Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6686-2:2007 Sữa - Định lượng tế bào xôma - vận hành máy đếm huỳnh quang

• Số hiệu: TCVN6686-2:2007
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2007

Loại sữa	Phạm vi Tế bào/ml
Sữa bò (của cả đàn)	Từ 100000 đến 1000000
Sữa bò (của từng con vật)	Từ 100000 đến 2000000
Sữa dê	Từ 200000 đến 2000000
Sữa cừu	Từ 100000 đến 2000000
Sữa trâu	Từ 100000 đến 2000000

Việc hiệu chuẩn cần được kiểm tra ít nhất một tháng một lần.

6.2.2. Kiểm tra độ tuyến tính

Mối liên quan giữa các số đọc của thiết bị và các giá trị đối chứng cần phải tuyến tính trong phạm vi đo có liên quan của số đếm tế bào xôma. Sai lệch khỏi tuyến tính có thể xuất phát từ các tín hiệu không đặc thù và tác động ngẫu nhiên.

Trước hết là kiểm tra độ tuyến tính theo bề ngoài bằng cách sử dụng các con số thích hợp sao cho thu được một bức tranh rõ nét về hình đạng của mối quan hệ. Khi có bằng chứng về sự trệch khỏi tuyến tính, thì sử dụng thông số định lượng như phép kiểm tra để nhận dạng mà không quan tâm đến chiều hướng quan sát được có thể chấp nhận được hay không.

Để thực hiện điều đó, có thể sử dụng sữa có số đếm tế bào cao đã được pha loãng hàng loạt với sữa có số đếm thấp, tạo thành một dãy ít nhất năm mẫu bao trùm dải nồng độ.

Đo sữa có số đếm cao và sữa có số đếm thấp theo điều 8 ít nhất là bốn lần giống nhau và tính kết quả trung bình cho từng mẫu. Tính các giá trị đối với mẫu trung gian từ tỷ lệ hỗn hợp trên mẫu đã dùng đưa đến giá trị mong đợi đối với mỗi mẫu. sau đó, đo tất cả các mẫu theo điều 8 ít nhất là bốn lần giống nhau và tính kết quả trung bình cho từng mẫu, tương đương với giá trị đo được đối với một mẫu.

Sử dụng hồi qui tuyến tính với các giá trị dự đoán trên mẫu trên trục x và các giá trị đo được trên mẫu trên trục y. Tính e_i = y_i – (bx_i + a) từ đường hồi qui. Dựng đồ thị các giá trị e_i (trục y) và các giá trị dự đoán (trục x). Việc kiểm tra bằng mắt thường các điểm thường sẽ cho đủ thông tin về độ tuyến tính của tín hiệu. Mọi điểm nằm ngoài sẽ dẫn đến loại bỏ kết quả và tính toán lại trước khi thử nghiệm tiếp.

Khi được quan sát, độ cong có thể được biểu thị bằng tỷ số, r_c, sử dụng công thức sau đây:

...

...

...

e_max là giá trị số dư tối đa từ đường hồi qui;

e_min là giá trị số dư tối thiểu từ đường hồi qui;

M_max là giá trị trên đo được đối với loạt mẫu liên quan;

M_min là giá trị dưới đo được đối với loạt mẫu liên quan.

Tỷ lệ r_c, phải nhỏ hơn 2 %. Nếu giá trị này bị loại bỏ, thì có thể thu được hiệu suất tốt hơn bằng cách thực hiện các phép hiệu chuẩn riêng rẽ đối với các phạm vi đếm riêng biệt.

CHÚ THÍCH: Nhìn chung, có thể kết hợp việc kiểm tra tuyến tính qui định với việc hiệu chuẩn.

7. Lấy mẫu

Mẫu được gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Các điểm cụ thể được liệt kê trong 5.2 đến 5.6.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

...

...

...

Trước khi phân tích, mẫu thử (5.2.2 hoặc 5.2.3) cần được làm nóng từ từ đến 40 °C ± 3 °C và cần được trộn bằng cách đảo chiều hộp chứa mẫu. Mẫu thử có thể được giữ ở nhiệt độ phòng cho đến khi thử nghiệm, với điều kiện là các mẫu đó được thử nghiệm trong vòng 30 min khi đã đạt tới 40 °C ± 3 °C. Mẫu cần được trộn kỹ lại ngay trước khi thử nghiệm.

Đo mẫu thử theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị.

CHÚ THÍCH: Đối với một vài loại thiết bị, việc kéo dài thời gian đếm là tùy ý, trùng khớp với việc làm giảm hệ số làm việc (xem 5.9). Điều này có thể tăng độ lặp lại và độ chính xác của phép đo.

9. Kiểm tra hiệu suất trong vận hành thông thường

9.1. Kiểm tra mẫu trắng

Kiểm tra mẫu trắng có nghĩa là kiểm tra sự nhiễm bẩn của đường ống trong toàn bộ thiết bị. Trước khi bắt đầu, cần kiểm tra mẫu trắng ít nhất năm lần.

Giá trị trung bình không được vượt quá 3000 tế bào/ml và tất cả các kết quả riêng lẻ cần phải nhỏ hơn 8000 tế bào/ml.

Trong phép thử thông thường, tối đa là sau 100 mẫu hoặc cứ sau 2 h cần tiến hành kiểm tra mẫu trắng.

9.2. Ảnh hưởng của việc mang sang

...

...

...

Trong đó

B₁ là số đọc được của mẫu trắng thứ nhất;

B₂ là số đọc được của mẫu trắng thứ hai;

M là số đọc được của mẫu thử.

Ảnh hưởng của việc mang sang phải nhỏ hơn 2 %.

Nhìn chung, giá trị ảnh hưởng của việc mang sang tính được có thể được bù tự động khi thử nghiệm các mẫu thông thường.

CHÚ THÍCH: Trong một vài loại thiết bị, ảnh hưởng của việc mang sang có thể xuất hiện giữa các mẫu không liên tiếp, ví dụ khi sử dụng bánh xe có các cốc ủ ấm.

9.3. Tỷ lệ giữa thể tích thuốc thử và thể tích mẫu thử

...

...

...

Sau khi cân, tỷ lệ này có thể tính được. Tỷ lệ này cần thống nhất với giá trị qui định trong khoảng ± 5 %.

9.4. Kiểm tra thí điểm

9.4.1. Khái quát

Phép đo các mẫu thí điểm với các giá trị sữa thí điểm ấn định là để kiểm tra sự ổn định của thiết bị trong thời gian ngắn. Sử dụng mẫu sữa thí điểm với các số đếm tế bào xôma trung bình và cao (> 2 x trung bình) trong phạm vi đếm có liên quan.

9.4.2. Sữa thí điểm

Để thu được sữa thí điểm thích hợp, thì có thể áp dụng qui trình chuẩn bị chất chuẩn (xem 6.1). Một qui trình thay thế là lựa chọn các mẫu thử thích hợp từ các mẻ được phân tích thường lệ và chuẩn bị tiếp theo của các loại sữa đã gộp lại có bổ sung chất bảo quản thích hợp (xem 5.3). Bảo quản các mẫu này ở nhiệt độ từ 0 °C đến 6 °C cho đến khi sử dụng. Tránh làm đông lạnh các mẫu sữa thí điểm. Cũng cần phải ghi lại thời gian sử dụng các mẫu chưa bảo quản thường được giới hạn từ một đến hai ngày sau khi chuẩn bị.

9.4.3. Chỉ định các giá trị sữa thí điểm

Phân tích ít nhất 10 mẫu thí điểm hai lần giống nhau trên thiết bị đã hiệu chuẩn. Tính giới hạn lặp lại r từ các kết quả thu được theo ISO 8196-2. Với điều kiện là giá trị tính được thấp hơn giá trị độ lặp lại mục tiêu trong 11.1, tính giá trị trung bình của các kết quả thu được và chỉ định giá trị này là giá trị thí điểm.

9.4.4. Sử dụng các mẫu sữa thí điểm

...

...

...

Đối với việc kiểm soát sự ổn định thiết bị, có thể sử dụng đồ thị kiểm soát theo ISO 8196-2. Do đó, giá trị chỉ định đối với sữa thí điểm được coi như giá trị chuẩn. Cần có hành động thích hợp nếu một hoặc nhiều giá trị thu được nằm ngoài các giới hạn đối với kết quả riêng lẻ hoặc giá trị trung bình.

9.5. Giám sát thêm thiết bị

Một số nhà sản xuất thiết bị cung cấp các mẫu hạt nhân tạo để hỗ trợ trong việc giám sát thiết bị hàng ngày.

9.6. Độ lặp lại

Trước mỗi ngày làm việc cần kiểm tra độ lặp lại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Có thể sử dụng các mẫu sữa thí điểm.

Khi kiểm tra thường lệ các lượng lớn mẫu thử bằng thiết bị có công suất cao, thì khi bắt đầu nên thực hiện 10 phép xác định lặp lại hai lần trong mẫu thí điểm. Vả lại, nên kiểm tra 20 mẫu thử riêng lẻ khác nhau hai lần giống hệt nhau trong các mẻ chạy liên tiếp tại các khoảng đều đặn, ví dụ: mỗi tuần một lần.

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại cần được tính theo ISO 8196-2. Cần có hành động thích hợp nếu giá trị thu được lớn hơn giá trị qui định trong 11.1.

9.7. Độ tái lập trong phòng thử nghiệm

Đối với các thiết bị cần cùng một hệ thống hiệu chuẩn, điển hình là trong một phòng thử nghiệm có một vài thiết bị, thì độ tái lập (11.2) trong phòng thử nghiệm cần được kiểm tra.

...

...

...

Có thể dùng các kết quả sữa thí điểm riêng lẻ có sẵn từ việc kiểm tra độ lặp lại (xem 9.6) để kiểm tra độ tái lập trong phòng thử nghiệm. Cần có hành động thích hợp nếu giá trị thu được lớn hơn giá trị qui định trong 11.2.

9.8. So sánh bên ngoài

Sự tham gia trong các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm theo ISO Guide 43-1 ít nhất hai lần trong một năm như là một phần của hệ thống đảm bảo chất lượng đối với việc đếm tế bào xôma bằng huỳnh quang điện tử. Số lượng các đơn vị tham gia cần nhỏ hơn 10. Phạm vi đếm liên quan cần bao trùm ít nhất 10 mẫu, được cung cấp cho phép phân tích lặp lại hai lần, hai mẫu được lấy từ mỗi chai mẫu.

10. Nhận xét cụ thể về sử dụng sữa từ các loài khác nhau

10.1. Khái quát

Nên kiểm tra việc không bị ảnh hưởng đáng kể của chất béo và protein, ví dụ: bằng cách cho thêm cream và phần còn lại sau khi siêu lọc.

Nếu quan sát thấy có ảnh hưởng đáng kể, thì chỉnh thiết bị và/hoặc qui trình đếm theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị.

Có thể cần phải điều chỉnh như sau:

a) pha loãng sơ bộ mẫu thử;

...

...

...

c) điều chỉnh lượng dung dịch đệm/dung dịch thuốc nhuộm;

d) thay đổi nhiệt độ mẫu thử;

e) kéo dài thời gian đi qua cuvet dòng;

f) điều chỉnh việc xử lý chính xác phân bố chiều cao xung thu được.

10.2. Sữa bò

Đối với các giống bò cho sữa có hàm lượng chất béo và protein cao, thì kiểm tra khả năng gây cản trở cho việc đếm tế bào xôma.

10.3. Sữa dê

Lượng tế bào xôma trong sữa dê nhỏ hơn nhiều so với sữa bò. Tế bào bổ sung, như các hạt dạng tế bào chất có thể tạo thêm tạp. Điều này cần chú ý đặc biệt để phân biệt đúng. Tuy nhiên, tùy thuộc vào thiết bị và nếu hàm lượng chất rắn tổng số không quá cao, thì sữa dê có thể được phân tích sử dụng máy đếm huỳnh quang điện tử dùng đường hiệu chuẩn của sữa bò, với điều kiện là phạm vi số đếm tế bào xôma có liên quan đã bao trùm trong dây hiệu chuẩn [4].

Số đếm tế bào xôma trong sữa dê và sự biến thiên của chúng, ví dụ, giai đoạn lấy sữa, nhìn chung cao hơn so với sữa bò và ít bị ảnh hưởng bởi tình trạng sức khỏe của động vật cho sữa.

...

...

...

Trong quá trình xử lý số đếm bằng huỳnh quang điện tử, các tế bào xôma trong sữa cừu có biểu hiện bên ngoài giống với sữa bò. Tùy thuộc vào loại thiết bị và nếu hàm lượng chất rắn tổng số không quá cao, thì có thể phân tích sữa cừu trên các máy đếm bằng huỳnh quang điện tử sử dụng đường hiệu chuẩn của sữa bò, với điều kiện là phạm vi số đếm tế bào xôma có liên quan đã bao trùm trong dãy hiệu chuẩn [4].

Số đếm tế bào xôma trong sữa cừu có thể ở mức tương tự như trong sữa bò nhưng cũng có thể cao hơn.

10.5. Sữa trâu

Trong quá trình xử lý số đếm bằng huỳnh quang điện tử, các tế bào xôma trong sữa trâu có biểu hiện bên ngoài giống với sữa bò. Hàm lượng chất béo và protein có thể cao hơn đáng kể, cần kiểm tra về khả năng gây nhiễu và việc điều chỉnh cần thiết.

11. Độ chụm

CHÚ THÍCH: Các giá trị đã nêu về độ chụm được liệt kê dưới đây từ nghiên cứu trên sữa bò. Các giá trị về sữa được lấy từ các loài khác có thể kém thích hợp.

11.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả thu được của hai lần thử nghiệm độc lập riêng rẽ (r), thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, phân tích trên cùng nguyên liệu, do cùng một người tiến hành trong cùng một phòng thử nghiệm, dùng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn các giá trị được nêu trong bảng 2.

Bảng 2 – Giá trị độ lặp lại

...

...

...

tế bào/ml

s_r

%

r

tế bào/ml

150000

6

25000

300000

...

...

...

42000

450000

4

50000

750000

3

63000

1500000

3

...

...

...

11.2. Độ tái lập trong phòng thử nghiệm

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai lần thử nghiệm độc lập riêng rẽ (R_intra), thu được sử dụng cùng một phương pháp, phân tích trên nguyên liệu giống hệt nhau, do các người khác nhau phân tích, tiến hành trong cùng phòng thí nghiệm, dùng các thiết bị khác nhau, ở các thời điểm khác nhau (trong vòng vài giờ), không quá 5 % các trường hợp lớn hơn các giá trị nêu trong bảng 3.

Bảng 3 – Giá trị độ tái lập trong phòng thử nghiệm

Mức số đếm tế bào

tế bào/ml

s_{R intra}

%

R_intra

tế bào/ml

...

...

...

7

29000

300000

6

50000

450000

5

63000

750000

...

...

...

84000

1500000

4

168000

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thu được của hai lần thử nghiệm độc lập riêng rẽ (R), thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, phân tích trên nguyên liệu thử giống hệt nhau, do các người khác nhau thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn các giá trị được nêu trong bảng 4.

Bảng 4 – Giá trị độ lặp lại

Mức số đếm tế bào

tế bào/ml

...

...

...

%

R

tế bào/ml

150000

9

38000

300000

8

67000

...

...

...

7

88000

750000

6

126000

1500000

6

252000

12. Báo cáo thử nghiệm

...

...

...

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) ngày lấy mẫu;

d) kiểu loại mẫu;

e) phương pháp thử đã dùng;

f) mọi chi tiết thao tác sai lệch so với qui định trong tiêu chuẩn này mà có thể ảnh hưởng tới kết quả;

g) kết quả thu được tính theo đơn vị hàng nghìn tế bào trên mililit hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] Programme FAIR 1 CT 95-0881:2002, Strategies de contrôle en fermes des comptage de cellules somatiques du lait de brebis et de chervre.