Thuộc tính
Nội dung
Tiếng Anh (English)
Văn bản gốc/PDF
Lược đồ
Liên quan hiệu lực
Liên quan nội dung
Thuộc tính
Tải về

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6505-1:2007 Sữa và sản phẩm sữa - Định lượng Escherichia coli giả định

Số hiệu:	TCVN6505-1:2007	Loại văn bản:	Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành:	***	Người ký:	***
Ngày ban hành:	Năm 2007	Ngày hiệu lực:
ICS:	07.100.30, 67.100.01	Tình trạng:	Đã biết

	a) Môi trường nồng độ kép	b) Môi trường nồng độ đơn
Tryptoza	40,0 g	20,0 g
Lactoza	10,0 g	5,0 g
Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄)	5,5 g	2,75 g
Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)	5,5 g	2,75 g
Natri clorua	10,0 g	5,0 g
Natri lauryl sunfat [CH₃(CH₂)₁₁OSO₃Na]	0,2 g	0,1 g
4-Metylumbelliferyl--D-glucuronit (MUG)	0,2 g	0,1 g
Tryptophan	2,0 g	1,0 g
Nước	1 000 ml	1 000 ml

5.3.1.2. Chuẩn bị

Hoà tan trong nước các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô, đun sôi khi cần.

Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 6,8, ở nhiệt độ 25 ^oC.

Phân phối môi trường này theo từng lượng 10 ml vào các ống nghiệm có kích thước 16 mm x 160 mm (6.2) có chứa ống Durham lộn ngược (6.3) trong trường hợp môi trường nồng độ đơn và phân phối vào các ống nghiệm có kích thước 20 mm x 200 mm (6.2) có chứa ống Durham lộn ngược (6.3) trong trường hợp môi trường nồng độ kép.

Khử trùng 15 phút ở nhiệt độ 121 ^oC trong nồi hấp áp lực (6.1).

Ống Durham lộn ngược không được chứa bọt khí sau khi khử trùng.

5.4. Thuốc thử indol (thuốc thử Kovacs)

5.4.1. Thành phần

4-Dimetylaminobenzaldehyt

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

2-Metylbutan-1-ol hoặc pentan-1-ol

75,0 ml

Axit clohydric (p₂₀ từ 1,18 g/ml đến 1,19 g/ml)

25,0 ml

5.4.2. Chuẩn bị

Hoà tan 4-Dimetylaminobenzaldehyt trong cồn bằng cách đun nhẹ đến khoảng từ 50 ^oC đến 55 ^oC trong nồi cách thuỷ (6.5).

Để nguội và thêm axit clohydric.

Bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ khoảng 4 ^oC. Màu sắc của thuốc thử phải có màu vàng sáng đến màu nâu sáng.

5.5. Dung dịch natri hydroxit. c(NaOH) » 0.5 mol/l.

...

Natri hydroxit

2 g

Nước

100 ml

5.5.2. Chuẩn bị

Hoà tan natri hydroxit trong nước.

6. Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh

Đối với các yêu cầu chung, xem TCVN 6404 (ISO 7218) và TCVN 6263 (ISO 8261). Dụng cụ thuỷ tinh phải bền khi khử trùng lại.

Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể là:

...

Về chi tiết xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.2. Ống nghiệm, có kích thước 16 mm x 160 mm và 20 mm x 200 mm, hoặc bình cầu hoặc chai có dung tích thích hợp.

Trước khi sử dụng cần kiểm tra các ống nghiệm để biết chắc các ống không tự phát huỳnh quang.

6.3. Ống Durham, có kích thước thích hợp cho việc sử dụng trong ống nghiệm (6.2).

6.4. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 30 ^oC ± 1^oC ở bất kỳ điểm nào trong tủ.

6.5. Nồi cách thuỷ, có thể duy trì nhiệt độ từ 50 ^oC đến 55 ^oC.

6.6. Đèn cực tím (UV) sóng dài, có bước sóng từ 360 nm đến 366 nm, tốt nhất là để trong tủ UV hoặc trong phòng tối, hoặc được bọc trong hộp cactông đảm bảo điều kiện tối.

CHÚ THÍCH Đèn tia cực tím uv sóng ngắn không thích hợp cho việc sử dụng

6.7. pH-met, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 ^oC.

...

6.9. Máy trộn Vortex.

7. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị thay đổi hoặc suy giảm chất lượng trong quá trình bảo quản và vận chuyển.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707)

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6263 (ISO 8261).

9. Cách tiến hành

9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) và các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, theo TCVN 6263 (ISO 8261).

...

9.2. Cấy môi trường tăng sinh chọn lọc

9.2.1. Lấy ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh nồng độ kép [5.3.1.1 a)]. Dùng pipet vô trùng (6.8) cho vào mỗi ống 10 ml mẫu thử dạng lỏng, hoặc 10 ml huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) mẫu thử dạng khác.

9.2.2. Lấy ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh nồng độ đơn [5.3.1.1 b)]. Dùng một pipet (6.8) vô trùng cho vào mỗi ống 1 ml mẫu thử dạng lỏng, hoặc 1 ml huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) khi mẫu thử dạng khác.

9.2.3. Đối với mỗi một dung dịch pha loãng tiếp theo, tiến hành theo qui định trong 9.2.2. Sử dụng một pipet vô trùng mới cho mỗi độ pha loãng.

9.2.4. Trộn cẩn thận chất cấy với môi trường bằng cách dùng bộ trộn (6.9). Tránh tạo bọt khí vào trong ống Durham (6.3).

9.3. Nuôi ấm

Nuôi ấm các ống nghiệm đã cấy (từ 9.2.1 đến 9.2.3) trong tủ ấm (6.4) ở 30 ^oC trong 24 giờ ± 2 giờ. Nếu ở giai đoạn này không quan sát thấy sinh khí thì nuôi ấm tiếp đến 48 giờ ± 2 giờ.

9.4 Thử khẳng định về E.coli giả định

Tiến hành thử khẳng định đối với E.coli giả định trên tất cả các ống nghiệm đã nuôi ấm như trong 9.3.

...

Màu đỏ trong pha cồn cho thấy sự có mặt của indol (ống dương tính).

9.5. Giải thích

9.5.1. Thử nghiệm về E.coli giả định

Nhận biết các ống nghiệm đã được cấy ban đầu theo 9.2.1 đến 9.2.3, cho thấy có phát huỳnh quang và sinh indol trong 9.4 là các ống dương tính có E.coli giả định.

Đếm số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng.

9.5.2. Thử nghiệm về coliform

Nhận biết các ống nghiệm đã được cấy theo 9.2.1 đến 9.2.3, cho thấy sinh khí trong 9.3 là các ống dương tính có coliform giả định.

Đếm số ống dương tính đối vối mỗi độ pha loãng.

10. Chọn độ pha loãng

...

10.1. Đối với mỗi mẫu cần kiểm tra, chọn ba độ pha loãng liên tiếp theo 10.2, 10.3 hoặc 10.4 để thu được chỉ số MPN.

10.2. Trong trường hợp khi chỉ có ba độ pha loãng, thì sử dụng cả ba độ pha loãng này để thu được chỉ số MPN.

10.3. Trong trường hợp có nhiều hơn ba độ pha loãng, việc chọn ba độ pha loãng như thế sẽ cho các tổ hợp có các xác suất khác nhau. Điều này có thể biểu thị trong các cấp hạng trong bảng A.1 (phụ lục A). Giải thích các cấp hạng này được đưa ra trong bảng A.2 ( phụ lục A).

10.4. Chọn tổ hợp của ba độ pha loãng liên tiếp với cấp hạng 1 để thu được chỉ số MPN; nếu thu được nhiều hơn một tổ hợp với cấp hạng 1 thì sử dụng tổ hợp có số ống dương tính lớn nhất.

Nếu không có tổ hợp với cấp hạng 1 thích hợp, sử dụng một tổ hợp với cấp hạng 2; nếu thu được nhiều hơn một tổ hợp với cấp hạng 2 thì sử dụng tổ hợp có số ống dương tính lớn nhất (xem ví dụ ở Bảng 1).

Nếu không có tổ hợp với cấp hạng 2 thích hợp, sử dụng một tổ hợp với cấp hạng 3; nếu thu được nhiều hơn một tổ hợp với cấp hạng 3 thì sử dụng tổ hợp có số ống dương tính lớn nhất (xem ví dụ ở bảng 1).

Bảng 1 – Ví dụ về cách chọn các kết quả dương tính để tính giá trị MPN

Ví dụ

Số ống nghiệm dương tính thu được từ ba ống nghiệm nuôi ấm đã cấy các lượng mẫu/ống sau đây^a

...

Sản phẩm dạng lỏng 10 ml 1 ml 10^-1 ml 10^-² ml 10^-³ ml Các sản phẩm khác 1 g 10^-¹ g 10^-² g 10^-3 g 10^-⁴ g

Sản phẩm dạng lỏng ml^-¹

Sản phẩm dạng khác g^-1

...

1,1 X 10¹

1,1 X 10²

...

2,4 X 10²

7,4

...

2,4

2,4 X 10¹

...

2,1 X 10^-1

2,1

a Chữ in đậm: tổ hợp được chọn.

...

11. Xác dịnh, tính và biểu thị kết quả

11.1. Xác định chỉ số MPN [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]

11.1.1. Xác định chỉ số MPN của E.coli giả định từ số ống nghiệm khẳng định dương tính (9.5.1) đối với mỗi độ pha loãng đã chọn (điều 10), sử dụng bảng A.1 (phụ lục A).

11.1.2. Xác định chỉ số MPN của coliform từ số ống nghiệm khẳng định dương tính (9.5.2) đối với mỗi độ pha loãng đã chọn (điều 10), sử dụng bảng A.1 (phụ lục A).

11.2. Tính số có xác xuất lớn nhất (MPN) [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]

Nhân chỉ số MPN (11.1) với tỷ lệ nghịch của độ pha loãng thấp nhất được chọn (nghĩa là có nồng độ mẫu thử cao nhất) cho ra số có xác suất lớn nhất (MPN) của E.coli và/hoặc coliform có trong 1 mililit hoặc trong 1 gam sản phẩm.

Khi độ pha loãng thấp nhất được chọn tương ứng với các ống đã cấy với môi trường nồng độ kép (cấy vào 10 ml) thì trước hết chia chỉ số MPN cho 10.

CHÚ THÍCH Việc chia chỉ số MPN cho 10 chỉ cần thiết đối với sản phẩm dạng lỏng, khi phân phối 10 ml mẫu thử sang ống nghiệm chứa môi trường nồng độ kép. Còn đối với sản phẩm dạng khác, thì chuyển 10 ml huyền phù ban đầu chứa 1 g mẫu thử vào ống nghiệm chứa môi trường nồng độ kép.

11.3. Biểu thị kết quả

...

Nếu MPN nhỏ hơn 0,3 E.coli giả định hoặc coliform giả định trong 1 mililit hoặc trong 1 gam và nếu sử dụng qui trình thích hợp đối với số E.coli giả định hoặc coliform giả định có số lượng thấp, thì kết quả được biểu thị như sau: “Không có E.coli hoặc coliform giả định trong 1 ml hoăc trong 1 g sản phẩm”.

12. Độ chụm

Thực nghiệm cho thấy rằng khi sử dụng kỹ thuật MPN kết quả có thể xảy ra sai số lớn. Do đó, phải thận trọng khi sử dụng các kết quả thu được bằng phương pháp này. Các giới hạn tin cậy được đưa ra trong bảng A.1 (phụ lục A).

13. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các chi tiết về điều kiện thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tuỳ ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

...

Phụ lục A

(qui định)

Xác định số có xác suất lớn nhất

Bảng A.1 - Chỉ số MPN và các giới hạn tin cậy

Số lượng ống dương tính

Chỉ số MPN^a

Cấp hạng ^b

Giới hạn tin cậy ở mức 95 % ^a,^c

...

Dưới

Trên

< 0,30

...

0,94

0,30

0,01

0,95

...

0,30

0,01

1,00

0,61

...

0,12

1,70

0,62

0,12

1,70

...

0,94

0,35

3,50

...

0,02

1,70

0,72

0,12

...

1,1

0,4

3,5

...

0,74

0,13

2,00

1,1

...

3,5

1,1

0,4

3,5

...

1,5

0,5

3,8

1,6

...

0,5

3,8

0,92

0,15

3,50

...

1,4

0,4

3,5

...

0,5

3,8

1,5

0,4

...

2,0

0,5

3,8

...

2,7

0,9

9,4

2,1

...

4,0

2,8

0,9

9,4

...

3,5

0,9

9,4

2,9

...

0,9

9,4

3,6

0,9

9,4

...

2,3

0,5

9,4

...

0,9

10,4

6,4

1,6

...

4,3

0,9

18,1

...

7,5

1,7

19,9

...

9,3

1,8

36,0

...

110

400

...

> 110

a Từ Tài liệu tham khảo [4]

b Xem Bảng A.2

c Các giới hạn tin cậy đưa ra trong bảng này là chỉ đưa ra một số ý kiến của ảnh hưởng sai số thống kê lên kết quả. Tuy nhiên vẫn có các nguồn gốc sai số khác đôi khi còn quan trọng hơn

Bảng A.2 - Giải thích các cấp hạng về các kết quả

Cấp hạng ^a

...

Khi số lượng vi khuẩn trong mẫu thử bằng số MPN tìm được, thì kết quả nằm trong số các khả năng cao nhất thu được. Hầu như chỉ có 5 % khả năng nhận được kết quả nhỏ hơn giá trị nhỏ nhất ở cấp hạng này.

Khi số lượng vi khuẩn trong mẫu thử bằng số MPN tìm được, thì kết quả là một trong số khả năng nhận được ít hơn cả số có khả năng xảy ra nhỏ nhất trong cấp hạng 1, nhưng tối đa chỉ có 1 % khả năng thu được một kết quả có thể thấp hơn kết quả nhỏ nhất có thể xảy ra ở cấp hạng này.

Khi số lượng vi khuẩn trong mẫu thử bằng số MPN tìm được, thì kết quả là một trong số có khả năng nhận được ít hơn cả giá trị nhỏ nhất trong cấp hạng 2, nhưng tối đa chỉ có 0,1 % khả năng thu được một kết quả có thể thấp hơn giá trị nhỏ nhất ở cấp hạng này.

Khi số lượng vi khuẩn trong mẫu thử bằng số MPN tìm được, thì kết quả là một trong số có khả năng nhận được ít hơn cả giá trị nhỏ nhất trong cấp hạng 3, chỉ có 0,1 % khả năng thu được một kết quả ở cấp hạng này, nếu như không có một sai sót nào.

a Trước khi bắt đầu thử nghiệm, cần quyết định xem cấp hạng nào sẽ được chấp nhận, nghĩa là: chỉ cấp hạng 1, 1 và 2 hoặc thậm chí 1, 2 và 3. Nếu quyết định dựa trên các kết quả có tầm quan trọng, thì chỉ chấp nhận kết quả của cấp hạng 1 hoặc tối đa kết quả của cấp hạng 1 và cấp hạng 2. Kết quả của cấp hạng 0 cần được xem xét hết sức cẩn thận.

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] TCVN 4882 (ISO 4831) Vi sinh vật học. Hướng dẫn chung về định lượng coliform. Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất.

[3] TCVN 6846:2007 (ISO 7251:2005) Vi sinh vật học - Hướng dẫn chung về định lượng E.coli giả định. Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất.

[4] De Man, J.C., Eur.J.Appl. Biotechnol., 17,1983, pp. 301-305.