Tiêu chuẩn TCVN 14284:2025 về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm

• Số hiệu: TCVN14284:2025
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2025

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14284:2025

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - ĐỊNH LƯỢNG NHANH TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG CHẤT CHỈ THỊ 2,3,5 TRIPHENYL-TETRAZOLIUM CHLORIDE

Microbiology of the food chain - Rapid enumeration of total aerobic count using 2,3,5 triphenyl-tetrazolium chloride as indicator

Lời nói đầu

TCVN 14284:2025 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - ĐỊNH LƯỢNG NHANH TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG CHẤT CHỈ THỊ 2,3,5 TRIPHENYL-TETRAZOLIUM CHLORIDE

Microbiology of the food chain - Rapid enumeration of total aerobic count using 2,3,5 triphenyl-tetrazolium chloride as indicator

...

...

...

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng nhanh 1)tổng số vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm, sử dụng môi trường không chọn lọc (Compact Dry TC) và chất chỉ thị 2,3,5 triphenyl-tetrazolium chloride (TTC).

Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng cho thức ăn chăn nuôi và mẫu môi trường trong giai đoạn sản xuất ban đầu.

Phụ lục A cung cấp thông tin về kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và kết quả của các phép thử liên phòng thử nghiệm do Viện nghiên cứu AOAC ^[14],^[19],[20^], NMKL - NordVal^[17] và Microval^[18] thực hiện.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1

...

...

...

Cơ thể sống có kích thước rất nhỏ, chỉ quan sát được bằng kính hiển vi.

CHÚ THÍCH: Trong phạm vi của tiêu chuẩn này, vi sinh vật gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc có thể hình thành khuẩn lạc dưới các điều kiện quy định.

3.2

Khuẩn lạc (colony)

Cụm sinh khối vi sinh vật tại một vị trí, có thể quan sát được, phát triển trên bề mặt hoặc bên trong môi trường dinh dưỡng đặc từ một phần tử sống.

4  Nguyên tắc

Sử dụng đĩa môi trường chuẩn bị sẵn bao gồm môi trường nuôi cấy, chất tạo gel và chất chỉ thị oxy hóa khử (TTC). Cấy 1 mL phần mẫu thử đã chuẩn bị vào giữa đĩa môi trường. Phần mẫu thử này tự khuếch tán trong môi trường và chất tạo gel sẽ làm đông đặc môi trường. Ủ môi trường chứa phần mẫu thử ở nhiệt độ 30 °C ± 1 °C trong thời gian 48 h ± 3 h. Đếm các khuẩn lạc trên đĩa để xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong mẫu thử.

5  Môi trường nuôi cấy và dịch pha loãng

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, nước sử dụng là nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

...

...

...

Sử dụng đĩa Compact Dry TC có chứa môi trường nuôi cấy (bao gồm hỗn hợp các chất dinh dưỡng: chất chiết nấm men, pepton, glucose), đệm phosphat, magie chloride, chất tạo gel (polysaccharid có nguồn gốc từ thạch) và chất chỉ thị oxy hóa khử (TTC).

Đĩa có kích thước 20 cm^2, mặt đáy có lưới ô vuông 1 cm x 1 cm hoặc 0,5 cm x 0,5 cm để thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc.

5.2  Dung dịch đệm phosphat Butterfield

5.2.1  Dung dịch gốc

5.2.1.1  Thành phần

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

34 g

Nước

1 000 mL

...

...

...

Hòa tan 34 g kali dihydro phosphat trong 500 mL nước đựng trong bình định mức dung tích 1 L (6.4), chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M (khoảng 175 mL). Thêm nước đến vạch. Hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ 121 °C. Bảo quản trong tủ lạnh.

5.2.2  Dung dịch làm việc (dung dịch pha loãng mẫu)

Dùng pipet lấy 1,25 mL dung dịch gốc (5.2.1) cho vào bình định mức dung tích 1 L (6.4). Thêm nước đến vạch. Hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ 121 °C.

5.3  Dung dịch muối pepton (MRD)

5.3.1  Thành phần

Pepton (sản phẩm thủy phân casein bằng enzym)

1,0 g

Nath chloride (NaCl)

8,5 g

...

...

...

1 000 mL

5.3.2  Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần vào nước đựng trong bình định mức dung tích 1 L (6.4), đun nóng nếu cần. Hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ 121 °C.

Chỉnh pH sao cho sau khi hấp, pH là 7,0 ± 0,2 ở nhiệt độ 25 °C, nếu cần.

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây:

6.1  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

6.2  Dụng cụ do pH, có thể đo chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở nhiệt độ 20 °C đến 25 °C.

6.3  Nồi hấp áp lực, có thể kiểm soát ở nhiệt độ 121 °C.

...

...

...

6.5  Pipet, có thể phân phối thể tích 1 mL.

6.6  Máy trộn Vortex.

6.7  Túi trộn nhu động, có bộ lọc, ví dụ: Stomacher^®.

6.8  Thiết bị đồng hóa mẫu, ví dụ: Blender hoặc Stomacher™.

6.9  Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ 30 °C ± 1 °C và 35 °C ± 1 °C.

6.10  Bộ đếm khuẩn lạc.

7  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 11923 (ISO/TS 17728) ^[8]; riêng lấy mẫu bề mặt thân thịt theo TCVN 7925 (ISO 17604) ^[6], lấy mẫu sữa và sản phẩm sữa theo TCVN 6400 (ISO 707) ^[3].

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

...

...

...

Chuẩn bị mẫu thử (phần mẫu thử và huyền phù mẫu thử) theo phần tương ứng của bộ tiêu chuẩn TCVN 6507 (ISO 6887).

VÍ DỤ:

a) Đối với thịt tươi, cân 50 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, cho vào thiết bị đồng hóa mẫu (6.8) và thêm 450 mL dung dịch đệm phosphat Butterfield (5.2.2). Trộn bằng thiết bị đồng hóa mẫu trong thời gian 2 min ± 15 s.

b) Đối với thịt gà đã nấu chín, cá đông lạnh và rau diếp, cân 10 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, cho vào túi trộn nhu động (6.7) và thêm 90 mL dung dịch muối pepton (5.3). Trộn bằng túi trộn nhu động trong thời gian 1 min ± 10 s. Sử dụng túi trộn nhu động có màng lọc để các mảnh mẫu nhỏ không bị lẫn lên bề mặt môi trường nuôi cấy.

c) Đối với sữa bột, cân 10 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, cho vào vật chứa thích hợp và thêm vào 90 mL dung dịch muối pepton (5.3) đã làm ẩm trước ở nhiệt độ 45 °C ± 1 °C. Xoay và lắc từ từ cho đến khi mẫu hòa tan.

d) Đối với sữa tiệt trùng, tùy thuộc mức độ nhiễm vi sinh vật dự kiến, có thể sử dụng trực tiếp phần mẫu thử không pha loãng hoặc tiến hành pha loãng 1 mL phần mẫu thử trong 9 mL dung dịch muối pepton (5.3) hoặc pha loãng tiếp theo nếu số đếm lớn hơn 300 CFU/đĩa. Trộn bằng máy trộn Vortex (6.6).

9  Cách tiến hành

9.1  Lấy số đĩa môi trường (5.1) cần sử dụng. Nếu cần đếm khuẩn lạc ở các độ pha loãng liên tiếp thì sử dụng sổ đĩa tương ứng. Ghi nhãn đĩa với thông tin về mẫu thử và độ pha loãng.

9.2  Mở nắp đĩa, dùng pipet (6.5) hút 1 mL phần mẫu thử đã chuẩn bị (xem Điều 8), cấy vào giữa và đậy nắp đĩa. Phần mẫu thứ tự khuếch tán trong môi trường và chất tạo gel sẽ làm đông đặc môi trường.

...

...

...

Kết quả có thể bị ảnh hưởng nếu mẫu có độ nhớt cao, có màu đậm, có độ pH quá cao hoặc quá thấp hoặc mẫu có phản ứng với chất chỉ thị oxy hóa khử. Đối với các mẫu như vậy, chỉ phân tích sau khi pha loãng mẫu, điều chỉnh pH của mẫu bằng dung dịch đệm hoặc sử dụng các biện pháp khắc phục khác.

9.3  Lật ngược đĩa đã đậy nắp và đặt vào tủ ấm (6.9), ủ đĩa môi trường ở nhiệt độ 30 °C ± 1 °C trong thời gian 48 h ± 3 h.

CHÚ THÍCH: Đối với thịt tươi, có thể ủ ở nhiệt độ 35 °C ± 1 °C.

9.4  Đếm các khuẩn lạc trong đĩa môi trường, có thể sử dụng bộ đếm khuẩn lạc (6.10). Phạm vi đếm khuẩn lạc là từ 1 CFU/đĩa đến 300 CFU/dĩa. Có thể đặt tấm giấy trắng ở phía dưới đĩa để thuận tiện việc đếm khuẩn lạc.

CHÚ THÍCH: Các khuẩn lạc mọc trên đĩa Compact Dry TC hầu hết có màu đỏ. Tuy nhiên, một số vi sinh vật không khử chất chỉ thị TTC, do đó khuẩn lạc có thể không có màu đỏ.

9.5  Nếu số khuẩn lạc trên đĩa lớn hơn 300 CFU/đĩa thì pha loãng mẫu thử bằng dung dịch pha loãng thích hợp để đạt được số khuẩn lạc trong khoảng đếm được. Nếu trên đĩa có nhiều hơn 10^4 CFU/mL thì các khuẩn lạc hình thành sẽ khó phân biệt về màu sắc và toàn bộ đĩa có thể bị chuyển màu.

9.6  Trong trường hợp việc đếm các khuẩn lạc riêng rẽ gặp khó khăn và có số lượng lớn khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường, đếm khuẩn lạc của một số ô tại bốn góc của lưới ô vuông trên mặt đáy của đĩa. Tổng số khuẩn lạc trên đĩa môi trường được tính bằng 20 lần số khuẩn lạc trung bình từ các ô 1 cm x 1 cm hoặc bằng 80 lần số khuẩn lạc trung bình từ các ô 0,5 cm x 0,5 cm đã đếm.

10  Tính và biểu thị kết quả

a) Tính số lượng vi sinh vật hiếu khí có trong mẫu thử, N, theo trung bình số khuẩn lạc từ hai độ pha loãng liên tiếp, áp dụng Công thức (1):

...

...

...

Trong đó:

 là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa được giữ lại từ hai độ pha loãng liên tiếp, trong đó có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc;

V là thể tích chất cấy được đưa vào mỗi đĩa, tính bằng mililit (V = 1 mL);

n₁ là số đĩa được giữ lại ở dung dịch pha loãng thứ nhất;

n₂ là số đĩa được giữ lại ở dung dịch pha loãng thứ hai (n₂ = 0 nếu không pha loãng);

d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng đầu tiên được giữ lại (d = 1 khi đĩa đầu tiên được giữ lại là đĩa cấy mẫu thử dạng lòng không pha loãng).

b) Nếu các đĩa không chứa khuẩn lạc nào thì báo cáo kết quả là:

“Có ít hơn  CFU trên gam (hoặc mililit) sản phẩm”

c) Nếu số đếm khuẩn lạc trên một đĩa trong khoảng từ 1 CFU/đĩa đến 3 CFU/đĩa thì báo cáo kết quả là:

...

...

...

d) Nếu số đếm khuẩn lạc trên một đĩa trong khoảng từ 4 CFU/đĩa đến 9 CFU/đĩa thì tính số ước tính N_E vi sinh vật hiếu khí trên gam (hoặc mililit) sản phẩm theo Công thức (2):

Trong đó:

C là số khuẩn lạc đếm được trên đĩa;

e) Trường hợp chỉ có đĩa chứa dung dịch pha loãng được nuôi cấy cuối cùng có thể đếm và có chứa từ 10 CFU/đĩa đến 300 CFU/đĩa, thì tính số lượng vi sinh vật hiếu khí có trên gam (hoặc mililit) sản phẩm, N’, áp dụng Công thức (3):

f) Nếu số đếm khuẩn lạc trên một trong các đĩa có tất cả các dung dịch pha loãng đã nuôi cấy, cho số lượng vi sinh vật hiếu khí lớn hơn 300 CFU/đĩa, thì báo cáo kết quả là:

“có nhiều hơn  CFU trên gam (hoặc mililit) sản phẩm”.

11  Báo cáo thử nghiệm

...

...

...

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

e) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được cho là tùy chọn, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

f) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

...

...

...

A.1  Kết quả xác nhận giá trị sử dụng phương pháp do Viện nghiên cứu AOAC thực hiện

Các thử nghiệm xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này do Viện nghiên cứu AOAC thực hiện lần đầu năm 2005 ^[19], bổ sung vào các năm 2015 và 2020 ^[20^].

A.1.1  Đánh giá so sánh phương pháp định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí

a) Năm 2005, Viện nghiên cứu AOAC thực hiện nghiên cứu so sánh kết quả định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này so vơi các phương pháp chuẩn nêu trong AOAC 966.23 ^[13]. Với quy trình chuẩn bị mẫu nêu trong AOAC 966.23, hai phương pháp cho kết quả như nhau. Cụ thể là theo dữ liệu đính kèm của 5 lần lặp lại ở 3 mức (4 mức đối với thịt bê tươi) của 5 loại thịt tươi (n = 80) thông qua nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng nội bộ và độc lập, hệ số tương quan (r^2) của hai phương pháp là 0,9965.

Kết quả thử nghiệm xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn nêu trong AOAC 966.23 được nêu trong Bảng A.1.

b) Năm 2015, Viện nghiên cứu AOAC thực hiện nghiên cứu mở rộng nền mẫu, phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này được đánh giá với thời gian ủ là 48 h ± 3 h theo khuyến nghị của nhà sản xuất và 72 h ± 3 h theo TCVN 4884 (ISO 4833) ^[1]. Kết quả từ mỗi thời điểm được so sánh với nhau và so sánh với TCVN 4884 (ISO 4833). Các phân tích thống kê chỉ ra rằng không có sự chênh lệch đáng kể trong việc đếm tổng số lượng vi khuẩn hiếu khí trong thịt gà nấu chín, rau diếp, cá đông lạnh, sữa bột và sữa tiệt trùng giữa hai thời gian ủ được thử nghiệm và do đó vẫn khuyến nghị thời gian ủ là 48 h.

Kết quả thử nghiệm xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn nêu trong TCVN 4884 (ISO 4833) được nêu trong Bảng A.2, Bảng A.3 và Bảng A.4.

Bảng A.1 - Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này so với phương pháp AOAC 966.23

Mức vi sinh vật hiếu khí

...

...

...

TCVN 14284:2025

AOAC S66.23

CFU/g

log₁₀CFU/g

CFU/g

log₁₀CFU/g

Mẫu thịt lợn xay chưa chế biến (bị ô nhiễm tự nhiên)

Khoảng 10^2 CFU/g

1

...

...

...

2,72

500

2,70

2

680

2,83

670

2,83

3

...

...

...

2,63

415

2,62

4

635

2,80

635

280

5

...

...

...

2 56

355

2,55

Trung bình

527

2,71

515

2,70

s_r ^a)

...

...

...

0,11

136

0,12

RSD_r^b), %

25,2

4,18

26,5

4,37

Khoảng 10^4 CFU/g

...

...

...

78000

4,89

70500

4,85

2

80000

4,90

76000

4,88

...

...

...

77000

4,89

78000

4,89

4

99000

5,00

96000

4,98

...

...

...

55000

4,74

42500

4,63

Trung bình

77800

4,88

72600

4,85

...

...

...

15600

0,09

19400

0,13

RSD_r, %

20,1

1,87

26,7

2,72

...

...

...

1

6400000

6,81

5850000

6,77

2

9100000

6,96

8850000

...

...

...

3

9350000

6,97

9150000

6,96

4

6800000

6,83

6400000

...

...

...

5

9300000

6,97

8250000

6,92

Trung bình

8190000

6,91

7700000

...

...

...

s_r

1460000

0,08

1490000

0,09

RSD_r, %

17,8

1,17

19,3

...

...

...

Mẫu thịt lợn chưa chế biến (nguyên liệu) (bị ô nhiễm tự nhiên)

Khoảng 10^2 CFU/g

1

125

2,10

165

2,22

2

180

...

...

...

170

2,23

3

100

2,00

90

1,95

4

145

...

...

...

100

2,00

5

120

2,08

170

2,23

Trung bình

134

...

...

...

139

2,13

s_r

30,3

0,10

40,4

0,14

RSD_r, %

22,6

...

...

...

29,0

6,46

Khoảng 10^4 CFU/g

1

37500

4,57

37500

4,57

2

...

...

...

4,54

35000

4,54

3

96500

4,98

96500

4,98

4

...

...

...

4,21

15800

4,20

5

18350

4,26

10400

4,02

Trung bình

...

...

...

4,51

39040

4,46

s_r

32600

0,31

34200

0,37

RSD_r, %

...

...

...

6,85

87,6

8,38

Khoảng 10^6 CFU/g

1

3700000

6,57

3500000

6,54

...

...

...

2855000

6,46

2840000

6,45

3

7800000

6,89

7550000

6,88

...

...

...

1210000

6,08

1300000

6,11

5

1545000

6,19

1775000

6,25

...

...

...

3420000

6,44

3393000

6,45

s_r

2640000

0,32

2480000

0,29

...

...

...

77,3

4,98

73,1

4,56

Mẫu thịt cừu chưa chế biến (nguyên liệu) (bị ô nhiễm tự nhiên)

Khoảng 10^2 CFU/g

1

255

2,41

...

...

...

2,35

2

370

2,57

360

2,56

3

455

2,66

...

...

...

2,61

4

145

2,16

130

2,11

5

840

2,92

...

...

...

2,98

Trung bình

413

2,54

418

2,52

s_r

266

0,28

...

...

...

0,32

RSD_r, %

64,4

11,2

77,8

12,8

Khoảng 10^4 CFU/g

1

19450

...

...

...

18900

4,28

2

13400

4,13

13600

4,13

3

83500

...

...

...

79000

4,90

4

15000

4,18

14200

4,15

5

10300

...

...

...

9700

3,99

Trung bình

28330

4,31

27100

4,29

s_r

31000

...

...

...

29200

0,36

RSD_r, %

109

8,33

108

8,28

Khoảng 10^6 CFU/g

1

...

...

...

6,77

4800000

6,68

2

1610000

6,21

1120000

6,05

3

...

...

...

6,31

2025000

6,31

4

3700000

6,57

3500000

6,54

5

...

...

...

6,11

1320000

6,12

Trung bình

2890000

6,39

2553000

6,34

s_r

...

...

...

0,27

1565118,206

0,27

RSD_r, %

65,5

4,23

61,30506096

4,26

Mẫu thịt bê chưa chế biến (nguyên liệu)

...

...

...

1

5

0,70

5

0,70

2

10

1,00

5

...

...

...

3

20

1,30

10

1,00

4

10

1,00

5

...

...

...

5

10

1,00

10

1,00

Trung bình

11

1,00

7

...

...

...

s_r

5,48

0,21

2,74

0,16

RSD_r, %

49,8

21,3

39,1

...

...

...

Khoảng 10^2 CFU/g, bổ sung vi sinh vật với nồng độ 2,5 x 10^2 CFU/g

1

260

2,41

256

2,41

2

224

2,35

...

...

...

2,38

3

170

2,23

172

2,24

4

292

2,47

...

...

...

2,45

5

220

2,34

230

2,36

Trung bình

233,2

2,36

...

...

...

2,37

s_r

45,9

0,09

41,4

0,08

RSD_r, %

19,7

3,75

...

...

...

3,44

Khoảng 10^4 CFU/g, bổ sung vi sinh vật với nồng độ 2,5 x 10^4 CFU/g

1

23200

4,37

23200

4,37

2

11800

...

...

...

11900

4,08

3

13700

4,14

13580

4,13

4

56000

...

...

...

53800

4,73

5

14680

4,17

14800

4,17

Trung bình

23900

...

...

...

23500

4,29

s_r

18500

0,27

17500

0,27

RSD_r, %

77,4

...

...

...

74,7

6,21

Khoảng 10^6 CFU/g, bổ sung vi sinh vật với nồng độ 1,5 x 10^6 CFU/g

1

1340000

6,13

1320000

6,12

2

...

...

...

6,25

1540000

6,19

3

860000

5,93

1210000

6,08

4

...

...

...

6,04

1290000

6,11

5

1540000

6,19

1340000

6,13

Trung bình

...

...

...

6,11

1340000

6,13

s_r

361000

0,12

122000

0,04

RSD_r, %

...

...

...

2,03

9,12

0,63

Dữ liệu phòng thử nghiệm độc lập (mẫu bị ô nhiễm tự nhiên)

Khoảng 10^4 CFU/g

1

15300

4,18

25400

...

...

...

2

9600

3,98

24650

4,39

3

10900

4,04

20200

...

...

...

4

11100

4,05

27950

4,45

5

10600

4,03

20700

...

...

...

Trung bình

11500

4,06

23780

4,37

s_r

2200

0,08

3280

...

...

...

RSD_r, %

19,1

1,89

13,8

1,38

Khoảng 10^6 CFU/g

1

1590000

6,20

...

...

...

6,11

2

1660000

6,22

1335000

6,13

3

1870000

6,27

...

...

...

6,25

4

1110000

6,05

980000

5,99

5

1850000

6,27

...

...

...

6,23

Trung bình

1616000

6,20

1415000

6,14

s_r

307000

0,09

...

...

...

0,10

RSD_r, %

19,0

1,49

22,7

1,68

Khoảng 10^8 CFU/g

1

93000000

...

...

...

86500000

7,94

2

125000000

8,10

111500000

8,05

3

164000000

...

...

...

128000000

8,11

4

120000000

8,08

104000000

8,02

5

190000000

...

...

...

158500000

8,20

Trung bình

138400000

8,13

117700000

8,06

s_r

38400000

...

...

...

27250000

0,10

RSD_r, %

27,7

1,50

23,2

1,22

a) s_r = độ lệch chuẩn lặp lại;

b) RDS_r = độ lệch chuẩn tương đối lặp lại.

...

...

...

Nền mẫu

Mức nhiễm

TCVN 14284:2025 (ủ 48 h)

TCVN 4884 (ISO 4833)

Chênh lệch giá trị trung bình^d)

95 % Cl ^e)

r^2 ^h)

Trung bình Log₁₀CFU^a)/g

s_r^b)

...

...

...

Trung bình Log₁₀CFU^b)/g

s_r

RSD_r^c), %

LCL^f)

UCL ^g)

Thịt gà nấu chín

1

0,281

0,594

...

...

...

0,357

0,757

212

0,076

-0,070

0,219

0,99

2

2,399

...

...

...

12,7

2,572

0,517

20,1

0,173

-0,113

0,459

3

3,309

...

...

...

11,0

3,383

0,357

10,6

0,074

-0,015

0,163

4

5,056

...

...

...

5,62

5,404

0,133

2,46

0,348

0,207

0,490

5

6,173

...

...

...

4,08

6,194

0,209

3,37

0,021

-0,036

0,077

Rau diếp

1

...

...

...

0,663

28,3

2,663

0,682

25,6

0,317

0,156

0,478

0,98

...

...

...

3,359

0,709

21,1

3,437

0,346

10,1

0,078

-0,230

0,387

...

...

...

4,491

0,324

7,21

5,193

0,352

6,78

0,702

0,601

0,802

...

...

...

5,443

0,201

3,69

5,638

0,244

4,28

0,196

0,129

0,263

...

...

...

7,010

0,143

2,04

7,634

0,134

1,76

0,624

0,529

0,719

...

...

...

1

2,953

0,178

6,03

3,089

0,158

5,11

0,136

0,016

...

...

...

0,97

2

3,924

0,121

3,08

4,052

0,091

2,25

0,128

...

...

...

0,200

3

4,791

0,191

3,99

5,499

0,139

2,53

0,708

...

...

...

0,879

4

5,854

0,135

2,31

6,246

0,091

1,46

0,392

...

...

...

0,459

5

6,432

0,066

1,03

6,953

0,090

1,29

0,522

...

...

...

0,595

Sữa bột

1

0,645

0,845

131

1,012

0,736

72,7

...

...

...

-0,067

0,800

0,98

2

2,064

0,139

6,73

2,232

0,157

...

...

...

0,168

0,082

0,253

3

4,026

0,134

3,33

3,993

0,076

...

...

...

-0,033

-0,102

0,036

4

5,010

0,110

2,20

4,926

0,103

...

...

...

-0,084

-0,149

-0,018

5

5,709

0,132

2,31

5,639

0,171

...

...

...

-0,070

-0,127

-0,012

^a) Giá trị trung bình từ năm phần mẫu thử lặp lại, đã chuyển đổi sang logarit: log₁₀[CFU/g + (0,1)/]; CFU = đơn vị hình thành khuẩn lạc; ^b) s_r = độ lệch chuẩn lặp lại; ^c) RDS_r = độ lệch chuẩn tương đối lặp lại; ^d) chênh lệch giá trị trung bình (DOM) giữa hai phương pháp; ^e) Cl = khoảng tin cậy của DOM; ^f) LCL = giới hạn dưới khoảng tin cậy của DOM; ^g^) LUL = giới hạn dưới khoáng tin cậy của DOM; ^h) bình phương của hệ số tương quan; ^i) không áp dụng.

Bảng A.3 - Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí nêu trong tiêu chuẩn này (thời gian ủ 72 h) so với phương pháp chuẩn [TCVN 4884 (ISO 4833)]

Nền mẫu

Mức nhiễm

TCVN 14284:2025 (ủ 72 h)

TCVN 4884 (ISO 4833)

...

...

...

95 % Cl ^e)

r^2^h)

Trung bình Log₁₀CFU^a)/g

s_r^b)

RSD_r^c), %

Trung bình Log₁₀CFU^b)/g

s_r

RSD_r^c), %

LCL ^f)

...

...

...

Thịt gà nấu chín

1

0,281

0,594

211

0,357

0,757

212

0,076

...

...

...

0,219

0,99

2

2,734

0,636

23,4

2,572

0,517

20,1

...

...

...

-0,358

0,033

3

3,323

0,369

11,1

3,383

0,357

10,6

...

...

...

-0,033

0,153

4

5,063

0,280

5,53

5,404

0,133

2,46

...

...

...

0,203

0,480

5

6,179

0,249

4,03

6,194

0,209

3,37

...

...

...

-0,040

0,070

Rau diếp

1

2,496

0,593

23,8

2,663

0,682

...

...

...

0,168

0,040

0,296

0,98

2

3,393

0,732

21,6

3,437

...

...

...

10,1

0,044

-0,277

0,365

3

4,782

0,246

5,14

5,193

...

...

...

6,78

0,411

0,309

0,513

4

5,527

0,200

3,62

5,638

...

...

...

4,28

0,111

0,034

0,188

5

7,117

0,182

2,56

7,634

...

...

...

1,76

0,517

0,419

0,615

Cá đông lạnh

1

3,000

0,155

5,17

...

...

...

0,158

5,11

0,090

-0,019

0,198

0,98

2

3,924

0,121

...

...

...

4,052

0,091

2,25

0,128

0,056

0,199

3

4,822

0,174

...

...

...

5,499

0,139

2,53

0,677

0,518

0,838

4

5,860

0,133

...

...

...

6,246

0,091

1,46

0,386

0,323

0,450

5

6,474

0,065

...

...

...

6,953

0,090

1,29

0,479

0,414

0,544

Sữa bột

1

0,881

...

...

...

89,9

1,012

0,736

72,7

0,130

-0,190

0,450

0,99

2

...

...

...

0,154

7,32

2,232

0,157

7,03

0,127

0,026

0,277

3

...

...

...

0,133

3,30

3,993

0,076

1,90

-0,034

-0,103

0,035

4

...

...

...

0,110

2,20

4,926

0,103

2,09

-0,084

-0,149

-0,018

5

...

...

...

0,131

2,29

5,639

0,171

3,03

-0,081

-0,142

-0,019

^a^) Giá trị trung bình từ năm phần mẫu thử lặp lại, đã chuyển đổi sang logarit: log₁₀[CFU/g + (0,1)f]; CFU = đơn vị hình thành khuẩn lạc; ^b) s_r = độ lệch chuẩn lặp lại; ^c) RDS_r = độ lệch chuẩn tương đối lặp lại; ^d) chênh lệch giá trị trung bình (DOM) giữa hai phương pháp;^e^) Cl = khoảng tin cậy của DOM; ^f) LCL = giới hạn dưới khoảng tin cậy của DOM; ^g^) LUL = giới hạn dưới khoảng tin cậy của DOM; ^h) bình phương của hệ số tương quan; ^i) không áp dụng.

...

...

...

Nền mẫu

Mức nhiễm

TCVN 14284:2025 (ủ 48 h)

TCVN 14284:2025 (ủ 72 h)

Chênh lệch giá trị trung bình ^d)

95 % Cl ^e)

r^2^h)

Trung bình Log₁₀CFU^a)/g

s_r^b)

...

...

...

Trung bình Log₁₀CFU^b)/g

s_r

RSD_r^c), %

LCL ^f)

UCL ^g^)

Thịt gà nấu chín

1

0,281

0,594

...

...

...

0,281

0,594

211

0,00

0,00

0,00

0,99

2

2,399

...

...

...

12,7

2,734

0,636

23,4

0,336

-0,079

0,750

3

3,309

...

...

...

11,0

3,323

0,369

11,1

0,014

-0,001

0,029

4

5,056

...

...

...

5,62

5,063

0,280

5,53

0,007

0,002

0,011

5

6,173

...

...

...

4,08

6,179

0,249

4,03

0,006

0,003

0,009

Rau diếp

1

...

...

...

0,663

28,3

2,496

0,593

23,76

0,149

0,065

0,233

0,99

...

...

...

3,359

0,709

21,1

3,393

0,732

21,6

0,034

0,007

0,061

...

...

...

4,491

0,324

7,21

4,782

0,246

5,14

0,291

0,200

0,381

...

...

...

5,443

0,201

3,69

5,527

0,200

3,62

0,085

0,001

0,169

...

...

...

7,010

0,143

2,04

7,117

0,182

2,56

0,107

0,031

0,183

...

...

...

1

2,953

0,178

6,03

3,000

0,155

517

0,046

0,026

...

...

...

1,00

2

3,924

0,121

3,08

3,924

0,121

3,08

0,000

...

...

...

0,000

3

4,791

0,191

3,99

4,822

0,174

3,61

0,031

...

...

...

0,063

4

5,854

0,135

2,31

5,860

0,133

2,27

0,006

...

...

...

0,010

5

6,432

0,066

1,03

6,474

0,065

1,00

0,043

...

...

...

0,107

Sữa bột

1

0,645

0,845

131

0,881

0,792

89,9

...

...

...

-0,123

0,596

0,99

2

2,064

0,139

6,73

2,105

0,154

...

...

...

0,041

0,008

0,074

3

4,026

0,134

3,33

4,027

0,133

...

...

...

0,001

0,000

0,003

4

5,010

0,110

2,20

5,010

0,110

...

...

...

0,000

0,000

0,001

5

5,709

0,132

2,31

5,720

0,131

...

...

...

0,011

0,002

0,020

^a) Giá trị trung bình từ năm phần mẫu thử lặp lại, đã chuyển đổi sang logarit: log₁₀[CFU/g + (0,1)/]; CFU = đơn vị hình thành khuẩn lạc; ^b^) s_r = độ lệch chuẩn lặp lại; ^c) RDS_r = độ lệch chuẩn tương đối lặp lại; ^d^) chênh lệch giá trị trung bình (DOM) giữa hai phương pháp; ^e) Cl = khoảng tin cậy của DOM; ^f) LCL = giới hạn dưới khoảng tin cậy của DOM; ^g) LUL = giới hạn trên khoảng tin cậy của DOM; ^h) bình phương của hệ số tương quan; ^i) không áp dụng.

A.1.2  Đánh giá độ chụm

a) Nghiên cứu độ lặp lại được thực hiện năm 2005 với 18 nền mẫu thực phẩm. Các mẫu được chuẩn bị và pha loãng thành 4 mức nồng độ vi khuẩn có trong đĩa (nhỏ hơn 10 CFU/mL, từ 10 CFU/mL đến 25 CFU/mL, khoảng 100 CFU/mL và khoảng 250 CFU/mL). Các mẫu có lượng vi khuẩn trong đĩa thấp hoặc không có được bổ sung E. coli và Staphylococcus epidermidis (trộn sau khi nuôi cấy) theo số lượng tế bào tương ứng với các mức yêu cầu. Mỗi dung dịch pha loãng mẫu thử được tiến hành với mười lần lặp lại, sử dụng phương pháp nêu trong tiêu chuẩn này và phương pháp chuẩn (AOAC 966.23) và đếm hai lần sau khi ủ.

Kết quả cho thấy trong phạm vi độ lệch chuẩn, cả hai phương pháp đều cho kết quả đếm đĩa tương tự nhau. Các giá trị độ lệch chuẩn giảm khi tăng số CFU trên mỗi đĩa (độ chính xác của việc đếm tăng theo số CFU trên mỗi đĩa).

Nhiệt độ ủ 35 °C theo AOAC 966.23 được khuyến nghị chuyển thành 30 °C, đây là nhiệt độ ủ phổ biến hơn đối với các phương pháp đếm tổng hiếu khí trong Cộng đồng châu Âu, kết quả số đếm (CFU) của các nền mẫu khác nhau ở hai nhiệt độ ủ nêu trên là tương tự nhau. Riêng đối với sữa chua, số vi sinh vật hiếu khí ở các độ pha loãng 10^4 và 10^3 xác định được theo phương pháp nêu trong tiêu chuẩn này thấp hơn đáng kể so với phương pháp đổ đĩa. Điều này có thể do các điều kiện hiếu khí duy nhất của các đĩa chế tạo sẵn sử dụng trong phương pháp này. Trong khi đó, kỹ thuật đổ đĩa cho phép đếm cả các vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, việc này gây ảnh hưởng đến quần thể vi khuẩn phát triển ở 30 °C nhiều hơn so với những vi khuẩn được chọn với nhiệt độ phát triển ở 35 °C. Lặp lại việc ủ này với một mẫu sữa chua chứa vi khuẩn bản địa nồng độ 10^8 CFU/g, dữ liệu độ lặp lại của phương pháp nêu trong tiêu chuẩn này tương tự với phương pháp đổ đĩa khi được ủ ở 35 °C.

b) Thử nghiệm đánh giá độ chụm của phương pháp do Viện nghiên cứu AOAC thực hiện năm 2015 và công bố năm 2016 trên nền mẫu sữa tiệt trùng. Có 14 phòng thử nghiệm tham gia, trong đó dữ liệu thống kê được lấy từ 13 phòng thử nghiệm (có một phòng thử nghiệm bị loại do số đếm cao bất thường trong các mẫu không bị ô nhiễm). Kết quả thử nghiệm được nêu trong Bảng A.5, kết quả đánh giá độ chụm được nêu trong Bảng A.6.

...

...

...

Phòng thử nghiệm

Mẫu không bị ô nhiễm

Mẫu ô nhiễm ở mức thấp

Mẫu ô nhiễm ở mức trung bình

Mẫu ô nhiễm ở mức cao

TCVN 14284, ủ 48 h

TCVN 14284, ủ 72 h

TCVN 4884 (ISO 4833)

TCVN 14284, ủ 48 h

...

...

...

TCVN 4884 (ISO 4833)

TCVN 14284, ủ 48 h

TCVN 14284, ủ 72 h

TCVN 4884 (ISO 4833)

TCVN 14284, ủ 48 h

TCVN 14284, ủ 72 h

TCVN 4884 (ISO 4833)

1

0,000 ^a

...

...

...

0,734

2,557

2,560

2,698

3,533

3,538

3,697

4,701

4,703

...

...

...

2

0,000

0,000

0,000

2,638

2,638

2,832

3,726

3,726

...

...

...

4,727

4,727

4,860

3

0,521

0,591

0,000

2,684

2,689

...

...

...

3,763

3,771

3 973

4,803

4,808

4,947

4

2,340

2,365

...

...

...

2,930

2937

2,992

3,872

3,909

3,943

4,829

4,852

5,049

...

...

...

0,000

0,000

0,000

2,599

2,599

2,762

3,728

3,740

3,805

...

...

...

4,748

4,814

6

0,000

0,000

0,000

2,795

2,810

2,694

...

...

...

3,766

3,758

4,811

4,816

4,832

7

0,000

0,000

0,000

...

...

...

2,749

2852

3,831

3,831

3,953

4,823

4 825

4,945

8

...

...

...

0,000

0,000

2,588

2,588

2,770

3,627

3,627

3,917

4,761

...

...

...

4,826

9

0,260

0,260

0,000

2,751

2,751

2,803

3,790

...

...

...

3,888

4,904

4,904

4,963

10

0,000

0,260

0,000

2,618

...

...

...

2,788

3,688

3,688

3,724

4,710

4,710

4,616

11 ^b

0,000

...

...

...

0,000

2,703

2,705

2,752

3,726

3,726

3,820

4,793

4,793

...

...

...

12 ^b

0,000

0,000

0,000

2,748

2,753

2,730

3,812

3,734

...

...

...

4,983

4,940

4,979

13 ^b

0,000

0,000

0,000

2,779

2,779

...

...

...

3,876

3 878

3,896

4,853

4,858

4,864

14 ^c

0,260

0,260

...

...

...

2,700

2,700

2,810

3,739

3,739

3,789

4,835

4,836

4,833

...

...

...

0,260

0,260

0,000

2,700

2,700

2,745

3,774

3,774

3,833

...

...

...

4,716

4,701

^a Kết quả được báo cáo cho mỗi phòng thử nghiệm là trung bình của 2 phần mẫu thử lặp lại, đã chuyển đổi sang logarit: Log₁₀[CFU/g + (0,1)f].

^b Mẫu phân tích bắt đầu muộn hơn một ngày so với ngày bắt đầu dự kiến.

^c Phòng thử nghiệm của tổ chức.

Bảng A.6 - Kết quả đánh giá độ chụm của phương pháp định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí nêu trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn [TCVN 4884 (ISO 4833)] trên nền mẫu sữa tiệt trùng

Mức ô nhiễm

TCVN 14284:2025 (ủ 48 h) so với TCVN 4884 (ISO 4833)

TCVN 14284:2025 (ủ 72 h) so với TCVN 4884 (ISO 4833)

...

...

...

Trung bình ^b

TCVN 14284, 48 h

Trung bình

TCVN 4884 (ISO 4833)

Chênh lệch trung bình ^c

LCL^d

UCL^e

r^2f

...

...

...

TCVN 14284, 72 h

Trung bình

TCVN 4884 (ISO 4833)

Chênh lệch trung bình

LCL

UCL

r^2

Trung bình

TCVN 14284, 48 h

...

...

...

TCVN 14284, 72h

Chênh lệch trung bình

LCL

UCL

r^2

Không bị ô nhiễm

0,112

0,052

-0,060

...

...

...

0,080

0,98

0,117

0,052

-0,065

-0,281

0,079

0,98

0,112

...

...

...

0,005

-0,006

0,018

1,0

Thấp

2,686

2,776

0,090

0,046

...

...

...

2,688

2,776

0,088

0,043

0,129

2,686

2,688

0,002

-0,003

...

...

...

Trung binh

3,737

3,838

0,101

0,064

0,131

3,738

3,838

0,100

...

...

...

0,134

3,737

3,738

0,001

-0,011

0,008

Cao

4,797

4,838

...

...

...

0,011

0,069

4,796

4,838

0,042

0,012

0,070

4,797

4,796

...

...

...

-0,008

0,006

^a Phòng thử nghiệm 4 bị loại khỏi phép phân tích thống kê do số đếm cao bất ngờ trong các mẫu không bị ô nhiễm.

^b Giá trị trung bình tổng thể của các phòng thử nghiệm đối với từng phương pháp sau khi chuyển đổi logarit: Log₁₀[CFU/g + (0,1)f].

^c Chênh lệch trung bình giữa các phương pháp

^d 95 % giới hạn tin cậy thấp hơn so với chênh lệch trung bình

^e 95 % giới hạn tin cậy cao hơn so với chênh lệch trung bình

^f bình phương hệ số tương quan

A.1.3  Đánh giá so sánh kết quả định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ưa ấm trung bình theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn

...

...

...

Bảng A.7 - Tóm tắt và thống kê dữ liệu so sánh phương pháp đối với quá trình ủ 24 h của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này

Nền mẫu

Mức ô nhiễm

N

TCVN 14284:2025, ủ 24 h

MLG 3.02 ^[15]

DOM^a

95 % Cl^b

90 % Cl^b

...

...

...

Trung bình Log₁₀ CFU/g

s_r

RSD_r, %

Trung bình Log₁₀ CFU/g

s_r

RSD_r, %

LCL^c

UCL^d

LCL^c

...

...

...

Thịt bò xay tươi, 95 % nạc (ô nhiễm tự nhiên)

Thấp

5

2,189

0,120

5,48

2,368

0,109

4,60

...

...

...

-0,389

0,030

-0,340

-0,019

Đạt

Trung bình

5

5,519

0,214

...

...

...

5,881

0,177

3,01

-0,362

-0,495

-0,229

-0,464

-0,260

Đạt

...

...

...

5

7,399

0,174

2,35

7,577

0,068

0,90

-0,177

-0,357

...

...

...

-0,315

-0,040

Đạt

Ức gà tươi, 98 % nạc (ô nhiễm tự nhiên)

Thấp

5

3,458

0,061

1,76

...

...

...

0,035

1,03

0,068

-0,041

0,177

-0,016

0,151

Đạt

Trung bình

...

...

...

5,691

0,447

7,85

5,788

0,303

5,23

-0,097

-0,350

0,156

...

...

...

0,097

Đạt

Cao

5

7,487

0,334

4,46

7,333

0,260

...

...

...

0,153

-0,018

0,324

0,022

0,284

Đạt

^a DOM = chênh lệch của giá trị trung bình

^b Cl = Khoảng tin cậy đối với DOM

^c LCL = Giới hạn tin cậy thấp hơn đối với DOM

...

...

...

Bảng A.8 - Tóm tắt và thống kê dữ liệu so sánh phương pháp đối với quá trình ủ 48 h của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này

Nền mẫu

Mức ô nhiễm

N

TCVN 14284:2025, 48 h

MLG 3.02

DOM^a

95 % Cl^b

90 % Cl^b

...

...

...

Trung bình Log₁₀ CFU/g

s_r

RSD_r, %

Trung bình Log₁₀ CFU/g

s_r

RSD_r, %

LCL^c

UCL^d

LCL^c

...

...

...

Thịt bò xay tươi, 95 % nạc (ô nhiễm tự nhiên)

Thấp

5

2,552

0,145

5,68

2,368

0,109

4,60

...

...

...

0,016

0,352

0,055

0,313

Đạt

Trung bình

5

5,694

0,202

...

...

...

5,881

0,177

3,01

-0,186

-0,310

-0,063

-0,281

-0,091

Đạt

...

...

...

5

7,478

0,122

1,63

7,577

0,068

0,90

-0,099

-0,215

...

...

...

-0,188

-0,009

Đạt

Ức gà tươi, 98 % nạc (ô nhiễm tự nhiên)

Thấp

5

3,685

0,065

1,76

...

...

...

0,035

1,03

0,295

0,199

0,391

0,222

0,369

Đạt

Trung bình

...

...

...

5,728

0,457

7,98

5,788

0,303

5,23

-0,060

-0,343

0,222

...

...

...

0,156

Đạt

Cao

5

7,518

0,319

4,24

7,333

0,260

...

...

...

0,185

0,013

0,356

0,053

0,317

Đạt

^a DOM = Chênh lệch của giá trị trung bình

^b Cl = Khoảng tin cậy đối với DOM

^c LCL = Giới hạn tin cậy thấp hơn đối với DOM

...

...

...

Bảng A.9 - Tóm tắt và thống kê dữ liệu so sánh phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này với thời gian ủ 24 h và 48 h

Nền mẫu

Mức ô nhiễm

N

TCVN 14284:2025, 24 h

TCVN 14284:2025, 48 h

DOM^a

95 % Clb

90 % Cl^b

...

...

...

Trung bình Log₁₀ CFU/g

s_r

RSD_r, %

Trung bình Log₁₀ CFU/g

s_r

RSD_r, %

LCL^c

UCL^d

LCL^c

...

...

...

Thịt bò tươi xay, 95 % nạc (ô nhiễm tự nhiên)

Thấp

5

2,189

0,120

5,48

2,552

0,145

5,68

...

...

...

-0,465

-0,262

-0,441

-0,286

Đạt

Trung bình

5

5,519

0,214

...

...

...

5,694

0,202

3,55

-0,176

-0,206

-0,146

-0,199

-0,153

Đạt

...

...

...

5

7,399

0,174

2,35

7,478

0,122

1,63

-0,079

-0,157

...

...

...

-0,139

-0,019

Đạt

Ức gà tươi, 98 % nạc (ô nhiễm tự nhiên)

Thấp

5

3,458

0,061

1,76

...

...

...

0,065

1,76

-0,228

-0,295

-0,161

-0,279

-0,176

Đạt

Trung bình

...

...

...

5,691

0,447

7,85

5,728

0,457

7,98

-0,037

-0,081

0,007

...

...

...

-0,003

Đạt

Cao

5

7,487

0,334

4,46

7,518

0,319

...

...

...

-0,032

-0,083

0,020

-0,071

0,008

Đạt

^a DOM = Chênh lệch của giá trị trung bình

^b CI = Khoảng tin cậy đối với DOM

^c LCL = Giới hạn tin cậy thấp hơn đối với DOM

...

...

...

A.2  Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp do Microval và NMKL - NordVal International thực hiện

Microval và NMKL - NordVal International đánh giá độ chính xác và độ chụm của phương pháp thông qua cùng phòng thử nghiệm chuyên gia (Campden BRI).

A.2.1  Đánh giá so sánh phương pháp

A.2.1.1  Đánh giá độ đúng tương đối

Nghiên cứu độ đúng là nghiên cứu so sánh giữa kết quả thu được bằng phương pháp chuẩn [TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013)] và kết quả của phương pháp nêu trong tiêu chuẩn này. Nghiên cứu này được thực hiện bằng cách sử dụng các mẫu bị ô nhiễm tự nhiên.

Tổng cộng có 7 nhóm sản phẩm được đưa vào nghiên cứu xác nhận này. Tối thiểu 15 sản phẩm cho mỗi nhóm sản phẩm đã được thử nghiệm bằng cả phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế trong nghiên cứu độ đúng tương đối, với tối thiểu 15 kết quả có thể giải thích được cho mỗi nhóm sản phẩm. Xem Bảng A.10.

Mỗi nhóm sản phẩm được tạo thành từ 3 sản phẩm, với ít nhất 5 mẫu đại diện cho mỗi sản phẩm.

Bảng A.10 - Sản phẩm và số lượng mẫu phân tích

Nhóm sản phẩm

...

...

...

Phương pháp chuẩn bị mẫu

Số mẫu được phân tích

Số mẫu có kết quả có thể giải thích được

Sản phẩm sữa

Sữa bột

TCVN 6507-5 (ISO 6887-5)

5

5

Sản phẩm sữa tiệt trùng

...

...

...

5

Sữa thanh trùng

6

6

Sản phẩm thủy sản

Thủy sản nguyên liệu

TCVN 6507-3 (ISO 6887-3)

5

5

...

...

...

5

5

Thủy sản được axit hóa và tẩm ướp

5

5

Rau quả

Quả cắt sẵn để ăn liền

TCVN 6507-4 (ISO 6887-4)

5

...

...

...

Rau quả xử lý nhiệt

5

5

Nước rau quả

5

5

Thịt và sản phẩm thịt

Thịt tươi đã pha lọc

TCVN 6507-2 (ISO 6887-2)

...

...

...

5

Thịt xay

5

5

Thịt đã tẩm ướp sẵn để nấu

5

5

Sản phẩm thịt ăn liền hoặc gia nhiệt lại trước khi ăn

Thịt ăn liền đã nấu chín

...

...

...

5

5

Thịt lên men hoặc sấy khô

5

5

Thịt xông khói

5

5

Thức ăn dùng cho động vật cảnh và vật nuôi để làm thực phẩm

...

...

...

TCVN 6507-2 (ISO 6887-2)

5

5

Thức ăn khô

TCVN 6507-4 (ISO 6887-4)

5

5

Thức ăn chăn nuôi (gia cầm và cá)

5

...

...

...

Các mẫu môi trường (sản xuất thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi)

Nước dùng trong quá trình chế biến thực phẩm

TCVN 6507-1 (ISO 6887-1)

5

5

Bề mặt (khăn lau, gạc)

TCVN 6507-1 (ISO 6887-1)

TCVN 8129 (ISO 18593)

5

...

...

...

Bụi

5

5

106 mẫu đã được phân tích, thu được 106 kết quả.

Tất cả các mẫu được thử nghiệm đều bị ô nhiễm tự nhiên, không cần gây nhiễm nhân tạo.

Bản tóm tắt các giá trị được tính được cho mỗi nhóm sản phẩm được nêu trong Bảng A.11.

Bảng A.11 - Tổng hợp các giá trị tính được cho mỗi nhóm sản phẩm

Nhóm sản phẩm

Số mẫu,

...

...

...

Chênh lệch trung bình,

Độ lệch chuẩn của chênh lệch,

SD

Giới hạn dưới 95%

Giới hạn trên 95 %

Sản phẩm sữa

16

-0,021

...

...

...

-0,458

0,416

Sản phẩm thủy sản

15

-0,079

0,381

-0,924

0,765

Rau quả

...

...

...

-0,154

0,284

-0,783

0,474

Thịt và sản phẩm thịt

15

-0,021

0,214

-0,495

...

...

...

Sản phẩm thịt ăn liền hoặc gia nhiệt lại trước khi ăn

15

-0,127

0,188

-0,544

0,290

Thức ăn dùng cho động vật cảnh và vật nuôi để làm thực phẩm

15

-0,102

...

...

...

-0,630

0,427

Các mẫu môi trường

15

-0,202

0,227

-0,705

0,301

Tất cả các nhóm sản phẩm

...

...

...

-0,100

0,255

-0,608

0,408

A.2.1.2  Đánh giá độ chính xác

Thử nghiệm xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí nêu trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn [TCVN 4884 (ISO 4833)] ^[1] được thực hiện năm 2008 (các nền mẫu thịt gà nấu chín, cá đông lạnh, rau diếp, sữa bột và thịt bò tươi với năm mức độ ô nhiễm đã được sử dụng cho mỗi nền mẫu thực phẩm) và bổ sung năm 2019 (các nền mẫu sản phẩm sữa tráng miệng dạng bột, bít tết cá ngừ ướp lạnh, rau cải bỏ xôi, phi lê ức gà, pate gan lợn, pate dành cho chó, pate dành cho mèo, nước rửa và nước làm mát trong sản xuất thực phẩm, sử dụng các mẫu bị ô nhiễm nhân tạo) ^[17][18^]. Thời gian ủ là 72 h ± 3 h đối với phương pháp chuẩn và 48 h ± 3 h đối với phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này. Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp được nêu trong Bảng A.12.

Bảng A.12 - Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn [TCVN 4884 (ISO 4833)]

Nhóm sản phẩm

Sản phẩm

...

...

...

Độ lệch chuẩn lặp lại

Giới hạn chấp nhận được (AL)

TCVN 4884 (ISO 4833)

TCVN 14284:2025

Sản phẩm sữa

Sữa bột

E. faecalis NCIMB 1993

(mức nhiễm 10^2, 10^3 và 10^5 CFU/g)

0,190

...

...

...

± 0,760

Sản phẩm sữa tráng miệng, dạng bột

Bacillus cereus CRA 1724 từ sữa bột

(mức nhiễm 10^2, 10^3 và 10^4 CFU/g)

Sản phẩm thủy sản

Cá trắng đông lạnh

Nhiễm tự nhiên

(mức nhiễm 10^3, 10^4 và 10^5 CFU/g)

0,100

...

...

...

± 0,500

Bít tết cá ngừ ướp lạnh

Pseudomonas fragi CRA7222 từ cá thối

(mức nhiễm 10^2, 10^3 và 10^5 CFU/g)

Rau ăn sống

Rau diếp

Nhiễm tự nhiên

(mức nhiễm 10^2, 10^3 và 10^5 CFU/g)

0,261

...

...

...

± 1,044

Rau cải bó xôi

E. coli CRA3379 từ rau cải bó xôi

(mức nhiễm 10^2, 10^3 và 10^4 CFU/g)

Thịt tươi

Thịt bò xay

Nhiễm tự nhiên

(mức nhiễm 10^3, 10^6 và 10^7 CFU/g)

0,219

...

...

...

± 0,876

Phi lê ức gà

Citrobacter freundii CRA403 từ gà

(mức nhiễm 10^3, 10^5 và 10^6 CFU/g)

Thịt nấu chín

Thịt gà nấu chín

Nhiễm tự nhiên

(mức nhiễm 10^3, 10^5 và 10^6 CFU/g)

0,275

...

...

...

± 1,100

Pate gan lợn

Hafnia alvei CRA7417 từ pate (mức nhiễm 10^2, 10^3 và 10^5 CFU/g)

Thức ăn chăn nuôi

Pate dành cho chó

Staph. aureus CRA 1246 (từ xúc xích lợn)

(mức nhiễm 10^2, 10^3 và 10^5 CFU/g)

0,143

0,101

...

...

...

Pate dành cho mèo

Staph, aureus CRA 1246 (từ xúc xích lợn)

(mức nhiễm 10^2, 10^3 và 10^4 CFU/g)

Mẫu từ khâu sản xuất ban đầu

Nước rửa Nước làm mát

Pseudomonas fluorescens CRA 7774 (từ phòng rửa)

(mức nhiễm 10^2, 10^3 và 10^5 CFU/g)

0,088

0,037

...

...

...

Kết quả nghiên cứu so sánh phương pháp cho thấy phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này cho kết quả tương đương với phương pháp chuẩn. Mức được xác nhận thấp nhất với độ chính xác đạt yêu cầu dao động từ 2 log CFU/g đến 3 log CFU/g tùy thuộc vào nền mẫu.

A.2.2  Đánh giá độ chụm

Thử nghiệm đánh giá độ chụm của phương pháp có 13 phòng thử nghiệm tham gia, trong đó dữ liệu thống kê được lấy từ 12 phòng thử nghiệm (có 1 phòng thử nghiệm bị loại). Mẫu thử sữa tiệt trùng được cấy E. coli với lượng xác định. Mỗi phòng thử nghiệm nhận được 8 nền mẫu, mỗi mẫu 25 mL, bao gồm hai mẫu không gây nhiễm, hai mẫu gây nhiễm ở mức thấp (khoảng 10 CFU/mL đến 10^2 CFU/mL), hai mẫu gây nhiễm ở mức trung bình (102 CFU/mL đến 10^3 CFU/mL) và hai mẫu gây nhiễm ở mức cao (10^3 CFU/mL đến 10^4 CFU/mL).

Các phòng thử nghiệm thực hiện phân tích theo phương pháp chuẩn [TCVN 4884 (ISO 4833)] ^[1] sau 72 h và phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này sau 48 h. Kết quả được nêu trong Bảng A.13.

Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này và phương pháp chuẩn để định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí ở 30 °C.

Bảng A.13 - Kết quả đánh giá độ chụm của phương pháp định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí nêu trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn [TCVN 4884 (ISO 4833)]

Chỉ tiêu

Mức gây nhiễm thấp

Mức gây nhiễm trung bình

...

...

...

TCVN 14284:2025

TCVN 4884 (ISO 4833)

TCVN 14284:2025

TCVN 4884 (ISO 4833)

TCVN 14284:2025

TCVN 4884 (ISO 4833)

Số phòng thử nghiệm tham gia

13

13

...

...

...

13

13

13

Số phòng thử nghiệm bị loại trừ

1

1

1

1

1

...

...

...

Giá trị trung bình (log CFU/g)

2,78

2,70

3,70

3,84

4,77

4,85

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r)

0,08

...

...

...

0,04

0,04

0,06

0,05

Độ lệch chuẩn giữa các phòng thử nghiệm (s_L)

0,00

0,08

0,15

0,08

...

...

...

0,10

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R)

0,08

0,10

0,16

0,09

0,17

0,10

Độ chệch

...

...

...

-0,14

-0,08

Giới hạn TI dưới tương đối (beta = 80%)

-0,02

-0,36

-0,33

Giới hạn TI trên tương đối (beta = 80%)

0,18

0,08

...

...

...

Giới hạn chấp nhận dưới

-0,5

-0,5

-0,5

Giới hạn chấp nhận trên

0,5

0,5

0,5

...

...

...

[1] TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ C

[2] TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng vi sinh vật - Phần 1: Đếm khuẩn lạc ở 30 °C bằng kỹ thuật đổ đĩa

[3] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu

[4] TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007 with Amendment 1:2013), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

[5] TCVN 6507-1:2019 (ISO 6887-1:2017), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân

[6] TCVN 7925 (ISO 17604), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Lấy mẫu thân thịt để phân tích vi sinh vật

[7] TCVN 8129 (ISO 18593), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp lấy mẫu bề mặt

[8] TCVN 11923 (ISO/TS 17728), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lẩy mẫu để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

[9] TCVN 12365-2:2018 (ISO 16140-2:2016), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp - Phần 2: Quy trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thay thế so với phương pháp chuẩn

...

...

...

[11] ISO 11139:2018, Sterilization of health care products - Vocabulary of terms used in sterilization and related equipment and process standards

[12] ISO 16140-6, Microbiology of the food chain - Method validation - Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation and typing procedures

[13] AOAC 966.23, Microbiological Methods

[14] AOAC Research Institute (2021), AOAC Performance Tested^SM, Certificate No. 010401, Compact Dry Total Count

[15] Food Safety and Inspection Service - U.S. Department of Agriculture (2015), FSIS MLG 3.02 Quantitative Analysis of Bacteria in Foods as Sanitary indicators: Chapter 3.6 Aerobic Plate Count

[16] Department of Agriculture and Water Resources (Australia), Compact Dry TC-AOAC 010401

[17] NMKL - NordVal International (2023), Compact Dry TC Method for the Enumeration of total viable organisms

[18] Microval (2019), Method Comparison Study Report for the ISO 16140-2:2016 validation of Compact Dry TC for the enumeration of total viable organisms in a broad range of foods

[19] Kodaka H., Mizuochi S., Teramura H., Nirazuka T. (2005), “Comparison of the Compact Dry TC method with the standard pour plate method (AOAC official method 966.23) for determining aerobic colony counts in food samples: Performance-tested method”, Journal of AOAC International,. Volume 88, Issue 6, Pages 1702-13

...

...

...

1) Phương pháp này có thể rút ngắn thời gian thực hiện một ngày so với phương pháp chuẩn nêu trong TCVN 4884 (ISO 4833) ^[2].