PHƯƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾM KHÍ
Meat and meat products. Enumeration
of total aerobic bacteria
Tiêu chuẩn này quy
định phương pháp xác định tổng số
vi khuẩn hiếu khí trên 1cm bề mặt sản phẩm
và trong 1g cho các loại thịt và sản phẩm chế
biến từ thịt trừ đồ hộp thịt.
1. Xác định tổng
số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2
1.1
Nguyên
tắc
Phương pháp xác
định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2,
bề mặt sản phẩm được áp dụng
để đánh giá độ nhiễm khuẩn trên bề
mặt các sản phẩm thịt bằng phương pháp
đếm số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí có
trên 1cm mẫu thử đã được chuyển tương
đương với 1ml dung dịch huyền phù ban
đầu dưới các điều kiện thử
được xác định trong tiêu chuẩn này.
1.2
Lấy
mấu theo TCVN 5153 – 90 và TCVN 4886 – 89.
1.3
Thiết
bị và dụng cụ
-
Giấy
thấm vô khuẩn, kích thước 2 x 2 hoặc 5 x 5 cm;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
-
Bi thuỷ
tinh vô khuẩn, có đường kính phù hợp;
-
Tăm
bông;
-
Kẹp
gắn kim loại;
-
Ống
nghiệm 18 x 180mm;
-
Cốc
đong các loại;
-
Bình tam giác
các loại;
-
Bình
định mức dung tích 100, 500 và 1000 ml;
-
Pipét 1,0 và
100ml, chia độ tới 0,1ml;
-
Đĩa
petri có đường kính trong 90 – 100mm;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
-
Tủ
ấm điều chỉnh được ở 30 ± 10C;
-
Tủ
sấy khô;
-
Tủ
hấp ướt;
-
Bếp cách
thuỷ điều chỉnh được từ 30
đến 560C;
-
Cân phân tích;
-
Máy
đo pH;
-
Kính lúp phóng
đại từ 3 đến 5 lần;
-
Hộp
đếm khuẩn lạc;
-
Bếp
điện;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1.4
Hoá chất
và môi trường
1.4.1 Hoá chất
- Nước cất
- Natriclorua, tinh khiết phân
tích (TKPT)
- Dinatri hydro phot phat (Na2HPO4),
TKPT;
- Kalidihydro photphat (KH2PO4),
TKPT;
- Thạch dùng cho vi sinh
vật
- Trypton dùng cho vi sinh vật
- Glucaza.TKPT
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Pepton dùng cho vi sinh vật
.
1.4.2 Môi trường
a) Nước muối sinh
lý
- Thành phần: Natriclorua 8,5g;
- Nước cất,
đủ 100ml;
- Cách pha chế:
Hoà tan muối trong
nước, tiệt khuẩn trong nồi hấp ở 1200
C trong 15 phút.
b) Dung dịch đệm
pepton
- Thành phần: Pepton 10g;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dinatrihydro phophat 9g;
Kalidihydro phophat 1,5g;
Nước cất,
đủ 1000ml.
- Cách pha chế:
Đun sôi để hoà tan
các chất trên, để nguội. Điều chỉnh
độ pH bằng natrihydroxit 0,1N sao cho sau khi tiệt
khuẩn pH ở 250C là 7,0±0,2. Rót 100ml môi trường vào bình dung tích 250ml và 10 ml
vào một ống nghiệm. Tiệt khuẩn trong nồi
hấp ở nhiệt độ 120 ± 10C trong 15 phút. Nếu không dùng ngay, môi
trường cần được bảo quản nơi
khô ráo, tối ở nhiệt độ từ 0 đến
+ 50C và không quá 30 ngày.
c) Thạch trypten glucoza
- Thành phần: Trypton 5g;
- Cao men 2,5g
- Glucoza 1g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Nước cất,
đủ 100ml
- Cách pha chế:
Vừa đun nhỏ
lửa vừa khuấy nhẹ để hoà tan các chất
đến khi dung dịch sôi. Điều chỉnh pH sao cho
sau khi tiệt trùng pH ở 250 là 7,0 ± 0,2. Rót môi trường vào bình với
lượng môi trường không quá 1/2 dung tích mỗi bình.
Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt
độ 120 ± 10C trong 15 phút.
Để nguội trong nồi cách thuỷ tới 45 ± 10C để sử dụng.
Nếu chưa dùng ngay cần bảo quản môi
trường ở nơi khô ráo, tối, ở 0 đến
+ 50 và không quá 30 ngày. Trước khi dùng, đun cách
thuỷ cho chảy môi trường và để nguội
trong nồi cách thuỷ tớ 45 ± 10C.
d) Thạch màng
- Thành phần: Thạch 12
– 18g
- Nước cất,
đủ 100ml
- Cách pha chế:
Vừa đun nhỏ
lửa vừa khuấy nhẹ để hoà tan thạch
đến khi sôi, điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt
khuẩn pH ở 250C là 7,0 ± 0,2. Rót môi trường với
lượng 4ml vào mỗi ống nghiệm và 100 ml vào
mỗi bình tiệt khuẩn, sử dụng và bảo
quản nôi trường như mục C.
1.5
Trình tự
xác định
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a) Dùng giấy thấm vô
khuẩn (1.3) được làm ướt trước
bằng nước muối sinh lý và có tổng diện tích
là 100cm (gồm 4 mảnh 5 x 5 cm hoặc 25 mảnh 2 x 2 cm)
dán lên các vị trí khác nhau của bề mặt mẫu (1.2)
cần dám sao cho toàn bộ diện tích giấy thấm
tiếp xúc trực tiếp với bề mặt mẫu.
Sau 2 phút, chuyển toàn bộ số giấy thấm trên vào
ống nghiệm đã chứa sẵn 10 ml dung dịch
đệm pepton.
Có thể chuẩn bị
mẫu theo cách: áp các khung kim loại vô khuẩn có kích
thước tương tự (1.3) lên bề mặt
mẫu ở các vị trí khác nhau với tổng diện tích
là 100cm2 ( 4 lần với khung 5 x 5 cm hoặc 25
lần với khung 2 x 2cm). Nhẹ nhàng quét đầu
tăm bông đã được thấm ẩm bằng
nước muối sinh lý lên toàn bộ diện tích đã
được khung kim loại giới hạn. Cchuyển
toàn bộ số lên đầu tăm bông trên vào ống
nghiệm chữa sẵn 10ml dung dịch đệm pepton.
Các ống nghiệm chứa mẫu có thể
được bảo quản ở 0 đến + 20 trong
vòng 6h.
b) Chuyển toàn bộ
lượng mẫu trong ống nghiệm vào bình tam giác dung
tích 100 ml chứa khoảng 10 viên bi thuỷ tinh vô khuẩn.
Tráng ống nghiệm chứa mẫu bằng dung dịch
đệm pepton và đổ cả vào bình chứa mẫu,
lắc nhẹ cho giấy thấm hoặc bông tan vụn,
sau đó cho thêm dụch dịch đệm pepton tới
khoảng 100ml
c) Để lắng
hoặc tiến hành ly tâm dung dịch mẫu khoảng 5 phút
ở tốc độ 200 vòng/ phút. Gạn lấy lớp
dng dịch trong vào bình định mức dung tích 100ml và cho
thêm dung dịch đệm pepton tới vạch mức 100ml
(tương đương với 100cm2 bề
mặt mẫu được chuẩn bị). Dung dịch
này được gọi là dung dịch huyền phù ban
đầu. Cần tiến hành kiểm tra ngay sau khi
chuẩn bị xong dung dịch, nếu chưa kiểm tra,
dung dịch cần được bảo quản ở 0
đến + 50C nhưng không quá 1h.
1.5.2 Pha loãng mẫu
Dùng dung dịch
đệm tepton ( mục b điều 1.4.2) để pha
loãng dung dịch huyền phù ban đầu theo tỉ lệ
1/9 tới các độ pha loãng thập phân khác nhau (10-1,
10-2…10n). Cần căn cứ mức
độ nhiễm khuẩn của mẫu để
tiến hành pha loãng dung dịch mẫu tới các độ
pha loãng phù hợp.
1.5.3 Tiến hành nuôi cấy
a) Với mỗi mẫu
phải nuối cấy ít nhất 3 độ pha loãng liên
tiếp, mỗi độ pha loãng nuối cấy 2
đĩa, phải dùng pipet riêng trong mỗi độ pha
loãng.
b) Dùng pipet khác nhau lấy 1
ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho
vào giữa các đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa
khoảng 15 ml môi trường thạch trypton glucoza (mục
c điều 1.4.2). Lắc vòng tròn 5 lần theo chiều kim đồng
hồ và 5 lần ngược lai để trộn
đều môi trường và dung dịch mẫu.
Đặt các đĩa chứa môi trường trên
mặt phẳng ngang sao cho môi trường đông tự
nhiên. Thời gian từ khi pha loãng mẫu (1.5.2) đến
khi nuôi cấy xong không quá 20 phút.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
d) Khi môi trường đã
đông, lật úp các đĩa peptri và đặt vào tủ
ấm đã duy trì ở 30 ± 10C
trong 72 h.
1.6 Tính kết quả
1.6.1 Cứ sau 24h
đếm sơ bộ số khuẩn lạc đã
mọc và sau 72h đếm chính thức để tính
kết quả.
Chỉ tính kết
quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa
là hợp lý với mối tương quan nghịch
giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc
trên đó.
Dùng mắt
thường hoặc kính lúp để đếm số
khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa petri, chỉ
đếm những đĩa có số khuẩn lạc
mọc riêng biệt và từ 15 đến 300 khuẩn
lạc.
Đếm tất
cả số khuẩn lạc mọc trong mỗi
đĩa, trong trường hợp số lượng
khuẩn lạc lớn và phân bố đều, có thể
phần đáy đĩa theo đường kính thành các
phần đều nhau có bội số là 2 để
đếm một phần sau đó nhân kết quả
với tổng số phần đã chia.
1.6.2 Tổng số vi
khuẩn hiếu khí trên 1cm2 mẫu thử ( X1)
được quy ra tổng số vi khuẩn hiếu khí
có trong 1ml dung dịch huyền phù ban đầu của
mẫu thử được tính ở 2 độ pha loãng
liên tiếp, mỗi độ pha loãng gồm 2 đĩa
theo công thức sau:
X1 =
Trong đó:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
n1 - số lượng
đĩa ở độ pha loãng thứ nhất
được đếm;
nz - số lượng
đĩa ở độ pha loãng thứ hai
được đếm;
d - hệ số pha loãng ứng với
độ pha loãng thứ nhất được
đếm.
Kết quả
được làm tròn tới số hàng nghìn và biều
thị dưới dạng tích của một số
thập phân hai chữ số ( 1,0 ….9,9) với 10n (
n= số chữ số nguyên của kết qủa trừ
1).
Thí dụ: Hai
đĩa ở độ pha loãng thứ nhất
được đếm ( 10-2) có số khuẩn
lạc là 168 và 215;
Hai đĩa ở
độ pha loãng liên tiếp thứ hai được
đếm ( 10-3) có số khuẩn lạc là 14 và
25.
X1 =
Kết qủa 19182
được làm tròn thành 19000 và được biểu
thị dưới dạng 1,9 x 102 khuẩn
lạc/cm2.
1.6.3 Nếu các
đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp có số
khuẩn lạc từ 15 đến 30, tính số khuẩn
lạc của mỗi độ pha loãng và kết quả là
trung bình số học của hai giá trị thu
được. Lấy trường hợp tỷ số
của giá trị cao so với giá trị thấp lớn
hơn hai lấy giá trị thấp là kết quả.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1.6.5 Nếu hai
đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu
đều không có khuẩn lạc nào, kết quả là: ít
hơn 1 vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2 bề
mặt sản phẩm.
2. Xác định
tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 g
2.1 Nguyên tắc
Tổng số vi
khuẩn hiếu khí có trong 1 g mẫu được tính
theo phương pháp đếm số khuẩn lạc vi
khuẩn hiếu khí quy ra 10ml dung dịch huyền phù ban đầu
dưới các điều kiện xác định của
tiêu chuẩn này.
2.2 Lấy mẫu, theo TCVN 5153
–90
2.3 Thiết bị và dụng
cụ, xem điều 1.3
2.4 Hoá chất và môi
trường, xem điều 1.4
2.5 Trình tự xác định
2.5.1 Chuẩn bị
mẫu, theo TCVN 4887 – 89
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2.5.2 Pha loãng mẫu, theo
điều 1.5.2
2.5.3 Tiến hành nuôi
cấy, theo các mục a, b, c điều 1.5.3
2.6 Tính kết quả
Cách đếm
khuẩn lạc, tính toán và biểu thị kết quả
theo các điều 1.6.1; 1.6.2 và 1.6.3.
2.6.1 Nếu 2
đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu
đều có số khuẩn lạc thấp hơn 15,
lấy trung bình số học m của chúng và kết
quả X2 được tính:
X2 = m x
(d là hệ số pha
loãng của dịch huyền phù ban đầu bằng 10-1).
2.6.2 Nếu 2
đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu
đều không có khuẩn lạc nào, kết quả X2
được tính:
X2< 1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66