TIÊU CHUẨN VIỆT
NAM
TCVN
5155:1990
THỊT
VÀ SẢN PHẨM CỦA THỊT
PHƯƠNG
PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM SỐ
Escherichia Coli
Cơ quan biên soạn: Trung tâm kiểm dịch động
vật xuất nhập khẩu Hà Nội
Cơ quan đề nghị ban hành: Bộ Nông nghiệp và
Công nghiệp Thực phẩm
Cơ quan trình duyệt: Tổng cục Tiêu chuẩn-Đo
lường-Chất lượng
Cơ quan xét duyệt và ban hành: Uỷ ban Khoa
học Nhà nước
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
TCVN 5155-90
THỊT VÀ SẢN PHẨM CỦA
THỊT
PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
VÀ ĐẾM SỐ ESCHEPICHIA COLI
Meat and meat
producst Detection and enumaration of Escherichia Coli
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp phát hiện
và đếm số E.Coli trong 1g và trên 100cm2 thịt và sản phẩm của thịt
dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn cho gia súc.
1. Đặc tính chung.
Vi khuẩn hình gậy, mập, ngắn, gran dương,
kích thước 0,4-0,7 x 13 micrômét, không có nha bào, không có giáp mô.
Vi khuẩn có những đặc tính sinh hoá được quy
định kiểm nghiệm trong tiêu chuẩn này.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Căn cứ vào đặc tính sinh hoá để xác định vi
khuẩn. Pha loãng mẫu thử ở các đậm độ khác nhau ria cấy lên môi trường chọn lọc
để đếm và tính số vi khuẩn.
3. Lấy mẫu: Theo TCVN
5153-90.
4. Thiết bị và dụng
cụ: Theo TCVN 5153-90.
5. Môi trường, thuốc
thử:
5.1. Phải dùng các loại hoá chất tinh khiết
phân tích, nên sử dụng các thành phần cơ bản hoặc đã chế sẵn, khi dùng phải
theo chỉ dẫn của nơi sản xuất. Môi trường thuốc thử phải bảo quản ở nơi tối,
nhiệt độ 40C không quá 1 tháng. Định kỳ kiểm tra lại môi trường,
thuốc thử bằng giống vi khuẩn tiêu chuẩn.
5.2. Môi trường, thuốc thử (phụ lục A).
5.2.1. Môi trường nước thịt.
5.2.2. Môi trường thạch deoxycholat.
5.2.3. Môi trường thạch Macconkey.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.5. Môi trường nước pepton glucose (để thử
phản ứng đỏ methyl và Voges-Proskauer).
5.2.6. Môi trường thạch Simmon xitrat.
5.2.7. Môi trường thử Indol (dung dịch
Kowacs).
5.2.8. Thuốc thử đỏ methil (M.R.).
5.2.9. Thuốc thử Voges - Proskauer (dung dịch
Barritt).
6. Các tiến hành.
6.1 Yêu cầu chung: Các dụng cụ, môi trường, thuốc
thử v.v… và thao tác phải vô khuẩn.
6.2. Chuẩn bị mẫu thử: Thịt lạnh đông phải
giải đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng cho đến khi đạt 13-150C, đồ hộp
phải cọ rửa sạch vỏ ngoài, ủ 370C từ 5-7 ngày.
6.3. Chế huyễn phù ban đầu.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.3.2. Để đếm số vi khuẩn trên 100cm2
sản phẩm: Dùng những miếng giấy thấm vô khuẩn, có kích thước 5 x 5 cm đã được
làm ướt bằng nước muối đẳng trương rồi dán lên bề mặt sản phẩm ở các vị trí
khác nhau từ 4-8 miếng (100-200cm2). Sau 2 phút chuyển toàn bộ số
giấy thấm vào bình đã đựng sẵn 10-20ml môi trường nước thịt và 10-15 viên bi
thuỷ tinh. Lắc cho tan giấy tuỳ theo khối lượng mẫu thử cần sử dụng mà pha
loãng thành 1:1 (1ml tương đương với 1m2).
6.4. Đếm số vi khuẩn: Từ huyền phù ban đầu
(6.3.) tiếp tục pha loãng 10 lần (10-1, 10-2, 10-3)
tuỳ mức nhiễm khuẩn mà quyết định. Mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa môi trường thạch
deoxycholt hoặc Macconkey một khối lượng bằng nhau trong khoảng từ 0,1 - 1ml
(tuỳ mức nhiễm khuẩn mà quyết định), dàn đều trên mặt thạch hoặc trộn đều trong
thạch nóng lỏng ở 450C, đặt sấp đĩa môi trường, ủ 370C.
Đọc kết quả 2 lần vào 24 giờ và 48 giờ.
Khuẩn lạc E.Coli to, đục, mặt khô, mầu đỏ.
Căc cứ vào hình dạng, mầu sắc mà đếm; chon 5
khuẩn lạc để giám định tiếp tính chất sinh hoá và xác định tỷ lệ (phụ lục B).
6.5. Thử các phản ứng IMViC.
6.5.1. Phản ứng Indol: Phương pháp theo TCVN
5153 - 90 E.Coli có phản ứng dương tính, lớp thuốc thử trên mặt môi trường có
màu đỏ.
Chú thích: E.Coli không điển hình (atypic) có
phản ứng âm tính: mầu vàng nhạt.
6.5.2. Phản ứng đỏ methyl (methyl red): Cấy
vi khuẩn (6.4) vào môi trường nước pepton glucos, ủ 370C từ 2-4
ngày, nhỏ 5 giọt thuốc thử đỏ methyl vào , đọc kết quả: E.Coli có phản ứng
dương tính: mầu đỏ (âm tính: mầu vàng).
6.5.3. Phản ứng Voges - Proskauer: Phương
pháp theo TCVN 5153-90.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.5.4. Trên môi trường thạch Simmon xitrat:
Ria cấy vi khuẩn (6.4) trên mặt thạch nghiêng, ủ 370C từ 1-3 ngày
E.Coli không sinh trưởng (-).
7. Tính toán kết quả.
7.1. Căn cứ vào kết quả giám định tính chất
sinh hoá.
7.2. Căn cứ vào công thức dưới đây để tính số
E.Coli trong 1 gam hoặc trên 100cm2 sản phẩm.
Xgam = số khuẩn lạc
đếm được x
1
x
1
khối lượng nuôi cấy
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
X100gam=100 x số khuẩn
lạc đếm x
1
x
1
khối lượng nuôi cấy
bội số pha loãng
mẫu thử
PHỤ
LỤC A
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A1. Môi trường nước thịt: Theo phụ lục B TCVN
5153-90.
A2. Môi trường thạch deoxycholat:
- Pepton 10g
- Thạch 18-20g
- Natri deoxycholat 1g
- Natri clorua 5g
- Kalihydro phophat (K2HPO4) 2g
- Lactos 10g
- Sắt xitrat 2g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Nước cất 1.000ml
A.3 Môi trường thạch macconkey
- Pepton 20g
- Thạch 18-20g
- Natri clorua 5g
- Lactos 10g
- Muối mật 5g
- Dung dịch cồn đỏ trung tính 0,1% 5ml
- Nước cất 1.000ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A4. Môi trường nước pepton: Theo phụ lục B
TCVN 5153-90.
A5. Môi trường nước pepton-glucose: Theo phụ
lục B TCVN 5153-90
A6. Môi trường thạch Simmon-xitrat:
- Ammonium dihydrophotphat (NH4H2PO4) 1g
- Magiê - sulphat (MgSO4) 0,2g
- Kalihydro photphat (K2HPO4) 1g
- Natri xitrat (Na3C6H5O7.2H2O) 2,3g
- Natri clorua (NaCl) 5g
- Thạch 18-20g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Xanh Brôm-thy-môn, dung dịch 0,5-1g
trong cồn (Bromthymol Blue) 10-20ml
Theo thứ tự lần lượt hoà tan các muối trong
nước, cho thạch vào và đun sôi, chỉnh pH 6,8 rồi cho tiếp dung dịch xanh
brôm-thy-môn. Lắc đều và lọc qua bông. Chia ra các ống nghiệm 10 x 100mm, mỗi
ống từ 3-5ml. Hấp 1210C trong 20 phút. Để ống nằm nghiêng cho môi
trường đông lại (môi trường có mầu xanh).
A7. Thuốc thử Indol: Theo phụ lục B TCVN
5153-90.
A8. Thuốc thử đỏ methil (Methyl red): Hoà tan
0,04g đỏ methyl trong 60ml cồn 950, sau cho thêm 40ml nước cất.
A9. Thuốc thử đỏ Voges-Proskauer: Theo phụ
lục B TCVN 5153-90.
PHỤ
LỤC B
KỸ
THUẬT ĐẾM VÀ TÍNH SỐ VI KHUẨN (KHUẨN LẠC).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B2. Các chọn đĩa môi trường để đếm.
B2.1. Chọn những đĩa khuẩn lạc mọc riêng
biệt, số lượng từ 30-300 vi khuẩn.
B2.2. Nếu 2 đậm độ pha loãng kế tiếp nhau có
cùng số đếm từ 30-300 thì lấy số đếm được ở từng đĩa nhân với bội số pha loãng,
so sánh tỷ lệ giữa hai giá trị, nếu nhỏ hơn 2 thì lấy số đếm bình quân của cả 2
giá trị. Nếu lớn hơn 2 thì lấy số có giá trị thấp.
B2.3. Nếu các đậm độ pha loãng đều có số đếm
trên 300 thì chọn đĩa môi trường có bột số phan loãng cao nhất.
B2.4. Nếu các đậm độ pha loãng đều có số đếm
ít hơn 30 thì chọn đĩa môi trường có bội số pha loãng thấp nhất.
B2.5. Cách tính lại số lượng vi khuẩn: Căn cứ
vào kết quả giám định 5 khuẩn lạc đại diện cho mỗi nhóm để tính lại số đếm
(B2). Nếu cả 5 đều dương tính thì nhóm đó được tính 100% dương tính, nếu có 3
dương tính thì chỉ được tính là 60% dương tính.
B4. Cách tính số vi khuẩn trong 1 gam và trên
100cm2 mẫu thử theo công thức:
X1g=số khuẩn lạc
đếm được X
1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1
khối lượng nuôi cấy
bội số pha loãng
mẫu thử
X100 cm2
=100 X
Số khuẩn lạc đếm
được X
1
x
1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
bội số pha loãng
mẫu thử
4.1. Số khuẩn lạc đếm được là số lượng bình
quân trên 2 đĩa môi trường có cùng độ đậm pha loãng hoặc ở 2 độ pha loãng kế
tiếp nhau và đã được xác minh lại (B3).
B4.2. Trước khi tính cần làm tròn số đếm:
Dưới 10 thì làm tròn số hàng chục; dưới 5 thì lấy số hàng chục dưới, trên 5 thì
lấy tròn số hàng chục trên, trên 100 nếu số hàng đơn vị là 5 thì lấy số tròn
chia chẵn cho 20, các trường hợp khác thì lấy số tròn chia chẵn cho 10.
B4.3. Thí dụ và cách tính:
B4.3.1. Thí dụ: 1ml mẫu thử ở độ đậm pha
loãng 10-2 được cấy đều trên 2 đĩa môi trường. Đĩa 1 có 65 khuẩn lạc
gồm 55 điển hình và 10 không điển hình. Đĩa 2 có 85 khuẩn lạc gồm 82 điển hình
và 3 không điển hình.
B4.3.2. Cách tính:
- Tổng khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa: 150 gồm
137 điển hình và 13 không điển hình.
- Sau khi chọn và giám định lại 5 khuẩn lạc ở
mỗi nhóm thì thấy (giả thiết) cả 5 khuẩn lạc ở nhóm điển hình đều không dương
tính. Chiếm tỷ lệ 100% (5/5). Có 3 trong nhóm không điển hình dương tính chiếm
tỷ lệ 60% (3/5).
- Căn cứ vào tỷ trên, số khuẩn lạc được tính
lại như sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
= 137 + 7,8
= 137 + 8 (số tròn)
= 145
= 140 (số làm tròn)
Số bình quân = 
=
70
x 1g = 70 x 
x
= 70 x 102
= 7 x 103
- Nếu tính số vi khuẩn trên 100cm2
diện tích mẫu thử cũng tính như trên rồi nhân với 100.