Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6507-1:2019 về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phần 1

• Số hiệu: TCVN6507-1:2019
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2019

Môi trường	Ủ	Vi sinh vật thử nghiệm	Số lượng WDCM^a	Môi trường đối chứng	Phương pháp kiểm chứng	Tiêu chí
Dung dịch pha loãng muối pepton Dung dịch đệm pepton (nồng độ đơn và nồng độ kép) Dung dịch pepton Dịch pha loãng đệm phosphat	45 min đến 1 h ở nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm (18 °C đến 27 °C)	Escherichia coli^c Staphylococcus aureus	00012 hoặc 00013 00034^b	TSA	Định lượng	± 30 % số đếm ban đầu
^a Xem danh mục chủng chuẩn đối chứng có sẵn trên website http://www.wfcc.info về thông tin số lượng bộ sưu tập chủng nuôi cấy và chi tiết liên hệ. ^b Chủng tối thiểu cần sử dụng. ^c Tự do lựa chọn một trong các chủng tối thiểu phải sử dụng.

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

6.1  Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) và thiết bị để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]

6.2  Thiết bị đồng hóa

6.2.1  Bộ đồng hóa quay (bộ trộn)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218). Nếu cần đồng hóa lượng mẫu lớn, thiết bị cần bao gồm bình 1 L vô trùng.

6.2.2  Bộ đồng hóa kiểu nhu động

Xem TCVN 6404 (ISO 7218). Có các túi vô trùng hoặc các túi lọc để giữ lại các hạt khi cần.

6.3  Máy khuấy cơ, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

...

...

...

6.5  Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml và 10 ml, được chia vạch theo 0,1 ml và 0,5 ml tương ứng. Có thể sử dụng các pipet tự động cơ có độ chính xác thích hợp [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

6.6  Máy đo pH, có thể đọc được đến 0,01 đơn vị pH ở 25 °C, có thể đo chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

6.7  Cân và bộ pha loãng, có thể cân chính xác đến 1 % khối lượng [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

6.8  Khay đựng mẫu vô trùng, có kích thước thích hợp.

6.9  Kéo, kẹp hoặc cặp vô trùng, dao hoặc thìa dẹt và dao trộn.

6.10  Dụng cụ mở đặc biệt, để mở chai và nắp hộp.

6.11  Dụng cụ thu nhận phần mẫu thử từ mẫu phòng thử nghiệm đông lạnh

6.11.1  Máy khoan điện có thể thay đổi tốc độ, tốc độ tối đa 900 r/min hoặc khoan cầm tay.

6.11.2  Mũi khoan gỗ vô trùng dùng cho khoan điện, đường kính 14 mm hoặc 16 mm.

...

...

...

6.11.4  Dụng cụ khác không làm tăng nhiệt hoặc nhiễm bẩn mẫu.

6.11.5  Dụng cụ đốt bề mặt mẫu, ví dụ: đèn thổi khí cầm tay.

6.11.6  Khuôn lấy mẫu bề mặt, có khung kim loại với kích thước phù hợp để xác định bề mặt cần lấy mẫu, đã khử trùng bằng cách đốt trên lửa sau khi nhúng trong cồn 70 % (thể tích).

6.12  Nồi cách thủy, có khả năng duy trì ở 44 °C đến 47 °C hoặc phù hợp với các mục đích cụ thể.

6.13  Bình, vật chứa hoặc túi bằng chất dẻo cổ rộng vô trùng, dung tích 500 ml.

6.14  Hạt hoặc bi thủy tinh vô trùng, để phân tán các mẫu như gạc.

7  Lấy mẫu

Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể tương ứng với sản phẩm hoặc xem TCVN 11923 (ISO/TS 17728). Nếu không có các hướng dẫn lấy mẫu cụ thể thì các bên liên quan tự thỏa thuận về vấn đề này.

Một số hướng dẫn có trong các phần khác của TCVN 6507 (ISO 6887) về việc lấy mẫu cụ thể đối với các sản phẩm nhất định [xem ví dụ trong TCVN 6507-3 (ISO 6887-3)].

...

...

...

8.1  Yêu cầu chung

Các yêu cầu đối với danh mục các loại sản phẩm chung khác nhau cần kiểm tra vi sinh được nêu trong điều này. Đối với các yêu cầu cụ thể về các loại sản phẩm nhất định, xem phần thích hợp của TCVN 6507 (ISO 6887) để biết thêm thông tin.

Trong các trường hợp khác, xem tiêu chuẩn cụ thể phù hợp với sản phẩm liên quan. Nếu không có sẵn tiêu chuẩn cụ thể thì các bên có liên quan tự thỏa thuận về vấn đế này.

8.2  Sản phẩm đông lạnh

8.2.1  Yêu cầu chung

Sản phẩm đông lạnh được xem xét như sau:

- các mẫu phòng thử nghiệm nhỏ có thể được rã đông trước khi thử nghiệm;

- các tảng hoặc khối lớn để lấy ra mẫu phòng thử nghiệm hoặc phần mẫu thử mà không cần rã đông.

8.2.2  Các mẫu nhỏ được rã đông trước khi thử nghiệm

...

...

...

Các sản phẩm ở trên dạng đông lạnh được bảo quản và gửi đến phòng thử nghiệm cần phải ổn định, cho phép lấy mẫu trong bao bì gốc. Điều này có thể đạt được bằng cách để mẫu ở 18 °C đến 27 °C (nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm) trong tối đa 3 h, hoặc ở 5 °C ± 3 °C tối đa 24 h. Để các mẫu rã đông trên các khay riêng biệt (6.8) để tránh nhiễm chéo từ chất lỏng rã đông rò rỉ qua bao bì.

Các mẫu phải được thử nghiệm càng nhanh càng tốt ngay sau khi lấy phần mẫu thử, thậm chí khi sản phẩm vẫn còn đông lạnh một phần, vì việc thêm dịch pha loãng ở nhiệt độ phòng thử nghiệm sẽ dễ dàng cho quá trình rã đông hoàn toàn.

Không nên rã đông trong nồi cách thủy có kiểm soát nhiệt độ hoặc dưới vòi nước lạnh vì điều này có thể dẫn đến nhiễm bẩn mẫu nếu bao bì không kín nước hoàn toàn.

8.2.3  Các miếng hoặc khối lớn được lấy mẫu trong khi đông lạnh

8.2.3.1  Yêu cầu chung

Các mẫu này bao gồm các miếng hoặc khối lớn của các sản phẩm đông lạnh (thường trên 2 kg), bao gồm cả thân thịt và khối cá đông lạnh.

Dùng dao hoặc kéo (6.9) tách mẫu ra khỏi bao gói và đặt mẫu lên khay (6.8) với mặt phẳng hướng lên trên.

Có ba lựa chọn để lấy mẫu phụ thuộc vào mục đích thử nghiệm và yêu cầu của khách hàng. Nếu chưa biết yêu cầu lấy mẫu hoặc chưa được quy định thì các bên có liên quan tự thỏa thuận về vấn đề này.

8.2.3.2  Tổng lượng mẫu (bề mặt và mẫu sâu)

...

...

...

Sử dụng thìa vô trùng (6.9), thu lấy các mảnh mẫu khoan cho vào hộp đựng hoặc túi chất dẻo (6.13) đã cản bì, được sử dụng để đồng nhất. Nếu khối lượng lớn hơn 50 g, trộn đều các mảnh khoan trong vật chứa hoặc túi chất dẻo khác để cung cấp mẫu thử, sau đó lấy ra phần mẫu thử đồng nhất cuối cùng đề thử nghiệm.

Toàn bộ hoạt động lấy mẫu không được làm tăng đáng kể nhiệt độ của mẫu để không làm ảnh hưởng bất kỳ vi sinh vật nào có mặt.

8.2.3.3  Chỉ lấy mẫu sâu

Sử dụng đục gỗ và búa (6.11.3), bỏ đi lớp bề mặt dày 2 mm đến 3 mm khỏi vùng diện tích khoảng 6 cm x 6 cm.

Đốt vùng tiếp xúc bằng dụng cụ đốt mẫu bề mặt (6.11.5) cho đến khi bề mặt cháy hoàn toàn. Sau đó tiến hành theo 8.2.3.2, khoan các lỗ trên vùng đã cháy mà không sâu quá bề mặt dưới của khối.

8.2.3.4  Chỉ lấy mẫu bề mặt

Khử trùng khuôn lấy mẫu (6.11.6) và đục gỗ (6.11.3) bằng cách nhúng trong cồn 70 % (thể tích) và đốt trên ngọn lửa. Trong khi khuôn mẫu vẫn còn nóng, áp lên bề mặt của sản phẩm đông lạnh.

Sử dụng đục gỗ và búa vô trùng (6.11.3), lấy lớp trên của sản phẩm đến độ sâu từ 2 mm đến 3 mm. Thu lấy các miếng và cho vào hộp đựng hoặc túi bằng chất dẻo (6.13.) đã cân bì được sử dụng để đồng nhất.

8.3  Sản phẩm cứng và khô

...

...

...

Đối với một số sản phẩm cứng và khô, có thể cần phải băm hoặc nghiền mẫu phòng thử nghiệm. Trong trường hợp này, để tránh tăng nhiệt quá mức, không nghiền hoặc xay quá 1 min.

8.4  Sản phẩm đã loại nước hoặc có độ ẩm thấp khác

Trộn kỹ các sản phẩm dạng bột trong bao bì và sau đó cân chúng bằng các kỹ thuật vô trùng.

Các sản phẩm khác có thể cần làm vỡ hoặc cắt thành các mảnh nhỏ bằng dụng cụ vô trùng (6.9) trước khi lấy mẫu.

Đối với các sản phẩm đã loại nước và sản phẩm có độ ẩm thấp khác, điều quan trọng là cân dịch pha loãng và sau đó thêm phần mẫu thử để giảm sốc thẩm thấu đối với bất kỳ vi sinh vật nào có mặt.

Các sản phẩm có độ ẩm thấp có thể cần một khoảng thời gian (lên đến 1 h) để ngâm trong dịch pha loãng được sử dụng cho huyền phù ban đầu để làm mềm trước khi đồng nhất và các thao tác tiếp theo. Xem TCVN 6507-4 (ISO 6887-4) đối với các yêu cầu chi tiết cho các loại sản phẩm độ ẩm khác nhau.

Xem TCVN 6507-4 (ISO 6887-4) để biết thêm thông tin về việc chuẩn bị các sản phẩm có độ ẩm thấp trước khi thử nghiệm các nhóm vi sinh vật cụ thể, ví dụ như nấm men và nấm mốc.

8.5  Sản phẩm lỏng và không sánh

Trước khi lấy phần mẫu thử, mẫu phòng thử nghiệm phải được lắc bằng tay (ví dụ: 25 lần với biên độ 25 cm) hoặc bằng phương tiện cơ học để đảm bảo rằng các vi sinh vật được phân bố đồng đều.

...

...

...

Điều quan trọng khi chuẩn bị huyền phù các sản phẩm có tính axit là đưa pH đến gần mức trung tính (pH 7,0 ±0,5).

Việc sử dụng dung dịch đệm pepton (5.2.2) là đủ cho hầu hết các sản phẩm có pH lớn hơn hoặc bằng 4,5. Các sản phẩm có tính axit cao (lớn hơn hoặc bằng pH 3,5) có thể được đưa trở lại pH cần thiết bằng cách sử dụng dung dịch đệm pepton nồng độ kép (5.2.3.), nhưng cần kiểm tra độ pH của các sản phẩm đó khi chúng được thử nghiệm lần đầu tiên để đảm bảo đạt được dải yêu cầu.

Các mẫu tiếp tục được axit hóa trong quá trình ủ các chủng cấy tăng sinh sơ bộ không chọn lọc, ví dụ: sữa chua "men sống" và các sản phẩm nuôi cấy tương tự, có thể giảm pH nuôi cấy trong quá trình ủ và cần được theo dõi để kiểm tra pH vẫn trên 4,5. Có thể sử dụng lượng chất đệm tăng lên, nhưng việc tăng sinh sơ bộ đã được điều chỉnh của các sản phẩm đó phải được xác nhận để đảm bảo các điều kiện đáp ứng được cho sự phát triển của các vi sinh vật cụ thể cần tìm.

Xem TCVN 6507-4 (ISO 6887-4) để biết thêm thông tin về việc chuẩn bị các sản phẩm có tính axit trước khi thử nghiệm về các nhóm vi sinh vật cụ thể như acidophil.

8.7  Thực phẩm giàu chất béo (trên 20 %)

Tùy theo mức chất béo, có thể cải thiện quá trình nhũ hóa trong quá trình tạo huyền phù bằng cách sử dụng dịch pha loãng từ 1 g/L đến 10 g/L polysorbat 80 [polyoxyetylen (20) sorbitan monooleat].

Nhìn chung, với hàm lượng chất béo 10 % thì bổ sung 1 g/L là thích hợp (ví dụ: đối với hàm lượng chất béo là 40 %, thì thêm 4 g/L).

Xem TCVN 6507-4 (ISO 6887-4) để biết thêm thông tin về việc kiểm tra các thực phẩm giàu chất béo.

8.8  Sản phẩm nhiều thành phần

...

...

...

Nên đồng hóa toàn bộ mẫu phòng thử nghiệm vì điều này sẽ cho mẫu thử đồng nhất hơn để kiểm tra tiếp phần mẫu thử (xem Phụ lục C).

Nếu cần, xay hoặc nghiền mẫu phòng thử nghiệm. Trong trường hợp nảy, thời gian xay hoặc nghiền không quá 1 min để tránh bị quá nhiệt.

8.9  Sản phẩm đóng gói

Các sản phẩm đóng gói được gửi đến phòng thử nghiệm có nhiều loại nhưng chúng được chia thành hai nhóm như sau:

- bao bì mềm: được gỡ bỏ hoặc mở vô trùng bằng kéo hoặc dao (6.9);

- bao bì cứng (lon, hộp thủy tinh, v.v...) được mở bằng các dụng cụ thích hợp (6.10) trong điều kiện vô trùng.

Tất cả các thao tác, trước và sau khi mở các thực phẩm đóng gói, phải được thực hiện vô trùng để tránh nhiễm chéo từ bên ngoài.

Nếu có thể, sau khi mở lấy lượng bên trong một cách vô trùng mà không làm nhiễm chéo từ bên ngoài, không cần làm sạch và khử trùng bao bì.

Làm sạch bề mặt bao bì cứng hoặc nửa cứng bằng chất tẩy rửa nhẹ trong nước, sau đó lau khô bằng khăn sạch hoặc giấy thấm mới. Nếu bao bì quá mỏng và có thể bị hỏng do làm ướt (ví dụ: các miếng thực phẩm được đóng gói trong màng hoặc vật chứa dẻo) thì bỏ qua bước này và chỉ khử trùng.

...

...

...

Cẩn thận mở màng bọc thực phẩm trên các khay bằng cách bóc lớp màng đóng gói để lộ ra thực phẩm cần lấy mẫu.

Đối với thực phẩm được đóng gói trong môi trường có kiểm soát và thực phẩm đóng gói chân không, mở bao bì kín bằng dao hoặc kéo và kẹp hoặc cặp (6.9) vô trùng.

8.10  Mẫu bề mặt (gạc và các dụng cụ khác)

Trộn các miếng gạc hoặc các dụng cụ khác như vải hoặc khăn lau, trong cùng dịch pha loãng như được sử dụng để bão hòa chúng khi lấy mẫu và/hoặc vận chuyển chúng, để phân tán các vi sinh vật bám vào [xem TCVN 8129 (ISO 18593)].

Để làm việc này, bẻ que, cho gạc vào lắc với dịch pha loãng quy định để tạo huyền phù ban đầu. Có thể cho hạt hoặc bi thủy tinh nhỏ (6.14) để hỗ trợ phân tán các sinh vật bị giữ lại trên gạc hoặc các dụng cụ khác.

Sử dụng huyền phù tạo thành làm huyền phù ban đầu.

Đối với các mẫu bề mặt, cần ghi lại độ pha loãng ban đầu. Ví dụ, từ mẫu (gạc hoặc loại khác) từ diện tích bề mặt 25 cm^2 và được pha loãng trong tổng thể tích 25 ml dịch pha loãng, 1 ml huyền phù ban đầu này tương ứng với 1 cm^2.

9  Cách tiến hành

9.1  Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu)

...

...

...

CHÚ THÍCH: Sử dụng các phần mẫu thử lớn hơn lượng quy định tối thiểu sẽ tăng độ tin cậy của các kết quả định lượng ^[6] (xem ví dụ trong Phụ lục C).

Bổ sung một lượng dịch pha loãng 9 x m g hoặc 9 x V ml để chuẩn bị dung dịch pha loãng thập phân ban đầu. Lượng thêm này có thể được cân hoặc đong tốt nhất là theo khối lượng với sai số cho phép là ± 2 %, nhưng có thể thực hiện phép đo theo thể tích, miễn là sai số cho phép không vượt quá ± 2 %. Có thể cần các dung dịch pha loãng ban đầu khác, có tỷ lệ độ pha loãng phần mẫu thử thấp hơn hoặc cao hơn cho các mục đích đặc biệt; các dung dịch này được chuẩn bị sử dụng cùng sai số cho phép.

Khi chuẩn bị độ pha loãng 1:10, thông thường huyền phù của một số sản phẩm nhất định có thể bị sánh hoặc đặc, vì vậy cần bổ sung dịch pha loãng để tạo thuận lợi cho thử nghiệm tiếp theo. Trong các trường hợp như vậy, dịch pha loãng phải được bổ sung với các tỷ lệ khác (ví dụ: 1:20, 1:50, 1:100) cho đến khi thu được huyền phù ban đầu thích hợp cho các thao tác tiếp theo, cần tính đến các tỷ lệ chưa chuẩn hóa trong các thao tác tiếp theo, đặc biệt là trong việc tính và biểu thị kết quả.

Trong các trường hợp khác, sản phẩm được thử nghiệm có lượng vi sinh vật thấp và huyền phù ban đầu dạng lỏng phù hợp, thì nên chuẩn bị huyền phù ở tỷ lệ thấp hơn (ví dụ: 1:2 hoặc 1:5). Tuy nhiên, việc sử dụng huyền phù ban đầu với tỷ lệ thấp hơn như vậy có thể dẫn đến mất cân bằng tỷ lệ giữa lượng cấy và môi trường, ở giai đoạn cấy chọn lọc tiếp theo trong hoặc trên môi trường đặc hoặc vào môi trường lỏng (ví dụ: ức chế sự phát triển của vi khuẩn do nồng độ của các thành phần thực phẩm tăng), cách này cần được sử dụng thận trọng và được kiểm tra xác nhận cho từng trường hợp.

Để tránh ức chế các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ của tất cả các dịch pha loãng phải gần giống nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm, trừ khi có quy định khác đối với các sản phẩm cụ thể (xem tiêu chuẩn cụ thể).

Đồng hóa hỗn hợp theo các yêu cầu trong TCVN 6404 (ISO 7218), sử dụng các thiết bị như trong 6.2.

Để cho các hạt lớn lắng xuống, tối đa 15 min, nếu cần. Có thể sử dụng hệ thống lọc cho kết quả tương đương, như túi chất dẻo có lớp lót lọc thích hợp.

Để đếm các bào tử, việc xử lý nhiệt huyền phù ban đầu (ví dụ 10 min ± 1 min ở 80 °C ± 5 °C) phải được thực hiện ngay sau khi chuẩn bị huyền phù, sau đó làm lạnh nhanh (ví dụ: dưới nước lạnh) để giảm thiểu sự hao hụt các bào tử đích sau đó.

9.2  Thời gian tiến hành

...

...

...

Ngoài ra, thời gian kể từ khi chuẩn bị huyền phù ban đầu (9.1) đến khi bắt đầu chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo (Điều 10) không được vượt quá 30 min.

Nếu nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm cao và nằm ngoài dải quy định (> 27 °C) thì hai khoảng thời gian tối đa nêu trên phải rút ngắn để giảm thiểu khả năng phát triển của vi sinh vật và làm cho kết quả cao hơn.

Nếu thời gian phục hồi để tối đa hóa độ thu hồi các vi sinh vật bị ức chế được yêu cầu theo tiêu chuẩn cụ thể, thì phải tính thời gian khi huyền phù ban đầu đã được chuẩn bị và các bước pha loãng tiếp theo bắt đầu ngay sau khi giai đoạn này kết thúc.

9.3  Quy trình gộp và kết hợp đối với các phép thử định tính

Có bốn giải pháp để kết hợp các bước kiểm tra định tính các mẫu sản phẩm hoặc mẫu môi trường cùng loại từ cùng một nguồn hoặc cùng một xuất xứ, để giảm khối lượng công việc khi cần kiểm tra một số lượng lớn mẫu (xem Điều 3 về các định nghĩa). Điều này có thể cần thiết để phản ánh chất lượng của một mẻ lớn mẫu sản phẩm hoặc mẫu môi trường về vi sinh vật hoặc đôi khi theo yêu cầu của luật pháp.

Một số mẫu cùng loại có thể được kết hợp hoặc gộp lại ở giai đoạn lấy mẫu và khách hàng phải làm rõ điều này khi nhận mẫu phòng thử nghiệm để đảm bảo quy trình thử nghiệm tiếp theo được thực hiện chính xác. Việc kết hợp các mẫu riêng lẻ cũng có thể được thực hiện tại phòng thử nghiệm nếu khách hàng khẳng định điều này là bắt buộc. Hai quy trình này được minh họa trong Hình A.1 và Hình A.2 (xem Phụ lục A).

Việc gộp các phần mẫu thử cũng có thể được thực hiện trong phòng thử nghiệm và việc kiểm tra tiếp tục với số lượng lớn hơn các môi trường đã làm ấm trước như minh họa trong Hình A.3 (xem Phụ lục A). Cần theo dõi nhiệt độ và thời gian ủ tối đa cho phép được sử dụng để tránh kết quả âm tính giả gây ra do độ trễ nhiệt độ trong các thể tích lớn hơn. Cách khác, gộp các chủng cấy tăng sinh sơ bộ của các phần mẫu thử riêng lẻ có thể (xem Hình A.4) và được thực hiện theo phép thử riêng.

Tất cả các quy trình này phải được kiểm tra xác nhận trước khi sử dụng để không làm tăng nguy cơ kết quả âm tính giả; ví dụ về quy trình kiểm tra xác nhận phù hợp, được nêu trong Phụ lục D.

10  Dung dịch pha loãng tiếp theo

...

...

...

Đối với dãy dung dịch pha loãng thập phân để sử dụng trong các phép thử định lượng, sử dụng pipet (6.5), chuyển 1 ml ± 0,02 ml huyền phù ban đầu vào ống nghiệm chứa 9 ml ± 0,2 ml dịch pha loãng vô trùng ở nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm (trừ khi có quy định khác trong tiêu chuẩn cụ thể). Tránh mọi tiếp xúc giữa pipet chứa chất cấy và dịch pha loãng vô trùng để giảm thiểu khả năng nhiễm chéo.

CHÚ THÍCH: Nếu cần một thể tích lớn hơn để thực hiện một số lượng lớn các phép thử hoặc phép thử lặp lại, thì thể tích xác định (hơn 1 ml) của huyền phù ban đầu, với dung sai cho phép ± 2 %, có thể được thêm vào ống nghiệm chứa chín lần thể tích dịch pha loãng vô trùng.

Để có độ chụm tối ưu, không đưa pipet sâu quá 1 cm vào huyền phù ban đầu và tránh lấy các hạt sản phẩm thực phẩm trong chất cấy.

Trộn kỹ, tốt nhất là bằng cách sử dụng máy khuấy cơ học (6.3) trong 5 s đến 10 s, để thu được độ pha loãng 10^-2.

Nếu cần, lặp lại các bước này bằng cách sử dụng các dung dịch pha loãng 10^-2 và dung dịch pha loãng tiếp theo và sử dụng một pipet hoặc đầu tip vô trùng mới cho mỗi thao tác, để thu được đủ độ pha loãng (10^-3, 10^-4, v.v...) đếm được số lượng vi sinh vật thích hợp ở dải tối ưu cho việc đếm (xem Điều 4). Trình tự thao tác để chuẩn bị nhiều dung dịch pha loãng thập phân thích hợp cho các mức ô nhiễm dự đoán khác nhau và sử dụng kỹ thuật đổ đĩa được thể hiện trong Hình 1.

Hình 1 - Trình tự chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân - Ví dụ về kỹ thuật đổ đĩa

10.2  Các dãy dung dịch pha loãng khác

Chuẩn bị các dãy dung dịch pha loãng khác được yêu cầu cho các mục đích đặc biệt, ví dụ: 1 trong 2 (1 ml vào 1 ml), 1 trong 5 (1 ml vào 4 ml), theo cách tương tự bằng cách sử dụng các tỷ lệ khác nhau của huyền phù ban đầu để pha loãng. Ghi lại tỷ lệ và tính đến trong các bước tiếp theo, như tính và biểu thị kết quả.

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Minh họa về quy trình gộp và kết hợp

A.1  Yêu cầu chung

Những minh họa này cho thấy các quy trình gộp và kết hợp, được nêu trong Điều 3, chỉ có thể được sử dụng để thử nghiệm định tính. Quy trình thử nghiệm được đưa ra trong TCVN 6507-1 (ISO 6579-1) để phát hiện Salmonella là một ví dụ, nhưng cũng có thể áp dụng các quy trình tương tự cho các phương pháp phát hiện khác.

Có thể kết hợp các mẫu (xem Hình A.1) hoặc gộp (xem Hình A.2) cùng loại, để giảm khối lượng công việc khi cần phải kiểm tra một số lượng lớn mẫu. Điều này có thể cần để phản ánh chất lượng vi sinh của một mẻ sản phẩm lớn hoặc mẫu môi trường hoặc theo quy định.

Tương tự, có thể gộp một số phần mẫu thử (xem Hình A.3) và kiểm tra cùng nhau trong một lượng lớn môi trường, hoặc gộp các nuôi cấy tăng sinh sơ bộ của các phần mẫu thử lại và tiến hành như với một phần mẫu thử.

Tất cả các quy trình này phải được kiểm tra xác nhận trước khi sử dụng để không làm tăng nguy cơ kết quả âm tính giả. Ví dụ về quy trình kiểm tra xác nhận phù hợp được nêu trong Phụ lục D.

A.2  Mẫu kết hợp

...

...

...

Hình A.1 - Mẫu kết hợp

A.3  Mẫu gộp

Một số đơn vị mẫu cùng loại được gộp thành một mẫu và trộn trước khi lấy ra phần mẫu thử như trong hình A.2.

Hình A.2 - Mẫu gộp

A.4  Phần mẫu thử gộp

Các phần mẫu thử từ một số đơn vị mẫu cùng loại được trộn lẫn thành một phần mẫu thử sử dụng cho bước kiểm tra tiếp theo (xem Hình A.3).

...

...

...

A.5  Phần mẫu thử đã tăng sinh sơ bộ

Các phần mẫu thử của một số đơn vị mẫu cùng loại đã được tăng sinh sơ bộ và từ mỗi phần tăng sinh này lấy ra một lượng xác định dịch tăng sinh kết hợp lại để kiểm tra tiếp theo (xem Hình A.4).

Hình A.4 - Phần mẫu thử tăng sinh sơ bộ gộp lại

Phụ lục B

(Tham khảo)

Phương pháp lấy mẫu các miếng thử hoặc khối đông lạnh

B.1  Khối không đồng nhất

...

...

...

Hình B.1 - Quy trình đối với khối sản phẩm đã loại nước đồng nhất

B.2  Miếng thử nghiệm đồng nhất

Đối với các miếng thử nghiệm đồng nhất, các điểm khoan và giới hạn độ sâu như trong Hình B.2.

CHÚ DẪN

1  vùng đốt

2  khay đựng

Hình B.2 - Quy trình đối với các mẫu thử đồng nhất

...

...

...

Phụ lục C

(Tham khảo)

Dữ liệu cho thấy độ tin cậy của các kết quả thử nghiệm theo cỡ mẫu phần mẫu thử

C.1  Yêu cầu chung

Dữ liệu có sẵn cho thấy rằng, sử dụng phần mẫu thử càng lớn thì càng ít phương sai xảy ra giữa các kết quả thử lặp lại của cùng loại mẫu (6). Dữ liệu nêu trong phụ lục này dựa trên hồ sơ thử nghiệm được xây dựng và sử dụng ở Hà Lan và Pháp.

C.2  Nghiên cứu của Hà Lan so sánh các cỡ mẫu khác nhau và ảnh hưởng của quá trình đồng nhất mẫu

Từ ba loại mẫu mỗi mẫu lấy 600 g (rau thái sẵn, cơm dĩa Trung Quốc và sữa lắc hoặc kem mềm) được sử dụng để so sánh sự khác biệt về tính đồng nhất của từng loại mẫu, cùng với bốn quy trình chuẩn bị mẫu khác nhau. Các phần mẫu thử cho hai mẫu được lấy mà không cần đồng nhất trước, trong khi hai mẫu thử được đồng nhất trước khi lấy các phần mẫu thử (xem Bảng C.1).

Bảng C.1 - Thiết kế nghiên cứu hiệu quả của phương pháp chuẩn bị mẫu và kích cỡ phần mẫu thử

Phương pháp chuẩn bị mẫu

...

...

...

Phần mẫu thử

Pha loãng phần mẫu thử

T1

Không

10 g

1 trong 10

T2

Có (100 g)

10 g

...

...

...

T3

Có (100 g, 1 với 1 dịch pha loãng)

20 g

1 trong 5

T4

Không

35 g

1 trong 10

Đối với các mẫu được chuẩn bị mà không đồng nhất, hai kích cỡ phần mẫu thử được sử dụng: tối thiểu 10 g quy định cho các phép thử định lượng trong nhiều tiêu chuẩn cụ thể (T1) và phần mẫu thử lớn hơn là 35 g (T4).

...

...

...

Quy trình chuẩn bị mẫu thử kiểm tra số đếm khuẩn lạc hiếu khí, sử dụng hệ số pha loãng cuối cùng là 1 trong 10.

Kết quả nghiên cứu đã được kiểm tra phương sai bằng cách sử dụng phép thử F và được thể hiện trong Bảng C.2.

Bảng C.2 - Ảnh hưởng của bốn kỹ thuật chuẩn bị mẫu đến phương sai kết quả từ ba loại mẫu

Nền mẫu (số mẫu)

Kết quả

Chuẩn bị mẫu T1

(10 g)

Chuẩn bị mẫu T2

(100 g)

...

...

...

(100 g)

Chuẩn bị mẫu T4

(35 g)

Rau thái sẵn (18)

Trung bình

0,150

0,164

0,111

0,172

...

...

...

0,128

0,179

0,071

0,183

Phương sai

0,016

0,032

0,005

0,003

...

...

...

Trung bình

0,285

0,218

0,104

0,216

Độ lệch chuẩn

9,261

0,239

0,072

...

...

...

Phương sai

0,068

0,057

0,005

0,056

Sữa lắc hoặc kem mềm (8)

Trung bình

0,094

0,064

...

...

...

0,115

Độ lệch chuẩn

0,142

0,035

0,042

0,092

Phương sai

0,020

0,001

...

...

...

0,008

Tổng

Trung bình

0,201

0,171

0,101

0,182

Độ lệch chuẩn

0,212

...

...

...

0,068

0,199

Phương sai

0,045

0,040

0,005

0,040

Các dữ liệu này phù hợp với các công trình được công bố khác ^[6] cho thấy phương sai ít nhất cho cả ba loại mẫu đồng nhất khác nhau thu được khi các mẫu lớn nhất (100 g) được đồng nhất, có hoặc không pha loãng trước theo tỷ lệ 1:1.

C.3  Nghiên cứu của Pháp so sánh bảy kỹ thuật chuẩn bị mẫu khác nhau

...

...

...

Bảng C.3 - Thiết kế nghiên cứu cho thấy hiệu quả của phương pháp chuẩn bị mẫu và cỡ mẫu thử

Phương pháp chuẩn bị mẫu

Đồng nhất mẫu

Phần mẫu thử

Pha loãng phần mẫu thử

T1

Không

10 g lấy từ 1 vùng

1 trong 10

...

...

...

Không

10 g lấy từ 5 vùng

1 trong 10

T3

Có (toàn bộ mẫu)

10 g

1 trong 10

T4

Có (toàn bộ mẫu, 1 với 1 dịch pha loãng)

...

...

...

1 trong 5

T5

Không

35 g lấy từ 1 vùng

1 trong 10

T6

Không

35 g lấy từ 5 vùng

1 trong 10

...

...

...

Có (100 g, 1 với 1 dịch pha loãng)

20 g

1 trong 5

Nghiên cứu này tương tự như mô tả trong C.2, với biến thiên tiếp theo khi lấy các phần mẫu thử từ một vùng duy nhất của mẫu (T1 và T5) hoặc từ năm vùng khác nhau (T2 và T6) trên toàn bộ mẫu. Kỹ thuật T7 tương tự như kỹ thuật T4 ngoại trừ mẫu 100 g được sử dụng thay vì toàn bộ mẫu.

Tất cả các phần mẫu chuẩn bị được kiểm tra về số đếm khuẩn lạc hiếu khí, sử dụng hệ số pha loãng cuối cùng là 1 trong 10.

Các kết quả nghiên cứu được kiểm tra phương sai và được nêu trong Bảng C.4.

Bảng C.4 - Ảnh hưởng của bảy kỹ thuật chuẩn bị mẫu đến phương sai của các kết quả thử nghiệm từ ba loại mẫu

Kỹ thuật (cỡ mẫu thử)

T1

...

...

...

T2

(10 g)

T3

(10 g)

T4

(20 g)

T5

(35 g)

T6

...

...

...

T7

(20 g)

Cỡ mẫu

Toàn bộ

Toàn bộ

Toàn bộ

Toàn bộ hoặc ≈ 100 g

Toàn bộ

Toàn bộ

...

...

...

Đồng hóa

(có/không)

Không

Không

Có

Có (1 với 1 dịch pha loãng)

Không

Không

Có (1 với 1 dịch pha loãng)

...

...

...

129

124

130

135

6

10

16

Loại mẫu

Pate, phomat

...

...

...

Pate, phomat

Pate, phomat

Pate

Pate, salad hỗn hợp

Pate, salad hỗn hợp

Kết quả

(550 mẫu lặp lại)

sd

phương sai

...

...

...

0,59

0,36

0,17

0,33

0,30

0,15

0,66

0,35

0,13

...

...

...

0,11

0,09

0,02

Dữ liệu này cũng cho thấy rằng, ba loại mẫu có tính đồng nhất khác nhau có giá trị phương sai nhỏ nhất khi lượng mẫu đồng nhất là lớn nhất (100 g) cả khi có pha loãng hoặc không pha loãng 1:1.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Quy trình kiểm tra xác nhận đối với các mẫu gộp cho các phép thử định tính

D.1  Phép thử nghiệm gộp

...

...

...

Hai quy trình đối với các phần mẫu thử gộp ở các giai đoạn khác nhau của phép thử định tính được nêu chi tiết trong phần nội dung chính (xem 9.3). Phụ lục này mô tả quy trình thích hợp để kiểm tra xác nhận rằng quy trình gộp không ảnh hưởng đến số kết quả âm tính giả thu được sau khi kiểm tra các nền mẫu khác nhau bằng các phương pháp định tính.

Chỉ các phần thử nghiệm từ cùng loại sản phẩm hoặc mẫu môi trường mới được gộp chung và quy trình gộp được chọn phải được đánh giá xác nhận trước khi sử dụng tiếp trên các mẫu thông thường. Chỉ các mẫu từ cùng một nguồn gốc/nguồn (ví dụ: cùng một mẻ, lô hàng) mới được gộp chung và sau đó chỉ theo yêu cầu của khách hàng. Các mẫu từ nguồn gốc/các nguồn khác nhau, như từ các khách hàng khác nhau, thì không được gộp chung.

D.1.2  Dịch cấy

Sử dụng huyền phù chuẩn của một chủng ức chế thích hợp [xem TCVN 6507-2 (ISO 16140-2)] của vi sinh vật thử nghiệm phù hợp với phương pháp đang được nghiên cứu. Cấy các phần mẫu thử của nền mẫu ở mức xấp xỉ 5 cfu trên 25 g (hoặc ml), trong đó không quá 2 trong 300 phép thử lặp lại không được chứa sinh vật nào có thể phát hiện được trên 25 g.

CHÚ THÍCH: Kích cỡ của phần mẫu thử thường là 25 g (hoặc 25 ml) cho các thử nghiệm định tính, nhưng có thể sử dụng các lượng thay thế khác với điều kiện có tính đến điều này.

Các điều kiện ức chế được áp dụng phải là loại ức chế mà vi sinh vật đích gặp phải khi có mặt trong mẫu bị nhiễm tự nhiên của sản phẩm hoặc mẫu môi trường.

Các mẫu chuẩn khác hoặc đã được chứng nhận với một dải đã biết của vi sinh vật thích hợp có thể được sử dụng để chuẩn bị dịch cấy.

D.1.3  Chuẩn bị mẫu

Thêm hoặc trộn một lượng thích hợp của huyền phù vi sinh vật với một lượng sản phẩm hoặc mẫu môi trường đã biết không bị nhiễm để cung cấp đủ nguyên liệu cho dãy thử nghiệm cần thực hiện. Nếu các mẫu được nuôi cấy theo số lượng lớn, đảm bảo rằng lượng mẫu đó đủ để đồng nhất. Ngoài ra, nuôi cấy lặp lại các lượng nền mẫu 25 g (hoặc ml) đã cân trước để cung cấp đủ các phần mẫu thử có chứa lượng xác định các vi sinh vật.

...

...

...

D.1.4  Phần mẫu thử gộp

D.1.4.1  Thử nghiệm tham khảo sơ bộ

Cho dịch cấy (D.1.2) có chứa khoảng 5 cfu vi sinh vật thử nghiệm vào huyền phù ban đầu của phần mẫu thử 25 g (hoặc ml) trong 225 ml canh thang tăng sinh sơ bộ, ủ và hoàn thành phép thử theo phương pháp được nghiên cứu.

Kết quả "phát hiện được" khẳng định rằng chất cấy đã thu hồi được vi sinh vật thử nghiệm từ 25 g (hoặc ml) phần mẫu thử đã nuôi cấy.

D.1.4.2  Quy trình kiểm tra xác nhận

Ví dụ được mô tả là gộp các phần thử nghiệm từ 10 mẫu cùng loại để phát hiện Salmonella [theo TCVN 6507-1 (ISO 6579-1)] nhưng sử dụng quy trình này cho các số lượng mẫu khác nhau, các vi sinh vật khác và các quy trình khác.

Trộn 10 phần thử nghiệm mỗi phần 25 g (hoặc ml) từ mỗi mẫu (tổng 250 g hoặc ml) với 2 250 ml môi trường tăng sinh sơ bộ đã được làm ấm trước. Thêm dịch cấy (D.1.2) có chứa khoảng 5 cfu Salmonella và ủ toàn bộ chất cấy theo quy trình chuẩn, đảm bảo rằng nhiệt độ ủ đạt được trong một thời gian thích hợp.

Sau khi ủ, nuôi cấy chuyển và hoàn thành phép thử theo phương pháp đang được nghiên cứu.

Nếu phát hiện được Salmonella, gộp các phần thử nghiệm 10 x 25 g (hoặc ml) của cùng loại mẫu được kiểm tra xác nhận về chủng thử nghiệm đã chọn và áp dụng các điều kiện đã áp dụng.

...

...

...

D.1.5  Gộp phần tăng sinh sơ bộ

D.1.5.1  Thử nghiệm đối chứng sơ bộ

Thực hiện phép thử đối chứng theo D.1.4.1.

D.1.5.2  Quy trình kiểm tra xác nhận

Ví dụ được mô tả là gộp các phần mẫu thử tăng sinh sơ bộ từ 10 mẫu cùng loại để phát hiện Salmonella [theo TCVN 6507-1 (ISO 6579-1)] nhưng sử dụng quy trình này cho các số lượng mẫu khác nhau, các vi sinh vật khác và các quy trình khác.

Cho dịch cấy (D.1.2) có chứa khoảng 5 cfu Salmonella vào một trong mười huyền phù ban đầu của 25 g (hoặc ml) mẫu thử trong 225 ml môi trường tăng sinh sơ bộ và ủ tất cả mười huyền phù theo quy trình chuẩn.

Cấy một thể tích xác định của chủng cấy đã tăng sinh sơ bộ và các thể tích tương đương của các nuôi cấy tăng sinh sơ bộ không cấy salmonella vào một lượng thích hợp môi trường chọn lọc, đảm bảo duy trì được tỷ lệ quy định đối với bước nuôi cấy chuyển này. Ủ môi trường chọn lọc và hoàn thành phép thử theo phương pháp đang được nghiên cứu.

D.1.5.3  Giải thích kết quả

Nếu phát hiện được Salmonella, gộp 10 chủng cấy đã tăng sinh sơ bộ từ các phần mẫu thử 25 g (hoặc ml) của cùng loại mẫu được kiểm tra xác nhận đối với chủng thử nghiệm đã chọn và điều kiện ức chế được áp dụng.

...

...

...

D.2  Khẳng định kết quả

Bằng chứng cho thấy rằng một hoặc một số các quy trình gộp được mô tả đưa ra một biện pháp thỏa đáng về phép thử nhiều mẫu yêu cầu phải khẳng định.

Nên hạn chế phụ thuộc vào các kết quả của phép thử nghiệm riêng lẻ và quy trình được chọn phải được lặp lại ít nhất năm lần và tốt nhất là tám đến mười lần, sử dụng các mẫu khác nhau của cùng một kiểu nền mẫu/tổ hợp vi sinh vật đích để đảm bảo, với độ chụm hợp lý mà phép thử có khả năng phát hiện vi sinh vật đích ở nồng độ hiệu quả thấp hơn.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 10989 1)Sản phẩm nông sản thực phẩm - Thiết kế tiêu chuẩn lấy mẫu từ lô hàng

[2] TCVN 11923 (ISO/TS 17728) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lấy mẫu để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

[3] TCVN 8129 (ISO 18593) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu bề mặt sử dụng đĩa tiếp xúc và lau bề mặt

[4] TCVN 12365-2 (ISO 16140-2) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp - Phần 2: Quy trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thay thế so với phương pháp chuẩn

...

...

...

[6] CORRY J.E.L.C., JARVIS B., HEDGES A.J. Minimising the between-sample variance in colony counts on foods. Food Microbiol. 2010, 27 pp. 598-603