau khi khử trùng pH là 5,6 ± 0,2 ở 25⁰C, nếu cần.

Cho thêm 10 ml dung dịch chloramphenicol 1% (nồng độ khối lượng) trong etanol và trộn. Phân phối môi trường này vào các vật chứa có dung tích thích hợp (6.5). Khử trùng 15 min bằng hấp áp lực ở 121⁰C.

...

...

...

Để yên cho môi trường đông đặc và làm khô bề mặt thạch theo TCVN 6404 (ISO 7218) và TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các phần), nếu cần.

Sử dụng ngay hoặc bảo quản nơi tối thiểu TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các phần) cho đến khi sử dụng.

CẢNH BÁO - Không để môi trường tiếp xúc với ánh sáng, vì khi tiếp xúc với ánh sáng có thể sinh ra các sản phẩm gây độc cho tế bào làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng.

5.2.1.2.2. Phương pháp bổ sung chlortetracycline clohydric

Việc phát triển quá mức vi khuẩn có thể là một vấn đề (ví dụ: thịt tươi), do đó khuyến cáo sử dụng chloramphenicol (50 mg/l) và chlortetracycline (50 mg/l). Trong trường hợp nay, chuẩn bị môi trường cơ bản như trên nhưng chỉ sử dụng 50 mg chloramphenicol rồi phân phối các lượng 100 ml và khử trùng. Đồng thời chuẩn bị dung dịch Chlortetracycline clohydric 0,1 % (khối lượng) trong nước (vì dung dịch này không ổn định nên phải chuẩn bị ngay trước khi sử dụng) và lọc để khử trùng. Ngay trước khi sử dụng, thêm 5 ml dung dịch này một cách vô trùng vào 100 ml môi trường cơ bản và đổ ra đĩa. Không khuyến cáo sử dụng gentamicin vì việc sử dụng gentamicin cho thấy ức chế một số loài nấm men.

5.2.1.2.3. Phương án bổ sung các nguyên tố với lượng vết.

Để cho nấm mốc thể hiện hoàn toàn hình thái, cụ thể là sắc tố của chúng, thì cần đến nguyên tố với lượng vết mà có thể không có trong DRBC. Để nhận biết các nấm mốc trên môi trường này, thì thêm dung dịch nguyên tố với lượng vết sau đây với 1 ml trên 1 l môi trường, trước đó đã được hấp áp lực: 1 g ZnSO₄.7H₂O; 0,5 g CuSO₄.5H₂O; 100 ml nước cất hoặc nước đã loại ion [1].

5.2.1.2.4. Phương án bổ sung Tergitol2)

Để tránh Mucoraceae mọc quá dày trên các đĩa thạch, thì nên bổ sung Tergitol²⁾ (1 ml/l) vào môi trường nuôi cấy.

...

...

...

 5.2.1.3.1. Yêu cầu chung

DRBC là môi trường đặc. Năng suất và tính chọn lọc của môi trường cần được thử nghiệm theo TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các phần) theo các yêu cầu sau đây:

5.2.1.3.2. Năng suất

Ủ:         5 ngày 25⁰C ± 1⁰C.

Chủng:  Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763.

            Candida albicans ATCC 10231

            Aspergillus niger ATCC 16404.

            Mucor racemosus ATTC 42647

            Hoặc các chủng tương đương trong các bộ sưu tập nấm khác.

...

...

...

Phương pháp kiểm tra:  định lượng

Chuẩn cứ:                     tỷ lệ năng suất, P_R ³ 0,5.

Phản ứng đặc trưng:     Khuẩn lạc đặc trưng/chồi/mầm theo từng loài.

5.2.1.3.3. Tính chọn lọc

Ủ:         5 ngày 25⁰C ± 1⁰C.

Chủng:  Escherichia coli ATCC 25922 hoặc

            Bacillus subtilis  ATCC 6633

            hoặc các chủng tương đương trong các bộ sưu tập nấm khác.

Phương pháp kiểm tra:định tính

...

...

...

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần để thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu nó có các đặc tính kỹ thuật phù hợp.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

6.1. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 25⁰C ± 1⁰C.

6.2. Pipet xả hết, vô trùng, dung dịch danh nghĩa 1 ml, được chia vạch 0,1 ml.

6.3. Nồi cách thủy, hoặc dụng cụ tương tự, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 44⁰C đến 47⁰C.

6.4. Máy đo pH, có độ chính xác 0,1 đơn vị pH ở 25⁰C.

6.5. Chai, bình và ống nghiệm, để đun sôi và bảo quản môi trường nuôi cấy và pha loãng dung dịch.

6.6. Đĩa Petri vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

...

...

...

6.8. Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo (đường kính nhỏ hơn 2 mm và dài 80 mm). Đường kính không được vượt quá 2 mm để giảm thiểu lượng mẫu dính vào que khi kết thúc dàn mẫu.

6.9. Kính khuếch đại hai thị kính, để phân biệt các khuẩn lạc/tế bào nấm men và nấm mốc (khuếch đại từ 6,5 lần đến 50 lần).

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Mẫu phòng thử nghiệm không được làm đông lạnh.

 Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan sẽ thỏa thuận về vấn đề này.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), TCVN 6404 (ISO 7218), TCVN 6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan sẽ thỏa thuận về vấn đề này.

9. Cách tiến hành

9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng

...

...

...

Khuyến cáo sử dụng canh thang nước pepton 0,1% (5.1.3) làm dịch pha loãng, trừ việc chuẩn bị mẫu thử cụ thể. Tốt nhất nên dùng bộ kiểu nhu động để trộn mẫu hoặc dùng máy lắc.

Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet (6.2) ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy bằng một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp.

Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng để tránh các phần tử có chứa vi sinh vật lắng xuống.

9.2. Cấy và ủ

9.2.1. Dùng pipet vô trùng (6.2) chuyển 0,1 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác (Điều 8) cho vào một đĩa thạch DRBC (5.2.1).

Dùng pipet vô trùng mới để chuyển 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10^-1) (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10^-2 (sản phẩm ở dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC (5.2.1) thứ hai.

Để thuận tiện cho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, lấy các lượng đến 0,3 ml dung dịch pha loãng 10^-1 của mẫu hoặc mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên ba đĩa.

Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vô trùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng.

CHÚ THÍCH Nếu nghi ngờ có mặt nấm mốc phát triển nhanh, thì sử dụng TCVN 8275-2 (ISO 21527-2) [6].

...

...

...

Có thể sử dụng kỹ thuật cấy bằng phương pháp đổ đĩa, nhưng trong trường hợp này sự tương đương của các kết quả phải được đánh giá bằng cách so sánh với kết quả được cấy trên bề mặt đĩa và có thể không phân biệt sự khác nhau của nấm men và nấm mốc. Phương pháp cấy bề mặt có thể cho kết quả định lượng cao hơn. Kỹ thuật dàn đĩa tạo điều kiện cho các tế bào tiếp xúc tối đa với oxi của không khí và tránh mọi nguy cơ mất hoạt tính do nhiệt của các chồi nấm. Các kết quả có thể phụ thuộc vào từng loại nấm.

9.2.3. Ủ các đĩa đã chuẩn bị (9.2.2) trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thế thẳng đứng trong tủ ấm (6.1) ở 25⁰C ± 1⁰C trong 5 ngày. Để yên các đĩa thạch trong ánh sáng khuếch tán từ 1 ngày đến 2 ngày, nếu cần.

Nên ủ các đĩa (6.6) trong túi chất dẻo ở để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trong trường hợp nấm mốc lan ra ngoài đĩa.

9.3. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

Đếm các đĩa trong khoảng thời gian ủ từ 2 ngày đến 5 ngày. Chọn các đĩa (9.2.3) chứa ít hơn 150 khuẩn lạc/chồi/mầm và đếm chúng. Nếu trên các đĩa có nấm mốc quá nhanh thì có thể đếm các khuẩn lạc/chồi/mầm sau khi ủ 2 ngày và đếm lại sau khi ủ 5 ngày.

CHÚ THÍCH 1 Các phương pháp định lượng nấm men và đặc biệt là nấm mốc là không chính xác, vì chúng là một hỗn hợp của hệ sợi nấm và các bào tử vô tính và hữu tính. Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc phụ thuộc vào mức độ phân đoạn của sợi nấm và tỷ lệ các bào tử có thể mọc trên môi trường đổ đĩa.

CHÚ THÍCH 2: Thường xuất hiện sự không tuyến tính của các số đếm từ các đĩa dung dịch pha loãng; nghĩa là các dung dịch pha loãng 10 lần của mẫu thường không cho các kết quả nhỏ hơn 10 lần về số đếm khuẩn lạc thu được trên các môi trường đổ đĩa. Điều này là do sự phân đoạn của hệ sợi nấm và việc tách các cụm bào tử trong quá trình pha loãng làm ức chế cạnh tranh khi các lượng lớn khuẩn lạc có mặt trên các đĩa.

CẢNH BÁO - Các bào tử nấm mốc phân bố trong không khí rất mạnh, nên cần thao tác với các đĩa Petri cẩn thận để tránh làm phát triển các khuẩn lạc vệ tinh mà có thể cho ước tính kết quả quá cao.

Tiến hành kiểm tra bằng kính khuếch đại hai thị kính (6.9) hoặc bằng kính hiển vi (6.7) để phân biệt giữa các tế bào nấm men hoặc nấm mốc và vi khuẩn từ các khuẩn lạc, nếu cần.

...

...

...

Để nhận biết nấm men và nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thích hợp.

10. Biểu thị kết quả và giới hạn tin cậy

Xem TCVN 6404 (ISO 7218)

Ghi lại các khuẩn lạc nấm men và các khuẩn lạc/chồi nấm mốc riêng rẽ, nếu cần.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ các thông tin dưới đây:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

...

...

...

e) kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] BELL, C., NEAVES, P., WILLIAMS, A.P. Food microbiology and laboratory practice, Blackwell, Oxford, 2005. 324 p.

[2] BEUCHAT, L.R. Media for detecting and enumerating yeasts and moulds. In: CORRY, J.E.L., CURTIS, G.D.W., BAIRD, R.M., editors. Handbook of culture media for food microbiology, pp. 369-386, Elsevier, Amsterdam, 2003. (Progress in industrial microbiology, Vol 37)

[3] BEUCHAT, L.R., FRANDBERG, E., DEAK, T., ALZAMORA, S.M., CHEN, J., GUERRERO, A.S., LOPEZ-MALO, A., OHLSSON, I., OLSEN, M., PEINADO, J.M., SCHNURER, J., DE SILONIZ, M.I., TORNAI-L.EHOCZKI, J. (2001) Performance of mycoiogical media in enumerating desiccated food spoilage yeasts: An interlaboratory study. Int. J. Food Microbiol, 2001, 70, pp.89-96.

[4] KINGJR, A.D., HOCKING, A.D., PITT, J.I. (1979) Dichloran-rose bengal medium for enumeration and isolation of molds from foods. Appl. Environ. Microbiol. 1979, 37, pp.959-964.

[5] TCVN 8184-6:2009 (ISO 6107-6:2004), Chất lượng nước - Thuật ngữ - Phần 6.

[6] TCVN 8275-2 (ISO 21527-2), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định hướng nấm men và nấm mốc - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95.

...

...

...

2) Đây là một ví dụ của sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và ISO không ấn định phải sử dung sản phẩm này.