Thuộc tính
Nội dung
Tiếng Anh (English)
Văn bản gốc/PDF
Lược đồ
Liên quan hiệu lực
Liên quan nội dung
Thuộc tính
Tải về
Các bản dự thảo

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7715-3:2013 về Vi sinh vật trong thực phẩm - định lượng Campylobacter spp. - Phần 3

Số hiệu:	TCVN7715-3:2013	Loại văn bản:	Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành:	***	Người ký:	***
Ngày ban hành:	Năm 2013	Ngày hiệu lực:
ICS:	07.100.30	Tình trạng:	Đã biết

Hình thái học (9.5.3)	trực khuẩn uốn cong nhỏ
Tính di động (9.5.3)	đặc trưng
Mọc trong điều kiện vi hiếu khí ở 25⁰C (9.5.4)	-
Mọc trong điều kiện vi hiếu khí ở 41,5⁰C (9.5.5.)	-
Oxidase (9.5.6)	+

Có mặt Campylobacter spp. nếu có ít nhất một khuẩn lạc cho thấy các đặc trưng ở trên.

9.6. Nhận biết Campylobacter spp. (tùy chọn)

9.6.1. Yêu cầu chung

Trong số các Campylobacter spp. phát triển ở 41,5⁰C, thường gặp nhất là C. jejuni và C.coli. Tuy nhiên, các loài khác thường gặp đã mô tả (C. lari, C. upsaliensis và một số loài khác); các đặc trưng được nêu trong Bảng 2 cho phép phân biệt chúng.

Đặc trưng

C. jejuni

C. coli

C. lari

C. upsaliensis

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

- hoặc nhẹ

Axit nalidixic (9.6.3)

S^a

R/S^b

...

Thủy phân hipurat (9.6.4)

+^c

...

Chú dẫn: + là dương tính; S là nhạy; R là bền và - là âm tính.

^aCho thấy tăng bền với axit nalidixic của các chủng C.jejuni và C.coli.

^b Tồn tại các chủng C. lari vừa nhạy vừa bền.

^c Tồn tại các chủng C. jejuni âm tính với hipurat.

9.6.2. Phát hiện catalase

...

Phép thử được coi là dương tính nếu bọt bong bóng xuất hiện trong vòng 30s.

Khẳng định các kết quả sử dụng các kiểm chứng dương tính và âm tính. Các ví dụ về các chứng kiểm chứng thích hợp là Staphylococcus aureus NCTC 8532 (kiểm chứng dương tính), Enterococus faecalis NCTC 775 (kiểm chứng âm tính).

9.6.3. Phát hiện độ nhạy với axit nalidixic và cephalotin

Dùng vòng cấy (6.11) lấy từng khuẩn lạc được chọn trong 9.5.2.2 để chuẩn bị huyền phù trong canh thang Brucella (5.4.2) ở mật độ 0,5 trên thang McFarland.

Pha loãng huyền phù này với tỷ lệ 1/10 sử dụng cùng một canh thang.

Phủ ngập một lớp huyền phù lên bề mặt đĩa thạch huyết Hinton Mueller 5% thể tích (5.4.6).

Để cho tiếp xúc 5 min, sau đó để ráo huyền phù.

Sấy khô đĩa 10 min trong tủ sấy (6.2) duy trì ở 37⁰C trong 10 min.

Đặt đĩa axit nalidixic và đĩa cephalotin (5.4.7) lên mặt thạch.

...

Diễn giải kết quả về sự phát triển vi khuẩn như sau:

- phát hiện trong vùng tiếp xúc với đĩa được phân loại là bền với axit nalidixic và cephalotin;

- có mặt một vùng ức chế với mọi kích cỡ được phân loại là nhạy cảm với axit nalidixic và cephalotin;

9.6.4. Phát hiện thủy phân hipurat

Đối với mỗi khuẩn lạc được chọn trong 9.5.2.2, sử dụng vòng cấy (6.11) lấy một vòng dịch cấy để chuẩn bị huyền phù trong ống phân giải huyết (6.7) chứa 0,4 ml dung dịch natri hipurat (5.4.5), chú ý không được để lẫn thạch.

Lắc để trộn kỹ và ủ 2 h trong nồi cách thủy (6.4) để ở 37⁰C hoặc ủ 4h trong tủ ấm ở 37⁰C.

Cẩn thận thêm 0,2 ml dung dịch ninhydrin (5.4.5) lên đỉnh của dung dịch natri hipurat. Không lắc.

Diễn giải kết quả sau khi ủ thêm 10 min trên nồi cách thủy (6.4) ở 37⁰C hoặc để trong tủ ấm ở 37⁰C.

Màu tín đậm chứng tỏ phản ứng dương tính.

...

Khẳng định các kết quả sử dụng các kiểm chứng dương tính và âm tính. Ví dụ về các chứng kiểm chứng thích hợp là C. jejuni NCTC 11351 (kiểm chứng dương tính), C.coli NCTC 11366 (kiểm chứng âm tính).

9.6.5. Phát hiện thủy phân indoxyl axetat

Cho một khuẩn lạc được chọn trong 9.5.2.2 lên đĩa indoxyl axetat (5.4.8) và thêm một giọt nước cất vô trùng. Để phản ứng được rõ ràng, cần sử dụng một vòng đầy các khuẩn lạc.

Nếu indoxyl axetat bị thủy phân thì màu sắc sẽ chuyển sang xanh đậm trong 5 min đến 10 min. Nếu màu sắc không đổi chứng tỏ sự thủy phân không xảy ra.

Khẳng định các kết quả sử dụng các kiểm chứng dương tính và âm tính. Các ví dụ về các chủng kiểm chứng thích hợp là C. jejuni NCTC 11351 (kiểm chứng dương tính), C. lari NCTC 11352 (kiểm chứng âm tính)

9.6.6. Diễn giải

Campylobacter spp. phát triển ở 41,5⁰C có thể được nhận biết ở mức loài dựa vào Bảng 2.

10. Tính và biểu thị kết quả

10.1. Phương pháp tính

...

Sử dụng phương pháp phân bố Poison để ước tính dải nồng độ phù hợp với các kết quả. Ví dụ: nếu nồng độ đúng là 0,005 cfu/g thì có 5% cơ hội tìm thấy kết quả dương tính đối với độ pha loãng 10¹. Nếu nồng độ đúng là 3 cfu/g thì có 95% cơ hội tìm thấy kết quả dương tính đối với độ pha loãng 10⁰. Do đó, nếu kết quả dương tính quan sát được đối với độ pha loãng 10⁰ và 10¹ và các độ pha loãng cao hơn là âm tính thì nồng độ đúng có khả năng nằm trong khoảng từ 0,005 cfu/g đến 3 cfu/g.

Bảng 3 - Các khoảng kết quả đối với các dây pha loãng

Khối lượng
g

Sự phát triển của Campylobacter spp. được khẳng định

10¹

...

10⁰

...

10-¹

10-²

...

10^-3

...

10^-4

...

MPN/g

0,23

2,3

230

2 400

...

T₀

0,019

0,19

1,9

190

580

T₁

...

2,7

270

2 700

30 000

Nếu tất cả các phép thử là âm tính, kết quả phải được ghi là MPN = 0/g (giới hạn tin cậy trên, T₁ 0,33/g); nếu tất cả các phép thử là dương tính thì các kết quả phải được ghi là MPN = ¥ (giới hạn tin cậy dưới, T₀ 580/g).

10.2. Độ chụm

Một nghiên cứu cộng tác quốc tế đã tổ chức năm 2005 do Ủy ban phân tích Thực phẩm Bắc Âu (NMKL) thực hiện phép xác định bán định lượng Campylobacter spp. theo tiêu chuẩn này. Nghiên cứu này gồm có 14 phòng thử nghiệm tham gia và tiến hành trên thịt gà nguyên liệu và sữa. Các mẫu thực phẩm đã được thử nghiệm ở các mức nhiễm khác nhau, cộng với kiểm soát âm tính. Độ nhạy của phương pháp bán định lượng là 100%. Độ nhạy tổng thể của phương pháp là 82,1%. Độ nhạy để phát hiện Campylobacter spp. trong sữa thấp hơn đối với thịt gà. Hiệu quả định lượng của phương pháp đối với Campylobacter spp. trong thịt gà quan sát được trong nghiên cứu công tác này phù hợp với dải nồng độ nêu trong Bảng 3.

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

b) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) môi trường tăng sinh lỏng đã sử dụng;

d) môi trường phân lập đã sử dụng;

e) nhiệt độ ủ đã chọn;

f) các kết quả thử nghiệm thu được;

g) mọi chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn, cũng như mọi chi tiết bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

h) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

...

PHỤ LỤC A

(Quy định)

SƠ ĐỒ QUY TRÌNH

Hình A.1 - Sơ đồ quy trình

PHỤ LỤC B

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THUỐC THỬ

...

B.1.1. Môi trường cơ bản

B.1.1.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym 10,0 g

Lactalbumin hydrolysat 5,0 g

Chất chiết nấm men 5,0 g

Natri clorua 5,0 g

Natri pyruvat 0,5 g

Natri metabisulphit 0,5 g

Natri cacbonat 0,6 g

...

Haemin (được hòa tan trong natri hydroxit 0,1% khối lượng) 0,01 g

Nước 1 000 ml

B.1.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun sôi, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH của môi trường hoàn chỉnh là 7,4 ± 0,2 ở 25⁰C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản vào các bình cầu có dung tích thích hợp. Khử trùng môi trường 15 min ở 121⁰C trong nồi hấp áp lực (6.1)

B.1.2. Huyết ngựa đã khử fibrin phân giải vô trùng

Sử dụng huyết ngựa đã phân giải saponin hoặc được phân giải bằng cấp đông rồi rã đông.

B.1.3. Thành phần dung dịch kháng sinh

B.1.3.1. Thành phần

Xefoperazon 0,02 g

...

Trimetoprim lactat 0,02 g

Amphoterixin B 0,01 g

Hỗn hợp etanol và nước cất: 1 ¸ 1 (thể tích) 5 ml

B.1.4. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong hỗn hợp của etanol và nước cất tỷ lệ 1:1.

B.1.5. Môi trường hoàn chỉnh

B.1.5.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.1.1) 1 000 ml

Huyết ngựa đã khử fibrin phân giải vô trùng (B.1.2) 50 ml

...

B.1.5.2. Chuẩn bị

Bổ sung huyết một cách vô trùng vào môi trường cơ bản ở nhiệt độ dưới 50⁰C, tiếp theo đến dung dịch kháng sinh và trộn. Phân phối môi trường này một cách vô trùng vào các ống hoặc các bình có dung tích thích hợp (xem 9.2.2) để thu được các phần cần thiết cho phép thử. Nếu môi trường tăng sinh đã được chuẩn bị trước thì môi trường này không được để quá 4h ở nhiệt độ phòng, hoặc nếu bảo quản ở nơi tối với nhiệt độ 3⁰C ± 2⁰C thì không quá 7 ngày.

B.1.6. Thử hiệu năng

Thử hiệu năng của canh thang Bolton (B.1.5.1) theo các phương pháp và các tiêu chí trong TCVN 8128-2 (ISO/TS 11133-2). Các ví dụ về các chủng kiểm chứng thích hợp là C.jejuni NCTC 11351 hoặc ATCC 33291 với các tiêu chí sau: > 10 khuẩn lạc trên thạch mCCD (5.3) sau khi ủ vi hiếu khí ở 41,5⁰C trong 44h ± 4h.

B.2. Thạch deoxycolat xefoperazon than cải biến (mCCD)

B.2.1. Môi trường cơ bản

B.2.1.1. Thành phần

Chất chiết từ thịt 10,0 g

Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym 10,0 g

...

Than củi 4,0 g

Dịch thủy phân casein bằng enzym 3,0 g

Natri deoxycolat 1,0 g

Sắt (II) sulfat 0,25 g

Natri pyruvat 0,25 g

Thạch 8,0 g đến 18,0 g^a

Nước 1 000 ml

^a Tùy vào độ đông của thạch.

B.2.1.2. Chuẩn bị

...

B.2.2. Dung dịch kháng sinh

B.2.2.1. Thành phần

Xefoperazon 0,032 g

Amphoterixin 0,01 g

Nước 5 ml

B.2.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước. Lọc để khử trùng.

B.2.3. Môi trường hoàn chỉnh

B.2.3.1. Thành phần

...

Dung dịch kháng sinh (B.2.2) 5 ml

B.2.3.2. Chuẩn bị

Cho dung dịch kháng sinh vào môi trường cơ bản, làm nguội đến 47⁰C đến 50⁰C sau đó trộn cẩn thận. Rót khoảng 15 ml môi trường hoàn chỉnh vào các đĩa Petri vô trùng. Để cho đông đặc. Ngay trước khi sử dụng, làm khô cẩn thận các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch úp xuống phía dưới, để vào tủ sấy (6.2) trong 30 min hoặc cho đến khi bề mặt thạch khô. Nếu đã chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa khô không để quá 4h ở nhiệt độ phòng, hoặc nếu bảo quản ở nơi tối với nhiệt độ 3⁰C ± 2⁰C thì không quá 7 ngày.

B.2.4. Thử hiệu năng

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1). Đối với các tiêu chí thực hiện, xem Bảng B.5 của TCVN 8128-2:2009 (ISO/TC 11133-2:2003).

B.3. Thạch huyết Columbia

B.3.1. Môi trường cơ bản

B.3.1.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym 23,0 g

...

Natri clorua 5,0 g

Thạch 8,0 g đến 18,0 g^a

Nước 1 000 ml

^a Tùy vào độ đông của thạch.

B.3.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun nóng. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,3 ± 0,2 ở 25⁰C. nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản vào bình cầu có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121⁰C.

B.3.2. Huyết cừu vô trùng đã khử fibrin

B.3.3. Môi trường hoàn chỉnh

B.3.3.1. Thành phần

...

Huyết cừu vô trùng đã khử fibrin (B.3.2) 5 ml

B.3.3.2. Chuẩn bị

Cho huyết một cách vô trùng vào môi trường cơ bản, làm nguội đến 47⁰C đến 50⁰C sau đó trộn. Rót khoảng 15 ml môi trường hoàn chỉnh vào các đĩa Petri vô trùng. Để cho đông đặc. Ngay trước khi sử dụng, làm khô cẩn thận các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch úp xuống phía dưới, để 30 min trong tủ sấy (6.2) hoặc cho đến khi bề mặt thạch khô. Nếu đã chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa khô không để quá 4 h ở nhiệt độ phòng, hoặc nếu bảo quản ở nơi tối với nhiệt độ 3⁰C ± 2⁰C thì không quá 7 ngày.

B.4. Canh thang Brucella

B.4.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym 10,0 g

Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym 10,0 g

Glucose 1,0 g

Chất chiết nấm men 2,0 g

...

Natri hidrosulfit 0,1 g

Nước 1 000 ml

B.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25⁰C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản này với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121⁰C.

B.5. Thuốc thử phát hiện oxidase

B.5.1. Thành phần

N,N,N',N'-Tetrametyl-1,4-phenylenediamin dihydro clorua 1,0 g

Nước 100 ml

B.5.2. Chuẩn bị

...

B.6. Thuốc thử phát hiện thủy phân hipurat

B.6.1. Dung dịch natri hipurat

B.6.1.1. Thành phần

Natri hipurat 10 g

Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) bao gồm:

Natri clorua 8,5 g

Dinatri hydrophosphat ngậm hai phần tử nước (Na₂HPO₄.2H₂O) 8,98 g

Natri dihydrophosphat ngậm một phần tử nước (NaH₂PO₄.H₂O) 2,71 g

Nước 1 000 ml

...

Hòa tan natri hipurat trong dung dịch PBS. Lọc để khử trùng. Phân phối thuốc thử một cách vô trùng với các lượng 0,4 ml vào các ống nghiệm nhỏ có dung tích thích hợp (6.7). Bảo quản ở khoảng -20⁰C.

B.6.2. Dung dịch ninhydrin, 3,5% (khối lượng/thể tích)

B.6.2.1. Thành phần

Ninhydrin 1,75 g

Axeton 25 ml

Butanol 25 ml

B.6.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan ninhydrin trong hỗn hợp axeton/butanol. Bảo quản dung dịch nơi tối trong tủ lạnh tối đa 1 tuần.

B.7. Thạch huyết Hinton Mueller

...

B.7.1.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym 6,0 g

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym 17,5 g

Tinh bột, có thể hòa tan 1,5 g

Thạch 8,0 g đến 18,0 g^a

Nước 1 000 ml

^a Tùy thuộc vào độ đông của thạch.

B.7.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun hết sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,3 ± 0,2 ở 25⁰C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản này vào các bình cầu có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121⁰C.

...

B.7.3. Môi trường hoàn chỉnh

B.7.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.7.1) 1 000 ml

Huyết cừu vô trùng đã khử fibrin (B.7.2) 50 ml

B.7.3.2. Chuẩn bị

Cho huyết một cách vô trùng vào môi trường cơ bản, làm nguội đến nhiệt độ trong khoảng từ 47⁰C đến 50⁰C sau đó trộn đều. Rót khoảng 15 ml môi trường hoàn chỉnh vào các đĩa Petri vô trùng. Để cho đông đặc. Ngay trước khi sử dụng, làm khô cẩn thận các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch úp xuống phía dưới, để vào tủ sấy (6.2) trong 30 min hoặc cho đến khi bề mặt thạch khô. Nếu đã chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa khô không để quá 4 h ở nhiệt độ phòng, hoặc nếu bảo quản ở nơi tối với nhiệt độ 3⁰C ± 2⁰C thì không quá 7 ngày.

B.8. Đĩa indoxyl axetat

B.8.1. Thành phần

Indoxyl axetat 0,1 g

...

B.8.2. Chuẩn bị

Hòa tan indoxyl axetat trong axeton. Thêm từ 25 ml đến 50 ml dung dịch này vào các đĩa giấy trống (đường kính đĩa từ 6 mm đến 12 mm). Sau khi để khô ở nhiệt độ phòng, bảo quản các đĩa này ở 3⁰C ± 2⁰C trong ống nghiệm hoặc chai màu nâu có chứa silica gel.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 7150 (ISO 835) Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet chia độ

[2] TCVN 7152 (ISO 7712) Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet Pasteur sử dụng một lần

[3] NKML Method No. 119, Thermotolerant Campylobacter - Detection, semi-quantitative and quantitative determination in foods and drinking water. Available (2009-06-09) from: http://shop.nmkl.org

[4] BAYLIS C.L., MACPHEE, S., MARTIN, K.W., HUMPHREY, T.J., BETTS, R.P. Comparison of three enrichment media for the isolation of Campylobacter spp. From foods, J. Appl. Microbiol. 2000, 89, pp.884-891

[5] BOLTON, F.J., HUTCHINSON, D.N., COATES, D. Blood-free selective medium for isolation of Campylobacter jejuni from feces. J. Clin. Microbiol. 1984, 19, pp.169-171

...

[7] CORRY, J.E.I., CURTIS, G.D.W., BAIRD, R.IV., editors. Handbook off culture media for food microbiology. Elsevier, Amsterdam, 2003 (Progress in industrial microbiology, Vol. 37).

[8] HUTCHINSON, D.N., BONTOL, F.J. Improved blood free selective medium for the isolation of Campylobacter jejuni from faecal specimens. J.Clin. Pathol. 1984, 37, pp. 956-957

[9] JOSEFSEN, M.H., LÜBECK, P.S., AALBAEK, B., HOORFAR, J. Preston and Park-Sanders protocols adapted for semi-quantitative isolation of thermotolerant Campylobacter from chicken rinse. Int. J. Food Microbiol. 2003, 80, pp.177-183.

[10] ROSENQUIST, H. BENGTSSON, A., HANSEN, T.B. A collaborative study on a Nordic standard protocol for detection and enumeration of thermotolerant Campylobacter in food (NMKL 119, 3. Ed., 2007). Int. J. Food Microbiol. 2007, 118, pp.201-213.