Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10780-1:2017 về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phần 1

• Số hiệu: TCVN10780-1:2017
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2017

- màu vàng - màu đỏ hoặc không đổi màu - màu đen - bọt khí hoặc nứt thạch

glucose dương tính (lên men glucose); glucose âm tính (không lên men glucose); sinh hydro sulfid; sinh khí từ glucose

b) Bề mặt nghiêng của thạch

- màu vàng

lactose và/hoặc sucrose dương tính (lên men lactose và/hoặc sucrose)

- màu đỏ hoặc không đổi màu

lactose và sucrose âm tính (không lên men lactose hoặc sucrose)

Phần lớn các chủng cấy Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng của thạch và tính axit (màu vàng) có sinh khí (bọt khí), (với khoảng 90% trường hợp) sinh hydro sunfua (thạch bị đen) khi cấy đâm sâu (xem Bảng 1).

Khi Salmonella phân lập được dương tính lactose, trên bề mặt nghiêng của thạch TSI có màu vàng. Do vậy, việc khẳng định sơ bộ các chủng Salmonella không chỉ dựa trên các kết quả của phép thử trên thạch TSI (xem 9.5.3.1).

CHÚ THÍCH: Môi trường Kligler-Hajna cho các kết quả tương tự như thạch TSI.

9.5.3.3  Thạch urê (B.9)

...

...

...

Nếu phản ứng dương tính thì urê được phân giải thành amoniac, làm phenol đỏ chuyển thành màu hồng và sau đó chuyển thành màu đỏ anh đào sẫm. Phản ứng thường xuất hiện sau 2 h đến 4 h.

Các chủng cấy Salmonella điển hình không phân giải urê, do đó thạch urê sẽ không đổi màu (xem Bảng 1).

9.5.3.4  Môi trường L-Lyzin Decarboxylation (LDC, B.10)

Cấy ngay phía dưới bề mặt của môi trường lỏng. Ủ ở 37 °C (6.3) trong 24 h ± 3 h.

Môi trường đục và có màu đỏ tía sau khi ủ cho thấy phản ứng dương tính. Màu vàng cho thấy phản ứng âm tính.

Phần lớn các chủng cấy Salmonella điển hình có phản ứng LDC dương tính (xem Bảng 1).

9.5.3.5  Phát hiện β-galactosidase (B.11) (tùy chọn)

Phép thử β-galactosidase có thể được sử dụng để phân biệt các Salmonella enterica phân loài arizonae và diarizonae và các loài khác trong họ Enterobacteriaceae (tất cả đều cho phản ứng dương tính) với các phân loài khác của Salmonella enterica (nhìn chung các phân loài này đều cho phản ứng âm tính, xem Bảng 1).

Bảng 1 - Diễn giải các phép thử sinh hóa

...

...

...

(Từ 9.5.3.2 đến 9.5.3.6)

Chủng Salmonella

S. Typhi

S.

Paratyphi

A

S.

Paratyphi

B

...

...

...

Paratyphi

C

S.

Gallinarum biovar gallinarum^b

S.

Gallinarum biovar pullorum^b

Các chủng khác^g

Phản ứng

%+^c

...

...

...

%+^c

Phản ứng

%+^d

Phản ứng

%+^d

Phản ứng

%+^c

Phản ứng

%+^c

...

...

...

%+^c

TSI sinh axit từ glucose

+

100

+

100

+

100

+

...

...

...

+

100

+

100

+

100

TSI sinh khí từ glucose

-^e

0

...

...

...

96,1

+

96,1

+

96,1

-

0

+

95,1

...

...

...

92

TSI sinh axit từ lactose

-

2

-

0

-

0

-

...

...

...

-

0

-

0

-

1^h

TSI sinh axit từ sucrose

-

0

...

...

...

0,6

-

0,6

-

0,6

-

0,6

-

0,6

...

...

...

1

TSI tạo hydro sulfid

+

97

-

10

+

100

+

...

...

...

V^f

V^f

+

92

Thủy phân ure

-

0

...

...

...

0

-

0

-

0

-

0

-

0

...

...

...

1

Lyzin đã khử nhóm cacboxyl

+

98

-

0

+

95

+

...

...

...

+

95

+

95

+

95

Phản ứng β-galactosidase

-

0

...

...

...

0

-

-

-

<10

-

<10

...

...

...

2^h

Sinh indol

-

0

-

1,2

-

1,2

-

...

...

...

-

1,2

-

1,2

-

1

^a Từ tài liệu tham khảo [13] và [14].

^b Từ tài liệu tham khảo [11], [13] và [14],

^c Tỷ lệ phần trăm chứng tỏ không phải tất cả các serovar Salmonellla phân lập được đều cho phản ứng + hoặc -. Các phản ứng cũng có thể khác nhau giữa và trong các serovar.

...

...

...

^e Salmonella Typhi là vi khuẩn kỵ khí.

^f V là các kết quả biến thiên.

^g Để phân biệt các loài Salmonella và các phân loài khác, xem TCVN 10780 (ISO/TR 6579-3)^[24].

^h Các Salmonella enterica phân loài arizonae và diarizonae luôn cho phản ứng β-galactosidase dương tính. Một số chủng Salmonella enterica phân loài arizonae và diarizonae có thể lên men lactose.

Hiện có một số quy trình thực hiện phép thử β-galactosidase. Ví dụ như sau:

Hòa một vòng que cấy đầy khuẩn lạc nghi ngờ vào một ống có chứa 0,25 ml dung dịch nước muối (B.13).

Thêm một giọt toluen và lắc ống. Đặt ống vào trong nồi cách thủy (6.6) cài đặt ở 37 °C và để vài phút (khoảng 5 min). Thêm 0,25 ml thuốc thử để phát hiện β-galactosidase (B.11) và trộn đều.

Đặt lại ống vào nồi cách thủy (6.6) cài đặt ở 37 °C và để tới 24 h.

Màu vàng cho thấy phản ứng dương tính. Phản ứng thường xuất hiện sau 20 min.

...

...

...

9.5.3.6  Môi trường thử phản ứng indol (B.12) (tùy chọn)

Phép thử indol có thể được sử dụng khi cần phân biệt Salmonella (thường phản ứng âm tính indol, xem Bảng 1) với Escherichia coli và Citrobacter (cả hai phản ứng dương tính indol) vì các vi sinh vật này có thể cho các phản ứng điển hình trên môi trường phân lập Salmonella.

Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5 ml môi trường trypton/tryptophan (B.12.1).

Ủ ở 37 °C (6.3) trong 24 h ± 3 h. Sau khi ủ, thêm 1 ml thuốc thử Kovacs (B.12.2).

Sự xuất hiện một vòng màu đỏ (lớp bề mặt) chứng tỏ phản ứng dương tính và một vòng màu nâu vàng (lớp bề mặt) chứng tỏ phản ứng âm tính.

9.5.4  Phép thử huyết thanh

9.5.4.1  Yêu cầu chung

Các khuẩn lạc thuần (9.5.2) cho thấy các phản ứng sinh hóa điển hình đối với Salmonella (9.5.3) được thử nghiệm tiếp để phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên Salmonella O và H (và cũng như với kháng nguyên Vi, tại những nơi dự kiến có mặt Salmonella Typhi trong nguồn cung cấp thực phẩm) bằng cách ngưng kết với kháng nguyên đa giá (B.14) trên lam kính. Các khuẩn lạc thuần được nuôi cấy trên môi trường thạch không chọn lọc (B.7) và được kiểm tra khả năng tự ngưng kết. Loại bỏ các chủng tự ngưng kết mà không được thử nghiệm tiếp để phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên Salmonella. Sử dụng kháng nguyên theo hướng dẫn của nhà sản xuất nếu khác với phương pháp được mô tả dưới đây để phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên Salmonella O và H (và với cả kháng nguyên Vi nếu cần,).

Các phép thử sau đây (9.5.4.2 đến 9.5.4.5) là yêu cầu tối thiểu để thử nghiệm huyết thanh của Salmonella spp.

...

...

...

9.5.4.2  Loại bỏ các chủng tự ngưng kết

Cho một giọt dung dịch nước muối (B.13) lên lam kính thủy tinh sạch. Dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch nước muối với khuẩn lạc cần thử nghiệm, để thu được huyền phù đục và đồng nhất.

Lắc nhẹ lam kính từ 5 s đến 60 s (tùy theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Quan sát huyền phù trên nền màu đen. Nếu các vi khuẩn kết dính thành hạt trong huyền phù thì chủng này được xem là tự ngưng kết và việc khẳng định huyết thanh sẽ phức tạp. Thông tin bổ sung về việc xử lý các chủng tự ngưng kết có thể xem TCVN 10780-3 (ISO/TR 6579-3)^[24].

9.5.4.3  Kiểm tra các kháng nguyên O

Kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên O với khuẩn lạc thuần đã xác định không có khả năng tự ngưng kết, tiến hành theo 9.5.4.2, sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên K đa giá (B.14) thay cho dung dịch nước muối.

Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng được coi là dương tính.

9.5.4.4  Kiểm tra các kháng nguyên Vi (tùy chọn)

Kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên Vi với khuẩn lạc thuần đã xác định không có khả năng tự ngưng kết, tiến hành theo 9.5.4.2, sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên Vi (B.14) thay cho dung dịch nước muối.

Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng được coi là dương tính.

...

...

...

Kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên H với khuẩn lạc thuần đã xác định không có khả năng tự ngưng kết, tiến hành theo 9.5.4.2, sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên H đa giá (B.14) thay cho dung dịch nước muối.

Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng được coi là dương tính.

9.5.5  Diễn giải các phản ứng sinh hóa và huyết thanh

Bảng 2 diễn giải các kết quả của các phép thử khẳng định (9.5.3 và 9.5.4) với các khuẩn lạc đã thử nghiệm (9.5.2).

Bảng 2 - Diễn giải các kết quả các phép thử khẳng định

Phản ứng sinh hóa

Tự ngưng kết

Phản ứng huyết thanh

Diễn giải

...

...

...

Không

Kháng nguyên O và H dương tính (và Vi dương tính nếu thử nghiệm)

Các chủng được coi là Salmonella

Điển hình

Không

Kháng nguyên O và/hoặc H âm tính

Có thể là Salmonella

Điển hình

Có

...

...

...

Phản ứng không điển hình

-

-

Không được coi là Salmonella

9.5.6  Xác định typ huyết thanh

Các chủng đã được khẳng định là Salmonella spp. (xem Bảng 2) có thể thử nghiệm tiếp để xác định serovar. Hướng dẫn xác định typ huyết thanh được quy định trong TCVN 10780-3 (ISO/TR 6579-3)^[24].

Nếu cần, các chủng đã khẳng định có thể được gửi đến trung tâm kiểm chứng về Salmonella đã được công nhận để xác định typ (typ huyết thanh, typ phân tử). Nếu các chủng được gửi đến trung têm kiểm chứng thì phải kèm theo tất cả thông tin liên quan đến các chủng đó như kết quả khẳng định, nguồn phân lập chủng và có liên quan đến việc phân lập từ đợt bùng phát dịch.

10  Biểu thị kết quả

Căn cứ vào phần diễn giải kết quả, chỉ rõ có mặt hoặc không có mặt Salmonella trong phần mẫu thử x g hoặc x ml sản phẩm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] hoặc trên diện tích bề mặt hoặc trong mẫu vật phẩm (ví dụ: túi bọc ủng).

...

...

...

11.1  Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Các đặc tính hiệu năng của phương pháp đã được xác định trong các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để xác định độ đặc hiệu, độ nhạy và LOD₅₀ của phương pháp (xem Tài liệu tham khảo [6] và [7]). Dữ liệu được tóm tắt trong Phụ lục C. Các giá trị thu được từ các nghiên cứu liên phòng này có thể không áp dụng được cho các loại nền mẫu khác với nền mẫu nêu trong Phụ lục C. Ngoài ra, các đặc tính hiệu năng nêu trong Phụ lục C đã xác định trong mỗi phần 25 g (hoặc 25 ml) mẫu thử. Khi sử dụng các phần mẫu thử lớn hơn thì các đặc tính hiệu năng có thể sẽ khác.

11.2  Độ nhạy

Độ nhạy được xác định bằng số mẫu dương tính chia cho số mẫu được thử nghiệm ở mức nhiễm đã cho. Các kết quả phụ thuộc vào mức nhiễm của mẫu.

11.3  Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu được xác định bằng số mẫu âm tính chia cho số mẫu trắng được thử nghiệm.

11.4  LOD₅₀

LOD₅₀ (mức phát hiện) là nồng độ (cfu/phần mẫu thử) mà ở mức này có khả năng phát hiện đến 50%.

12  Báo cáo thử nghiệm

...

...

...

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- cỡ phần mẫu thử và/hoặc bản chất của mẫu được kiểm tra;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi sai lệch trong môi trường tăng sinh hoặc các điều kiện ủ đã sử dụng;

- mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết của sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- các kết quả thu được.

Phụ lục A

(quy định)

...

...

...

Hình A.1 - Sơ đồ quy trình phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và mẫu môi trường từ khu vực chế biến thực phẩm

Hình A.2 - Sơ đồ quy trình phát hiện Salmonella trong mẫu phân động vật và mẫu môi trường từ giai đoạn sản xuất ban đầu

Phụ lục B

(quy định)

Môi trường nuôi cấy và thuốc thử

B.1  Yêu cầu chung

...

...

...

Thời hạn sử dụng của các môi trường nêu trong phụ lục này đã được nêu trong một số nghiên cứu. Người sử dụng phải kiểm tra lại điều này theo các điều kiện bảo quản của riêng mình (như được quy định trong TCVN 8128 (ISO 11133)].

Thử nghiệm hiệu năng để đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy được quy định trong B.15.

B.2  Dung dịch nước đệm pepton (BPW)

B.2.1  Thành phần

Pepton^a

10,0g

Natri clorua

5,0 g

Dinatri hydro phosphat ngậm 12 phân tử nước (Na₂HPO₄.12H₂O)^b

...

...

...

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

1,5 g

Nước

1 000 ml

^a Ví dụ: Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym.

^b Nếu sử dụng dinatri hydro phosphat với hàm lượng nước khác nhau thì điều chỉnh khối lượng của thành phần tương ứng. Ví dụ, trong trường hợp dinatri hydro phosphat (Na₂HPO₄) khan thì sử dụng 3,57 g.

B.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C.

...

...

...

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

Bảo quản môi trường trong vật chứa kín (6.12) ở 5 °C (6.8) đến 6 tháng.

B.3  Môi trường Rappaport-Vassiliadis với đậu tương (canh thang RVS)

B.3.1  Dung dịch A

B.3.1.1  Thành phần

Sản phẩm thủy phân đậu tương bằng enzym

Natri clorua

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄)

...

...

...

5,0 g

8,0 g

1,4 g

0,2 g

1 000 ml

B.3.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng đến khoảng 70 °C, nếu cần.

Dung dịch này phải được chuẩn bị cùng ngày chuẩn bị môi trường RVS hoàn chỉnh.

B.3.2  Dung dịch B

...

...

...

Magie clorua ngậm 6 phân tử nước (MgCI₂.6H₂O)

Nước

400 g

1 000 ml

B.3.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan magie clorua trong nước.

Do muối này hút ẩm mạnh, nên cần hòa tan hết lượng MgCI₂.6H₂O trong hộp vừa mới mở, theo công thức. Ví dụ: 250 g MgCI₂.6H₂O thì thêm 625 ml nước, để có dung dịch với tổng thể tích 788 ml và nồng độ khối lượng khoảng 31,7 g trên 100 ml MgCI₂.6H₂O.

Bảo quản dung dịch này trong lọ thủy tinh tối màu có nắp đậy kín ở nhiệt độ phòng ít nhất hai năm.

B.3.3  Dung dịch C

...

...

...

Xanh malachit oxalat

Nước

0,4 g

100 ml

B.3.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan xanh malachit oxalat trong nước.

Bảo quản dung dịch này trong lọ thủy tinh tối màu ở nhiệt độ phòng ít nhất 8 tháng.

B.3.4  Môi trường hoàn chỉnh

B.3.4.1  Thành phần

...

...

...

1 000 ml

Dung dịch B (B.3.2)

100 ml

Dung dịch C (B.3.3)

10 ml

B.3.4.2  Chuẩn bị

Cho 100 ml dung dịch B và 10 ml dung dịch C vào 1 000 ml dung dịch A.

Chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng, pH là 5,2 ± 0,2 ở 20 °C đến 25 °C.

Phân phối môi trường này vào các ống hoặc bình (6.12) có dung tích thích hợp để chứa được các lượng mẫu thử cần thiết cho thử nghiệm, ví dụ: mỗi ống 10 ml.

...

...

...

Bảo quản môi trường đã chuẩn bị trong ống hoặc bình đậy kín ở 5 °C (6.8) đến 3 tháng.

CHÚ THÍCH: Thành phần của môi trường cuối cùng là: sản phẩm thủy phân đậu tương bằng enzym: 4,5 g/l; natri clorua: 7,2 g/l; kali dihydro phosphat (KH₂PO₄ + K₂HPO₄): 1,44 g/l; magie clorua (MgCl₂) khan: 13,4 g/l hoặc magie clorua ngậm 6 phân tử nước (MgCl₂.6H₂O): 28,6 g/l; xanh malachit oxalat: 0,036 g/l.

B.4  Thạch Rappaport-Vassiliadis bán đặc cải biến (MSRV)

CHÚ THÍCH: Xem Tài liệu tham khảo [12].

B.4.1  Dung dịch A

B.4.1.1  Thành phần

Sản phẩm thủy phân mô động vật và thực vật bằng enzym

Sản phẩm thủy phân casein bằng axit

Natri clorua

...

...

...

Nước

4,6 g

4,6 g

7,3 g

1,5 g

890 ml

B.4.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng đến khoảng 70 °C, nếu cần.

Dung dịch phải được chuẩn bị cùng ngày chuẩn bị thạch MSRV hoàn chỉnh.

...

...

...

B.4.2.1  Thành phần

Magie clorua ngậm sáu phân tử nước (MgCI₂.6H₂O)

Nước

400 g

1 000 ml

B.4.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan magie clorua trong nước.

Do muối này hút ẩm mạnh, nên cần hòa tan hết lượng MgCI₂.6H₂O trong hộp vừa mới mở, theo công thức. Ví dụ: 250 g MgCI₂.6H₂O thì thêm 625 ml nước, để có dung dịch với tổng thể tích 788 ml và nồng độ khối lượng khoảng 31,7 g trên 100 ml MgCI₂.6H₂O.

Bảo quản dung dịch này trong lọ thủy tinh tối màu có nắp đậy kín ở nhiệt độ phòng ít nhất 2 năm.

...

...

...

B.4.3.1 Thành phần

Xanh malachit oxalat

Nước

0,4 g

100 ml

B.4.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan xanh malachit oxalat trong nước.

Dung dịch này có thể được giữ trong lọ thủy tinh màu nâu ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 8 tháng.

B.4.4  Môi trường cơ bản

...

...

...

Dung dịch A (B.4.1)

890 ml

Dung dịch B (B.4.2)

100 ml

Dung dịch C (B.4.3)

10 ml

Thạch^a

2,7 g

^a Có thể cần phải xác định thực nghiệm nồng độ thạch cần thiết tối ưu cho sự di động của Salmonella (ví dụ: khi sử dụng mẻ thạch chưa biết sức đông).

...

...

...

Cho 100 ml dung dịch B và 10 ml dung dịch C vào 890 ml dung dịch A, khuấy trộn.

Thêm thạch và tạo huyền phù.

Chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng, pH là 5,2 (từ 5,1 đến 5,4) ở nhiệt độ 20 °C đến 25 °C.

Đun nóng và khuấy trộn. Không hấp áp lực.

Không giữ môi trường ở nhiệt độ cao lâu hơn thời gian cần thiết.

Làm nguội môi trường đến nhiệt độ trong khoảng từ 47 °C đến 50 °C trong nồi cách thủy (6.5).

B.4.5  Dung dịch Novobioxin

B.4.5.1  Thành phần

Muối natri novobioxin

...

...

...

0,05 g

10 ml

B.4.5.2  Chuẩn bị

Hòa tan muối natri novobioxin trong nước.

Khử trùng bằng cách lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,22 μm.

Dung dịch này có thể bền đến 4 tuần khi được bảo quản ở 5 °C (6.8) hoặc đến 1 năm nếu bảo quản với các lượng nhỏ (ví dụ: 2 ml) ở -20 °C (6.9).

B.4.6  Môi trường hoàn chỉnh

B.4.6.1  Thành phần

Môi trường cơ bản (B.4.4)

...

...

...

Dung dịch novobioxin (B.4.5)

2 ml

B.4.6.2  Chuẩn bị

Bằng kỹ thuật vô trùng, cho 2 ml dung dịch novobioxin (B.4.5) vào 1 000 ml môi trường cơ bản (B.4.4) ở 47 °C đến 50 °C. Trộn kỹ. Nồng độ cuối cùng của novobioxin trong môi trường hoàn chỉnh là 10 mg/l.

pH cuối cùng phải là 5,2 (từ 5,1 đến 5,4) ở nhiệt độ 20 °C đến 25 °C.

Rót môi trường vào các đĩa Petri vô trùng có đường kính 90 mm (6.14), mỗi đĩa từ 15 ml đến 20 ml.

Để môi trường đông đặc trước khi di chuyển và thao tác cẩn thận.

Bảo quản các đĩa với nắp hướng lên trên và bảo quản ở nơi tối không bị khô đến 2 tuần ở 5 °C (6.8).

Không lật úp các đĩa vì thạch bán đặc quá mềm.

...

...

...

Ngay trước khi sử dụng và nếu thấy bề mặt thạch ướt thì cẩn thận làm khô bề mặt thạch, ví dụ bằng cách hé nắp đĩa hướng mặt thạch lên trên để trong tủ thông khí. Cẩn thận không để môi trường khô quá mức.

CHÚ THÍCH 1: Thành phần của thạch MSRV, như nêu trong Tài liệu tham khảo [12], có chứa novobioxin 20 mg/l. Tuy nhiên, theo quan điểm khoa học, hàm lượng novobioxin tốt nhất là 10 mg/l. Các nghiên cứu cho thấy các vùng lan rộng hơn trên thạch MSRV ở nồng độ novobioxin thấp hơn^[23] vì tác động ức chế của novobioxin tới tính di động của vi khuẩn^[22] ít hơn.

CHÚ THÍCH 2: Thành phần môi trường cuối cùng: sản phẩm thủy phân mô động vật và mô thực vật bằng enzym 4,6 g/l, sản phẩm thủy phân casein bằng axit 4,6 g/l, natri clorua (NaCI) 7,3 g/l, kali dihydro phosphat (KH₂PO₄) 1,5 g/l, clorua magie khan (MgCl₂) 10,9 g/l hoặc magie clorua ngậm 6 phân tử nước (MgCl₂.6H₂O) 28,6 g/l, xanh malachit oxalat 0,04 g/l, muối natri novobioxin 0,01 g/l và thạch 2,7 g/l.

B.5  Canh thang Novobioxin tetrathionat muller-kauffmann (canh thang MKTTn)

CHÚ THÍCH: Xem Tài liệu tham khảo [14].

B.5.1  Môi trường cơ bản

B.5.1.1  Thành phần

Chất chiết thịt

4,3 g

...

...

...

8,6 g

Natri clorua (NaCI)

2,6 g

Canxi cacbonat (CaCO₃)

38,7 g

Natri thiosulfat ngậm 5 phân tử nước (Na₂S₂O₃.5H₂O)

47,8 g

Mật bò dùng cho vi khuẩn học

4,78 g

...

...

...

9,6 mg

Nước

1 000 ml

B.5.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách gia nhiệt có khuấy trộn liên tục cho đến khi môi trường bắt đầu sôi. Tránh quá nhiệt.

Chỉnh pH đến 8,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Trộn kỹ môi trường.

Bảo quản môi trường cơ bản trong bình đậy kín (6.12) ở nhiệt độ 5 °C (6.8) đến 3 tháng.

B.5.2  Dung dịch iot-iodua

...

...

...

Iot

20,0 g

Kali iodua (KI)

25,0 g

Nước

100 ml

B.5.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan hoàn toàn kali iodua trong 10 ml nước, sau đó bổ sung iot và pha loãng bằng nước vô trùng đến 100 ml. Không đun nóng.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong bình đậy kín (6.12), ở nơi tối đến 1 năm.

...

...

...

B.5.3.1  Thành phần

Muối natri novobioxin

Nước

0,04 g

5 ml

B.5.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan muối natri novobioxin trong nước.

Khử trùng bằng cách lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,22 μm.

Dung dịch này có thể bền đến 4 tuần khi được bảo quản ở 5 °C (6.8) hoặc đến 1 năm nếu bảo quản với các lượng nhỏ (ví dụ: 2 ml) ở -20 °C (6.9).

...

...

...

B.5.4.1  Thành phần

Môi trường cơ bản (B.5.1)

Dung dịch iot-iodua (B.5.2)

Dung dịch novobioxin (B.5.3)

1 000 ml

20 ml

5 ml

B.5.4.2  Chuẩn bị

Bằng kỹ thuật vô trùng, cho 5 ml dung dịch novobioxin (B.5.3) vào 1 000 ml môi trường cơ bản (B.5.1). Trộn, sau đó bổ sung 20 ml dung dịch iot-iodua (B.5.2). Trộn kỹ. Nồng độ cuối cùng của novobioxin trong môi trường hoàn chỉnh là 40 mg/l.

...

...

...

B.6  Thạch Deoxycolat Lyzin Xylose (thạch XLD)

CHÚ THÍCH: Xem Tài liệu tham khảo [14].

B.6.1  Thành phần

Chất chiết nấm men

3,0 g

Natri clorua (NaCl)

5,0 g

Xylose

3,75 g

...

...

...

7,5 g

Sucrose

7,5 g

L-Lyzin hydroclorua

5,0 g

Natri thiosulfat

6,8 g

Sắt (III) amoni xitrat

0,8 g

...

...

...

0,08 g

Natri deoxycholat

1,0 g

Thạch

từ 9 g đến 18 g^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.6.2  Chuẩn bị

...

...

...

Chỉnh pH, nếu cần, sao cho pH cuối cùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C.

Rót môi trường cơ bản vào các ống hoặc các bình (6.12) có dung tích thích hợp.

B.6.3  Chuẩn bị các đĩa thạch

Làm nguội môi trường trong nồi cách thủy (6.5) trong khoảng từ 47 °C đến 50 °C và rót vào các đĩa Petri (6.14) vô trùng. Để cho đông đặc.

Ngay trước khi sử dụng, cẩn thận làm khô các đĩa thạch (tốt nhất hé nắp ra và úp ngược đĩa thạch xuống) cho vào tủ (6.2) ở nhiệt độ từ 25 °C đến 50 °C cho đến khi bề mặt thạch khô.

Bảo quản các đĩa thạch không bị khô ở 5 °C (6.8) đến bốn tuần.

B.7  Thạch dinh dưỡng (ví dụ môi trường không chọn lọc)

B.7.1  Thành phần

Chất chiết thịt

...

...

...

Pepton

5.0 g

Natri clorua (NaCl) (tùy chọn)

5,0 g

Thạch

từ 9 g đến 18 g^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

...

...

...

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng có khuấy trộn liên tục.

Sau khi khử trùng, chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy vào trong các ống hoặc bình (6.12) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

B.7.3  Chuẩn bị các đĩa thạch dinh dưỡng

Làm nguội môi trường trong nồi cách thủy (6.5) trong khoảng từ 47 °C đến 50 °C, xoay đều và rót vào các đĩa Petri vô trùng (6.14). Để cho đông đặc.

Ngay trước khi sử dụng, cẩn thận làm khô các đĩa thạch (tốt nhất hé nắp ra và úp ngược đĩa thạch xuống) cho vào tủ (6.2) ở nhiệt độ từ 25 °C đến 50 °C cho đến khi bề mặt thạch khô.

Bảo quản các đĩa thạch không bị khô ở 5 °C (6.8) đến bốn tuần.

B.8  Thạch TSI

...

...

...

Chất chiết thịt

3,0 g

Chất chiết nấm men

3,0 g

Pepton

20,0 g

Natri clorua (NaCl)

5,0 g

Lactose

...

...

...

Sucrose

10,0 g

Glucose

1,0 g

Sắt (III) xitrat

0,3 g

Natri thiosulphat

0,3 g

Đỏ phenol

...

...

...

Thạch

từ 9 g đến 18 g^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.8.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng có khuấy trộn liên tục.

Chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C.

Phân phối các lượng 10 ml môi trường vào các ống nghiệm hoặc chai (6.12).

...

...

...

Đặt nghiêng để phần chân thạch dài từ 2,5 cm đến khoảng 5 cm.

Bảo quản các đĩa không bị khô ở 5 °C trong tủ lạnh (6.8) đến bốn tuần.

CHÚ THÍCH: Cách khác, có thể sử dụng thạch sát/đường hai lần (Kligler-Hajna)

B.9  Thạch urê (Christensen)

B.9.1  Môi trường cơ bản

B.9.1.1  Thành phần cơ bản

Pepton^a)

1,0 g

Glucose

...

...

...

Natri clorua (NaCl)

5,0 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

2,0 g

Đỏ phenol

0,012 g

Thạch

9 g đến 18 g^b

Nước

...

...

...

^a Ví dụ: Sản phẩm thủy phân gelatin bằng enzym.

^b Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.9.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng có khuấy liên tục.

Chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng, pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C.

Rót môi trường vào các ống nghiệm hoặc chai (6.12) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

Bảo quản môi trường cơ bản trong ống hoặc bình đậy kín ở 5 °C (6.8) đến ba tháng.

B.9.2  Dung dịch urê

...

...

...

Urê

Nước, để có thể tích cuối

400 g

1 000 ml

B.9.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan urê trong nước. Khử trùng bằng cách lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,22 μm.

Xem TCVN 8128 (ISO 11133).

B.9.3  Môi trường hoàn chỉnh

B.9.3.1  Thành phần

...

...

...

950 ml

Dung dịch urê (B.9.2)

50 ml

B.9.3.2  Chuẩn bị

Ở điều kiện vô trùng, cho dung dịch urê vào môi trường cơ bản, đã làm tan chảy trước và sau đó để nguội đến nhiệt độ từ 47 °C đến 50 °C.

Phân phối các lượng 10 ml môi trường hoàn chỉnh vào trong các ống vô trùng (6.12).

Đặt nghiêng ống nghiệm.

Bảo quản các ống môi trường đã rót không bị khô ở 5 °C (6.8) đến bốn tuần.

B.10  Môi trường L-Lyzin đã khử nhóm cacboxyl (LDC)

...

...

...

L-Lyzin monohydroclorua

5,0 g

Chất chiết nấm men

3,0 g

Glucose

1,0 g

Bromocresol đỏ tía

0,015 g

Nước

...

...

...

B.10.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần.

Sau khi khử trùng, chỉnh pH đến 6,8 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển các lượng từ 2 ml đến 5 ml môi trường vào các ống cấy hẹp (6.12) có nắp vặn.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

Bảo quản các ống môi trường đã rót ở 5 °C (6.8) đến ba tháng.

B.11  Thuốc thử β-galactosidase (tùy chọn)

Cho toluen vào các thuốc thử được quy định dưới đây để thực hiện phép thử β-galactosidase.

B.11.1  Dung dịch đệm

...

...

...

Natri dihydro phosphat (NaH₂PO₄)

Natri hydroxit, dung dịch 10 mol/l

Nước, để có thể tích cuối

6,9 g

khoảng 3 ml

50 ml

B.11.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan natri dihydro phosphat trong khoảng 45 ml nước đựng trong bình định mức.

Sử dụng dung dịch natri hydroxit để chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25 °C.

...

...

...

Bảo quản dung dịch đệm trong bình đậy kín ở 5 °C (6.8) đến sáu tháng.

B.11.2  Dung dịch ONPG

B.11.2.1 Thành phần

o-Nitrophenyl β-D-galactopyranosit (ONPG)

Nước

0,08g

15 ml

B.11.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan ONPG trong nước ở khoảng 50 °C.

...

...

...

B.11.3  Thuốc thử hoàn chỉnh

B.11.3.1  Thành phần

Dung dịch đệm (B.11.1)

Dung dịch ONPG (B.11.2)

5 ml

15 ml

B.11.3.2  Chuẩn bị

Cho dung dịch đệm vào dung dịch ONPG.

Bảo quản thuốc thử hoàn chỉnh trong bình đậy kín (6.12) ở 5 °C (6.8) đến ba tháng. Loại bỏ ngay thuốc thử nếu bị chuyển sang màu vàng.

...

...

...

B.12.1  Môi trường trypton/tryptophan

B.12.1.1  Thành phần

Trypton

Natri clorua (NaCl)

DL-Tryptophan

Nước

10 g

5 g

1 g

...

...

...

B.12.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước đun sôi.

Chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,5 ± 0,2 ở 25 °C.

Phân phối các lượng 5 ml môi trường vào các ống nghiệm (6.12).

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

Bảo quản các ống môi trường đã rót ở 5 °C (6.8) đến ba tháng.

B.12.2  Thuốc thử Kovacs

B.12.2.1  Thành phần

4-Dimetylaminobenzaldehyd

...

...

...

2-Metyl-2-butanol

5 g

25 ml

75 ml

B.12.2.2  Chuẩn bị

Trộn đều các thành phần trên.

Bảo quản thuốc thử hoàn chỉnh trong các bình đậy kín (6.12), nơi tối ở 5 °C (6.8) đến sáu tháng.

B.13  Dung dịch nước muối

B.13.1  Thành phần

...

...

...

Nước

8,5 g

1 000 ml

B.13.2  Chuẩn bị

Hòa tan natri clorua trong nước.

Chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C.

Phân phối các lượng dung dịch vào trong các bình hoặc các ống (6.12) có dung tích thích hợp để chứa được các lượng mẫu thử cần thiết cho phép thử.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

Bảo quản dung dịch này trong các bình/ống đậy kín ở 5 °C (6.8) đến sáu tháng.

...

...

...

Một số typ huyết thanh ngưng kết có chứa kháng thể của một hay một vài kháng nguyên O có bán sẵn; nghĩa là kháng huyết thanh chứa một hoặc nhiều hơn một nhóm “O” (còn được gọi là kháng huyết thanh “O” đơn giá hoặc đa giá), kháng huyết thanh Vi và kháng huyết thanh có chứa các kháng thể đối với một hay nhiều yếu tố H (còn được gọi là kháng huyết thanh H đơn giá hoặc đa giá).

B.15  Thử hiệu năng để đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy

Định nghĩa về độ chọn lọc và năng suất được quy định trong TCVN 8128 (ISO 11133). Nhìn chung, cần tuân thủ các quy trình thử nghiệm hiệu năng trong TCVN 8128 (ISO 11133). Đối với thử nghiệm hiệu năng môi trường lỏng chọn lọc và thạch MSRV, sử dụng cùng một thể tích dịch cấy quy định trong 9.3.2. Đối với thạch MSRV thì dịch cấy cần chứa 10^3 cfu đến 10^4 cfu để xác định năng suất và từ 10^4 cfu đến 10^6 cfu để xác định độ chọn lọc (xem TCVN 8128 (ISO 11133)]. Đối với các môi trường khác, các mức dịch cấy đối với các sinh vật đích và không phải đích được quy định trong 5.4 của TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014).

Bảng B.1 - Thử nghiệm hiệu năng để đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy

Môi trường

Chức năng thử nghiệm

Ủ

Chủng kiểm chứng

Số WDCM^3

...

...

...

BPW

Năng suất

18 h ± 2 h/

từ 34 °C đến 38 °C

Salmonella Typhimurium^c^,^d

Salmonella Enteritidis^c,d

00031

00030

Độ đục (1-2)

...

...

...

Năng suất

24 h ± 3 h/

37°C ± 1 °C

Salmonella Typhimurium^c,d

Salmonella Enteritidis^c,d

+Escherichia coli^d

+ Pseudomonas aeruginosa

00031

...

...

...

00012 hoặc

00013

00025

>10 khuẩn lạc đặc trưng trên thạch XLD hoặc môi trường được chọn khác

Độ chọn lọc

Escherichia coli^d

00012 hoặc

00013

...

...

...

≤100 khuẩn lạc trên TSA

Enterococcus faecalis^d

00009 hoặc 00087

<10 khuẩn lạc trên TSA

Canh thang RVS

Năng suất

...

...

...

41,5 °C ± 1 ^oC

Salmonella Typhimurium^c,d

Salmonella Enteritidis^c,d

+Escherichia coli^d

+ Pseudomonas aeruginosa

00031

00030

00012 hoặc

...

...

...

00025

>10 khuẩn lạc đặc trưng trên thạch XLD hoặc môi trường được chọn khác

Độ chọn lọc

Escherichia coli^d

00012 hoặc

00013

Ức chế từng phần

<100 khuẩn lạc trên TSA

...

...

...

Enterococcus faecalis^d

00009 hoặc 00087

<10 khuẩn lạc trên TSA

Thạch MSRV

Năng suất

2x(24 h ± 3 h)/

41,5 °C ± 1 ^oC

...

...

...

Salmonella Enteritidis^c,d

00031

00030

Xám trắng, vùng đục lan rộng ra khỏi giọt được cấy. Sau 24 h đến 48 h vùng đục lan ra khắp đĩa (hầu hết). Có thể có thêm: các khuẩn lạc đặc trưng sau khi cấy truyền trên thạch XLD

Độ chọn lọc

Escherichia coli^d

...

...

...

Khả năng phát triển tại giọt cấy mà không có vùng đục

Enterococcus faecalis^d

00009 hoặc 00087

Không phát triển

Thạch XLD

Năng suất

...

...

...

37 °C ± 1 ^oC

Salmonella Typhimurium^c,d

Salmonella Enteritidis^c,d

00031

00030

Các khuẩn lạc phát triển tốt (2) có tâm màu đen và vùng màu đỏ trong suốt do làm môi trường đổi màu

Độ chọn lọc

...

...

...

00012 hoặc 00013

Phát triển hoặc ức chế từng phần (0-1) của các khuẩn lạc màu vàng

Enterococcus faecalis^d

00009 hoặc 00087

Ức chế hoàn toàn (0)

Thạch dinh dưỡng

Năng suất

24 h ± 3 h/

34 °C đến 38 ^oC

...

...

...

Salmonella Enteritidis^c,d

00031

00030

Phát triển tốt

^a Liên quan đến chủng đối chứng xem tại w.w.w.wfcc.info đối với thông tin về số lượng bộ sưu tập chủng cấy và các chi tiết liên hệ; WDCM: World data Cetre for Microorganisms.

^b Đánh giá mức độ phát triển như sau: 0: không phát triển; 1: phát triển kém (ức chế từng phần); 2; phát triển tốt [(xem TCVN 8128 (ISO 11133)].

^c Một số hướng dẫn quốc gia có thể yêu cầu sử dụng các serovar khác. Xem các yêu cầu cụ thể liên quan đến việc chọn các Salmonella serovar.

^d Tùy chọn chủng, sử dụng tối thiểu một chủng.

...

...

...

(tham khảo)

Nghiên cứu đánh giá xác nhận phương pháp và các đặc tính hiệu năng

C.1  Đặc tính hiệu năng của canh thang RVS và canh thang MKTTn

Các nghiên cứu cộng tác quốc tế được tổ chức năm 2000 trong khuôn khổ dự án của châu Âu SMT CT 96 2098 (xem Tài liệu tham khảo [8] và [15]). Các nghiên cứu này gồm 11 phòng thử nghiệm của 9 nước châu Âu và 10 phòng thử nghiệm của Mỹ tham gia thử nghiệm trên phomat tươi, bột trứng khô, thịt gia cầm nguyên liệu và vật liệu chuẩn. Các mẫu thực phẩm mỗi loại được thử nghiệm ở các mức nhiễm thấp và cao cùng với kiểm chứng âm tính.

Phương pháp đã sử dụng trong nghiên cứu liên phòng là ISO 6579:2002 (xem Tài liệu tham khảo [1]), bao gồm cả tăng sinh chọn lọc trong canh thang RVS và canh thang MKTTn. Quy trình phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm quy định trong ISO 6579:2002 là tương đương với quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

Các giá trị về các đặc tính hiệu năng thu được từ phép thử liên phòng này được chỉ ra đối với từng loại mẫu trong các Bảng từ C.1 đến C.4. Dữ liệu thu được từ một số phòng thử nghiệm đã loại ra khỏi tính toán chỉ vì các lý do kỹ thuật (các sai lệch so với thủ tục quy định).

Bảng C.1 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu pho mát tươi

Thông số

Mẫu phomát tươi (mẫu trắng)

...

...

...

Mẫu phomát tươi (nhiễm ở mức cao)^a

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

23

23

23

Số lượng mẫu trong một phòng thử nghiệm

5

5

5

...

...

...

21

21

21

Số lượng mẫu được giữ lại sau khi đánh giá dữ liệu

105

105

105

Cỡ phần mẫu thử, g

25

...

...

...

25

Độ đặc hiệu, %

100

-

-

Độ độ nhạy, %

-

74,3

83,8

...

...

...

-

5,7 (từ 4,0 đến 8,1)

^a Các mẫu phomat nhiễm nhân tạo Salmonella Montevideo (chủng dương tính lactose).

Các kết quả số có xác suất lớn nhất (MPN) của các mẫu nhiễm nhân tạo như sau:

Mức thấp

Mức cao

MPN/25 g

0,7 (từ 0,2 đến 2,4)

...

...

...

Bảng C.2 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu bột trứng khô

Thông số

Thử nghiệm I bột trứng khô

(mẫu trắng)

Thử nghiệm I bột trứng khô

(nhiễm ở mức thấp)^a

Thử nghiệm I bột trứng khô

(nhiễm ở mức cao)^a

Thử nghiệm II bột trứng khô

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

26

26

26

9

Số lượng mẫu trong một phòng thử nghiệm

5

5

5

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi đánh giá dữ liệu

21

21

21

8

Số lượng mẫu được giữ lại sau khi đánh giá dữ liệu

105

105

104

...

...

...

Cỡ phần mẫu thử, g

25

25

25

25

Độ đặc hiệu, %

100

-

-

...

...

...

Độ nhạy, %

-

98,1

99

nd

LOD₅₀ (khoảng tin cậy 95%), cfu/phần mẫu thử

-

6,0 (từ 4,7 đến 7,7)

nd là không xác định

...

...

...

Các kết quả số có xác suất lớn nhất (MPN) của các mẫu nhiễm nhân tạo như sau:

Phép thử I mức thấp

Phép thử I mức cao

Phép thử II mức thấp

MPN/25 g

9,6 (từ 2,2 đến 26)

115 (từ 22,5 đến 495)

0,7 (từ 0,2 đến 2,3).

...

...

...

Thông số

Thử nghiệm I thịt gia cầm nguyên liệu

(mẫu trắng)

Thử nghiệm I thịt gia cầm nguyên liệu

(nhiễm ở mức thấp)^a

Thử nghiệm I thịt gia cầm nguyên liệu

(nhiễm ở mức cao)^a

Thử nghiệm II thịt gia cầm nguyên liệu

(nhiễm ở mức thấp)^a

...

...

...

(nhiễm ở mức cao)^a

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

25

25

25

13

13

Số lượng mẫu trong một phòng thử nghiệm

5

...

...

...

5

6

6

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi đánh giá dữ liệu

20

20

20

13

13

...

...

...

100

99

100

78

78

Cỡ phần mẫu thử, g

25

25

25

...

...

...

25

Độ đặc hiệu, %

100

-

-

nd

nd

Độ nhạy, %

-

...

...

...

100

nd

nd

LOD₅₀ (khoảng tin cậy 95%), cfu/phần mẫu thử

-

nd

nd

2,2 (từ 1,5 đến 3,2)

nd là không xác định

...

...

...

Các kết quả số có xác suất lớn nhất (MPN) của các mẫu nhiễm như sau:

Phép thử I mức thấp

Phép thử I mức cao

Phép thử II mức thấp

Phép thử II mức cao

MPN/25 g

3,7 (từ 1 đến 9,5)

5,8 (từ 1 đến 25)

...

...

...

1,0 (từ 2,2 đến 4,5).

Bảng C.4 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được với vật liệu chuẩn

Thông số

Vật liệu chuẩn

(viên nang chứa khoảng 5 cfu S. Typhimurium)

Số lượng phòng thử nghiệm trả lại kết quả

26

Số lượng mẫu trong một phòng thử nghiệm

5

...

...

...

1

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

25

Số lượng các mẫu được chấp nhận

125

Độ đặc hiệu, %

-

Độ nhạy, %

94,4

...

...

...

Trong năm 2003, một nghiên cứu đánh giá xác nhận theo ISO 16140:2003^[5] đã được thực hiện (xem Tài liệu tham khảo [9] để so sánh độ hồi, chỉ sử dụng thạch MSRV với phương pháp quy định trong ISO 6579:2002^[1] (sử dụng môi trường tăng sinh chọn lọc, canh thang RVS và canh thang MKTTn). Kết quả so sánh của nghiên cứu này được tóm tắt trong các Bảng C.5 và Bảng C.6. Một nghiên cứu so sánh liên phòng thử nghiệm cũng đã được thực hiện, trong đó các kết quả được tóm tắt dưới Bảng C.5 và Bảng C.6.

Bảng C.5 - Số lượng mẫu được kiểm tra trong nghiên cứu so sánh phương pháp về đánh giá xác nhận thạch MSRV

Loại thực phẩm

Dương tính

Âm tính

Tổng số

n.c.

a.c.

Tổng số

...

...

...

26

13

39

40

79

Sản phẩm sữa

13

18

31

...

...

...

67

Cá, hải sản và rau

4

28

32

32

64

Sản phẩm trứng, bột nhão

3

...

...

...

32

34

66

Mẫu môi trường

0

30

30

31

61

...

...

...

46

118

164

173

337

n.c. là nhiễm tự nhiên; a.c là nhiễm nhân tạo

Bảng C.6 - Các kết quả nghiên cứu so sánh phương pháp về đánh giá xác nhận thạch MSRV

Loại thực phẩm

AC (%)

...

...

...

SE (%)

Thịt và sản phẩm thịt

96

98

95

Sản phẩm sữa

100

100

100

...

...

...

95

94

97

Sản phẩm trứng

98

100

97

Mẫu môi trường

98

...

...

...

97

Tất cả các mẫu

98

98

97

AC là độ chính xác tương đối; SP là độ đặc hiệu tương đối; SE là độ nhạy tương đối.

Các kết quả khác của nghiên cứu so sánh phương pháp như sau:

- tám kết quả sai lệch (năm sai lệch âm và ba sai lệch dương), không đáng kể;

- mức phát hiện tương đối đối với năm nền mẫu là từ 0,49 đến 0,78 tế bào Salmonella trên 25 g hoặc 25 ml;

...

...

...

- thử nghiệm chọn lọc âm được thử nghiệm trên 48 chủng không phải Salmonella ảnh hưởng bởi các phương pháp phát hiện Salmonella (từ 10^4 cfu/ml đến 10^6 cfu/ml trong BPW);

- nghiên cứu các kết quả thử nghiệm chọn lọc dương/âm cho thấy độ đặc hiệu của phương pháp. Ba chủng Salmonella không phát hiện được (2x S. Paratyphi A, 1x S. Enteritidis) và hai chủng Enterobacter cloacae cho các kết quả dương tính giả định.

Kết quả nghiên cứu so sánh liên phòng như sau;

- 29 phòng thử nghiệm tham gia từ 10 quốc gia khác nhau;

- mỗi phòng thử nghiệm đã kiểm tra 24 mẫu sữa bột gầy bị nhiễm nhân tạo ở ba mức nhiễm khác nhau (0 cfu/25 g, 10 cfu/25 g, 30 cfu/25 g). Tám mẫu lặp lại cho mỗi mức nhiễm đã được kiểm tra;

- thử nghiệm lặp lại hai lần với thạch MSRV và ISO 6579:2002^[1];

- 240 kết quả trên mỗi phương pháp;

- không có ngoại lệ;

- đối với tất cả các mức nhiễm: AC, SE, SP: 100%, và khoảng tin cậy: 98%;

...

...

...

C.3  Đặc tính hiệu năng của thạch MSRV để phát hiện Salmonella spp. trong phân động vật và trong các mẫu môi trường từ giai đoạn sản xuất ban đầu

Dữ liệu độ chụm của thạch MSRV để phát hiện Salmonella spp. trong phân động vật và trong các mẫu môi trường từ giai đoạn sản xuất ban đầu đã được tính từ ba nghiên cứu liên phòng khác nhau do EURL-Salmonella, RIVM, Hà Lan tổ chức. Các nghiên cứu liên quan này được tổ chức trong năm 2008^[16], 2012^(17) và 2013^[21]. Các mẫu đã được thử nghiệm trong ba nghiên cứu này lần lượt là phân gà, phân lợn và bọc ủng. Các mẫu này đã được kiểm tra ở hai mức nhiễm khác nhau, cộng với kiểm chứng âm tính. Tất cả các nghiên cứu này được Ủy ban châu Âu tài trợ.

Phương pháp dùng cho các nghiên cứu liên phòng là ISO 6579:2002/Amd 1:2007^[12] để phát hiện Salmonella trong các mẫu từ giai đoạn sản xuất ban đầu bao gồm tăng sinh chọn lọc trên thạch MSRV. Phương pháp này đã được bao gồm trong tiêu chuẩn này.

Các giá trị đặc tính hiệu năng đã thu được từ các nghiên cứu liên phòng cho mỗi loại mẫu nêu trong các Bảng C.7 đến Bảng C.9. Dữ liệu thu được bởi một số phòng thử nghiệm cộng tác đã bị loại ra khỏi phép tính chỉ dựa trên các lý do kỹ thuật được xác định rõ (lệch với quy định).

Bảng C.7 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được với mẫu phân gà

Thông số

Phân gà +

Mẫu trắng

STM5^a

...

...

...

SE7^a

SE91^a

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

32

32

32

32

32

Số lượng mẫu trên một phòng thử nghiệm

...

...

...

5

5

5

5

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi đánh giá dữ liệu

19

19

19

19

...

...

...

Số lượng mẫu được giữ lại sau khi đánh giá dữ liệu

95

95

95

95

95

Cỡ mẫu thử, g

10

10

...

...

...

10

10

Độ đặc hiệu, %

100

-

-

-

-

Độ nhạy cho mỗi serovar và mỗi mức, %

...

...

...

96,8

100

67,4

100

LOD₅₀ của mỗi serovar (khoảng tin cậy 95%), cfu/phần mẫu thử

-

1,0 (từ 0,7 đến 1,4)

4,3 (từ 3,3 đến 5,6)

LOD₅₀ của tất cả (khoảng tin cậy 95%), cfu/phần mẫu thử

...

...

...

2,5 (từ 2,1 đến 3,0)

^a Các mẫu phân gà nhiễm nhân tạo bằng vật liệu chuẩn với các chủng và các mức sau đây:

Salmonella Typhimurium (STM) ở mức 5 cfu/phần mẫu thử và mức 44 cfu/phần mẫu thử;

Salmonella Enteritidis (SE) ở mức 7 cfu/phần mẫu thử và mức 91 cfu/phần mẫu thử

Bảng C.8 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được từ các mẫu phân lợn

Thông số

Phân lợn +

Mẫu trắng

SD6^a

...

...

...

STM10^a

STM58^a

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

33

33

33

33

33

Số lượng mẫu trên một phòng thử nghiệm

...

...

...

5

5

5

5

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi đánh giá dữ liệu

26

26

26

26

...

...

...

Số lượng mẫu được giữ lại sau khi đánh giá dữ liệu

130

130

130

130

130

Cỡ mẫu thử, g

25

25

...

...

...

25

25

Độ đặc hiệu, %

99,2

-

-

-

-

Độ nhạy cho mỗi serovar và mỗi mức, %

...

...

...

88,5

97,7

91,5

98,5

LOD₅₀ của mỗi serovar (khoảng tin cậy 95%), cfu/phần mẫu thử

-

2,8 (từ 2,2 đến 3,5)

3,8 (từ 3,0 đến 4,7)

LOD₅₀ của tất cả (khoảng tin cậy 95%), cfu/phần mẫu thử

...

...

...

3,2 (từ 2,8 đến 3,8)

^a Các mẫu phân lợn nhiễm nhân tạo bằng vật liệu chuẩn với các chủng và các mức sau đây:

Salmonella Derby (SD) ở mức 6 cfu/phần mẫu thử và mức 37 cfu/phần mẫu thử;

Salmonella Typhimurium (STM) ở mức 10 cfu/phần mẫu thử và mức 58 cfu/phần mẫu thử

Bảng C.9 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được trên mẫu túi bọc ủng

Thông số

Túi bọc ủng

+10 g vật liệu môi trường trên ổ gà đẻ +

Mẫu trắng

...

...

...

STM81^a

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

36

36

36

Số lượng mẫu trên một phòng thử nghiệm

8

8

8

...

...

...

33

33

33

Số lượng mẫu được giữ lại sau khi đánh giá dữ liệu

264

264

264

Cỡ phần mẫu thử

Túi bọc ủng

...

...

...

Độ đặc hiệu, %

99,6

-

-

Độ nhạy cho mỗi mức, %

-

94,7

98,1

LOD₅₀ (khoảng tin cậy 95%), cfu/mẫu thử

...

...

...

3,8 (từ 3,2 đến 4,4)

^a Các mẫu túi bọc ủng nhiễm nhân tạo bằng dịch cấy pha loãng của Salmonella Typhimurium (STM) ở mức 9 cfu/mẫu thử và mức 81 cfu/mẫu thử

Phụ lục D

(quy định)

Phát hiện các Salmonella enterica phân loài serovar Typhi và serovar Paratyphi

D.1  Yêu cầu chung

Một số serovar của Salmonella không phát hiện được bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này. Phụ lục này đưa ra các bước bổ sung cần thực hiện khi cần phát hiện các Salmonella enterica phân loại serovar Typhi và serovar Paratyphi. Cần thực hiện đầy đủ phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH: Các chủng của serovar Gallinarum (các biovar gallinarum và pullorum) không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người và do đó trong tiêu chuẩn này không đề cập đến việc phân lập chúng (xem Tài liệu tham khảo [12]). Tuy nhiên, nếu các biovar này cần được tìm thì có thể sử dụng môi trường Selenit Cystin (SC) bổ sung cho canh thang RVS và canh thang MKTTn như mô tả trong phụ lục này.

...

...

...

D.2.1  Nguyên tắc

CẢNH BÁO - Salmonella Typhi và Salmonella Paratyphi là các vi sinh vật thuộc mối nguy nhóm 3. Cần sử dụng các trang thiết bị thích hợp khi xử lý các chủng này.

D.2.1.1 Yêu cầu chung

Xem 4.1.

D.2.1.2  Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc

Xem 4.2.

D.2.1.3  Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc

Xem 4.3. Cấy dịch thu được trong 4.2 vào môi trường selenit cystin (SC) bổ sung cho việc nuôi cấy trong canh thang RVS và canh thang MKTTn.

Môi trường SC được ủ ở 37 °C (6.3) trong 24 h và 48 h.

...

...

...

Xem (4.4). Cấy dịch thu được trong 4.3 và D.2.1.3 vào thạch Bismuth sulphit (BS) bổ sung cho thạch XLD.

Thạch BS được ủ ở 37 °C (6.3) và kiểm tra sau 24 h và sau 48 h, nếu cần.

D.2.1.5  Khẳng định việc nhận biết

Xem 4.5.

D.3  Môi trường nuôi cấy

D.3.1  Môi trường Selenit Cystin (SC)

CẢNH BÁO - Natri hydro selenit có thể gây quái thai và có thể gây hại cho thai nhi. Cần phải có các biện pháp phòng ngừa thích hợp khi chuẩn bị và xử lý môi trường này.

D.3.1.1  Môi trường cơ bản

Pepton^a

...

...

...

Lactose

4,0 g

Dinatri hydro phosphat ngậm 12 phân tử nước (Na₂HPO₄.12H₂O)

10,0 g

Natri hydro selenit

4,0 g

...

...

...

Nước

1 000 ml

^a Ví dụ: Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym.

D.3.1.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan natri hydro selenit trong nước, sau đó thêm các thành phần còn lại. Đun đến sôi để hòa tan.

D.3.1.2  Dung dịch L-Cystin

D.3.1.2.1  Thành phần

L-Cystin

...

...

...

Nước vô trùng

0,1g

15 ml

Khoảng 85 ml

D.3.1.2.2  Chuẩn bị

Cho các thành phần trên vào bình định mức 100 ml (D.4.2) vô trùng. Pha loãng với nước vô trùng đến vạch. Không khử trùng.

D.3.1.3  Môi trường hoàn chỉnh

D.3.1.3.1  Thành phần

Môi trường cơ bản (D.3.1.1)

...

...

...

1 000 ml

100 ml

D.3.1.3.2  Chuẩn bị

Bằng kỹ thuật vô trùng, cho dung dịch L-Cystin vào môi trường cơ bản. Chỉnh pH, sao cho pH cuối cùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Phân phối môi trường một cách vô trùng vào ống hoặc bình vô trùng (6.12) để đạt được độ sâu ít nhất 5 cm. Khử trùng bằng hơi nước trong 15 min. Không hấp áp lực.

Bảo quản các ống môi trường đã rót ở 5 °C (6.8). Nếu xuất hiện kết tủa màu đỏ thì loại bỏ môi trường.

D.3.2  Thạch Bismuth Sulfit (BS)

D.3.2.1  Thành phần

Sản phẩm thủy phân các mô động vật bằng enzym

Chất chiết thịt

...

...

...

Dinatri hydro phosphat (khan) (Na₂HPO₄)

Sắt (II) sulfat (khan)

Bismuth sulfit (chỉ thị)

Xanh brilliant

Thạch

Nước

10,0 g

5,0 g

5,0 g

...

...

...

0,3 g

8,0 g

0,025 g

20,0 g

1 000 g

D.3.2.2  Chuẩn bị

Cho các thành phần trên vào nước và gia nhiệt có khuấy đến sôi. Tiếp tục đun sôi nhẹ trong 30 s đến 60 s để hòa tan thạch và thu được huyền phù đồng nhất (chất kết tủa không tan). Làm nguội đến khoảng từ 47 °C đến 50 °C, sau đó khuấy nhẹ để tạo huyền phù phần kết tủa.

Chỉnh pH, sao cho pH là 7,7 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Rót 20 ml đến 25 ml huyền phù vào đĩa Petri (6.14) và để cho đông đặc. Các đĩa đã chuẩn bị đúng cách sẽ có màu vàng rơm nhạt đục và mượt như kem.

...

...

...

Ngay trước khi sử dụng, làm khô đĩa thạch, nếu cần. Không làm quá khô.

D.3.3  Thử nghiệm hiệu năng

Định nghĩa về độ chọn lọc và năng suất được quy định trong TCVN 8128 (ISO 11133). Thể tích dịch cấy phải giống như thể tích dịch cấy được sử dụng trong phương pháp mà môi trường có chứa số lượng sinh vật đích hoặc không phải đích quy định trong 5.4 của TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014).

Bảng D.1 - Thử nghiệm hiệu năng về đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy

Môi trường

Chức năng thử nghiệm

Ủ

Chủng kiểm chứng

Số WDCM^a

...

...

...

Selenit

Cystin

Năng suất

24 h ± 3 h/

37 °C±1°C

Salmonella Typhimurium^c,d

Salmonella Enteritidis^c,d

+ Escherichia coli^d

+ Pseudomonas aeruginosa

...

...

...

00030

00012 hoặc 00013

00025

>10 khuẩn lạc đặc trưng trên thạch XLD hoặc môi trường được chọn khác

Độ chọn lọc

Escherichia coli^d

00012 hoặc 00013

Ức chế một phần ≤100 khuẩn lạc trên TSA

Enterococcus faecalis^d

...

...

...

<10 khuẩn lạc trên TSA

Thạch

Bismuth

sulfit

Năng suất

2x(24 h + 3 h)/

37 °C ± 1 °C

Salmonella Typhimurium^c,d

Salmonella Enteritidis^c,d

...

...

...

00031

00030

Phát triển tốt (2) các khuẩn lạc màu nâu, xám hoặc đen, thường có ánh kim loại sau 24 h và chuyển màu đen đều sau 48 h

Độ chọn lọc/ độ đặc hiệu

Escherichia coli^d

00012 hoặc 00013

Phát triển hoặc ức chế một phần (từ 0 đến 1) các khuẩn lạc màu xanh lá cây hoặc nâu không có ánh kim loại

Độ chọn lọc

...

...

...

Enterococcus faecalis^d

00009 hoặc 00087

Ức chế hoàn toàn (0)

^a Liên quan đến chủng đối chứng xem tại w.w.w.wfcc.info đối với thông tin về số lượng bộ sưu tập chủng cấy và các chi tiết liên hệ; WDCM: World data Cetre for Microorganisms.

^b Sử dụng tối thiểu một chủng.

^c Một số hướng dẫn khác có thể yêu cầu sử dụng các serovar khác. Xem các yêu cầu cụ thể liên quan đến việc chọn các Salmonella serovar.

^d Tùy chọn chủng được chọn tự do, tối thiểu sử dụng một chủng.

e Sự phát triển được phân như sau: 0: không phát triển; 1: phát triển kém (ức chế từng phần); 2: phát triển tốt [(xem TCVN 8128 (ISO 11133)].

D.4  Thiết bị và dụng cụ

...

...

...

Ngoài các thiết bị và dụng cụ nêu trong Điều 6, sử dụng các thiết bị và dụng cụ sau:

D.4.2  Bình định mức, vô trùng, dung tích danh định 100 ml.

D.5  Cách tiến hành

D.5.1  Yêu cầu chung

Ngoài quy trình quy định trong Điều 9, bổ sung các bước sau.

D.5.2  Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc

Chuyển 1 ml dịch nuôi cấy trong 9.2 vào ống có chứa 10 ml môi trường SC (D.3.1).

Ủ môi trường nuôi cấy SC ở 37 °C (6.3) trong 24 h ± 3 h và 48 h ± 3 h.

D.5.3  Nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc

...

...

...

D.5.3.2  Tiến hành theo cách tương tự với thạch BS (D.3.2) sử dụng một que cấy vòng vô trùng như trên.

D.5.3.3  Ủ các đĩa thạch XLD và BS ở 37 °C (6.3) trong 24 h ± 3 h.

D.5.3.4  Sau khi ủ 24 h ± 3 h ở 37 °C (6.3), kiểm tra các đĩa thạch BS về sự có mặt của các khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu đen, xám, hoặc nâu có hoặc không có ánh kim loại. Ban đầu môi trường xung quanh thường có màu nâu sau đó chuyển sang màu đen khi tăng thời gian ủ. Đánh dấu vị trí của các khuẩn lạc này dưới đáy đĩa. Nếu có mặt các khuẩn lạc điển hình thì chọn năm khuẩn lạc để khẳng định.

Ủ lại các đĩa thạch BS thêm 24 h (tổng 48 h ± 3 h) và kiểm tra lại các khuẩn lạc điển hình hoặc không điển hình có màu xanh lá cây hơi đen hoặc không có màu đen.

D.5.3.5  Sau khi ủ 24 h ± 3 h ở 37 °C, kiểm tra các đĩa thạch XLD như mô tả trong 9.4.2. Các khuẩn lạc điển hình có tâm màu đen và vùng màu đỏ trong suốt do sự đổi màu của chất chỉ thị. Các biến thể Salmonella âm tính H₂S như Salmonella Paratyphi A có màu hồng với tâm màu hồng đậm hơn. Đánh dấu vị trí của chúng dưới đáy đĩa.

Nếu không phát hiện được các khuẩn lạc điển hình hoặc không điển hình thì ủ lại các đĩa thêm 24 h ở 37 °C (6.3) (tổng 48 h ± 3 h) và kiểm tra lại.

CHÚ THÍCH: Không phải tất cả các môi trường thạch có màu có thể giúp cho việc phục hồi Salmonella Typhi và Salmonella Paratyphi.

D.6  Khẳng định

D.6.1  Yêu cầu chung

...

...

...

D.6.2  Diễn giải các phép thử sinh hóa

Salmonella Typhi và Salmonella Paratyphi thường cho thấy các phản ứng được đưa ra trong Bảng 1.

Phụ lục E

(tham khảo)

Ví dụ về các môi trường nuôi cấy đĩa thạch chọn lọc

CHÚ THÍCH 1: Thông tin được lấy từ Tài liệu tham khảo [20] với sự cho phép của Hiệp hội Hóa học Hoàng gia, Cambridge, Vương quốc Anh.

CHÚ THÍCH 2: Danh mục các môi trường nuôi cấy đĩa thạch chọn lọc vẫn chưa đầy đủ.

Bảng E.1 - Thuốc thử chọn lọc (g/l) được sử dụng trong một số môi trường thạch chọn lọc dùng để phân lập Salmonella spp.

...

...

...

Mật

Bismuth sulfit

Xanh brilliant

Cefsulodin

Ferric amoni xitrat III

Natri xitrat

Natri desoxycholat

Novobioxin

Tergitol 4

...

...

...

ABC^c

0,012 5 + 0,005

0,5

8,5

5,0

...

...

...

BGA

...

...

...

BS

8,0^b

0,016 + 0,025

...

...

...

BSA™ (OSCM ll)^c,e

0,012

...

...

...

0,005

CHROMAgar™ Salmonella^i

2

...

...

...

2,5

0,01

CHROMAgar™ Salmonella Plus^i

...

...

...

1,5

0,15

1,5

CSE

...

...

...

0,5

0,07

DCLS

...

...

...

10,5

2,5

5,0

DCA

...

...

...

1,0

6,0

3,0

5,4

...

...

...

9,0

1,5

...

...

...

MLCB

0,012 5

1,0

...

...

...

4,0

MM

0,8

...

...

...

4,5 ml

6,8

Önöz^f

3,825

0,001 66

0,5

9,3

...

...

...

4,25

Thạch Rambach™^j

...

...

...

chromlD^® Salmonella (SMID2)^g

1,5

0,000 3

...

...

...

SS

8,5

0,000 33

...

...

...

1,0

8,5

8,5

XLD

...

...

...

0,8

1,0

6,8

XLT4

...

...

...

0,8

4,6 ml

6,8

IBISA^®^g

...

...

...

2,5

0,02

...

...

...

0,025

5

...

...

...

IRIS Salmonella^®^h

0,010

7,0

...

...

...

Rapid'Salmonella^i

0,010

5,0

...

...

...

^a ABC: αβ-Môi trường sinh màu; BGA: Thạch xanh brilliant; BS:Thạch Bismuth Sulfit; BSA: Thạch Salmonella brilliance™ (thường được gọi là OSCM II. Môi trường sinh màu Salmonella oxoid II); CSE: Estease Salmonella sinh màu ^[10]; DCLS: Thạch Desoxycholat Xitrat Lactose; DCA: Thạch Desoxycholat Xitrat (thạch leifson); HE: Thạch Hektoen Enteric; MLCB: Thạch xanh brillant tinh thể tím lysin mannitol; MM: Thạch Miller Mallinson ^[18]; chromlD^® Salmonella (còn gọi là SMID2: Môi trường nhận biết Salmonella ll); SS: Thạch Salmonella Shigella; XLD: Thạch Deoxycholat Lysin Xylose; XLT4: Thạch Xylose Lysin Tergitol 4.

^b Natri sulfit: 6,15 g/l và bismuth amoni xitrat: 1,85 g/l.

^c BSA cũng chứa Inhibigen™ để ức chế chọn lọc sự phát triển của Escherichia coli.

Thông tin dưới đây đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương:

^d LABM là ví dụ về sản phẩm thích hợp của nhà cung cấp môi trường ABC.

^e BSA^TM là tên thương mại sản phẩm thích hợp có bán sẵn được cung cấp bởi Oxoid.

^f Merck là ví dụ về nhà cung cấp thích hợp môi trường Önöz.

...

...

...

^h IRIS Salmonella^® là tên thương mại sản phẩm thích hợp có bán sẵn được cung cấp bởi SOLABIA S.A.S và Các chẩn đoán BIOKAR

^i Biorad là ví dụ về nhà cung cấp thích hợp Rapid’ Salmonella.

^j CHROMagar^TM Salmonella. CHROMAgar™ Salmonella Plus, Thạch Rambach™ là tên thương mại sản phẩm thích hợp có bán sẵn được cung cấp bởi CHROMagar.

Bảng E.2 - Hệ thống thuốc thử chỉ thị được sử dụng trong một số môi trường thạch chọn lọc dùng để phân lập Salmonella spp. Các thuốc thử này chỉ thị cho các phản ứng xảy ra ở hầu hết các chủng Salmonella. Giữa các dấu ngoặc là nồng độ của các thuốc thử liên quan được tính bằng g/l

Môi trường

α-galac- tosidase dương tính

β-galac- tosidase âm tính

β -glu- cosidase âm tính

...

...

...

Cellobiose âm tính

H₂S dương tính

Lactose âm tính

Lysin decac- boxylase dương tính^b

Mannitol dương tính

Propylen glycol dương tính

Salicin âm tính

Sucrose âm tính

Trehalose dương tính

...

...

...

ABC^c

X

X

...

...

...

BGA

...

...

...

X(10)

X(10)

...

...

...

BS

X

...

...

...

BSA™ (OSCM ll)^d

X

...

...

...

...

...

...

CHROMAgar™ Salmonella

X

X

X

...

...

...

CHROMAgar™ Salmonella Plus^i

X

...

...

...

...

...

...

CSE

X

X (14,6)

...

...

...

DCLS

...

...

...

X (5,0)

X (5,0)

...

...

...

DCA

X

X (10,0)

...

...

...

HE

...

...

...

X

X (12,0)

X (2,0)

X (12,0)

...

...

...

MLCB

X

X (5,0)

...

...

...

MM

X

...

...

...

X (5,0)

X

X (10,0)

X (1,2)

X (1,33)

...

...

...

Önöz^e

X

X (11,5)

...

...

...

X (13,0)

Thạch Rambach™^i

X

...

...

...

X (10,5)

...

...

...

chromlD^® Salmonella (SMID2)^f

X

X

X

X (6,0)

...

...

...

SS

...

...

...

X

X (10,0)

...

...

...

XLD

X

X (7,5)

X (5,0)

...

...

...

X (7,5)

X (3,75)

XLT4

...

...

...

X

X (7,5)

X (5,0)

X (7,5)

...

...

...

ASAP^®^f

X

X

...

...

...

IBISA^®^f

X

...

...

...

...

...

...

IRIS Salmonella^®^g

...

...

...

Rapid' Salmonella

...

...

...

...

...

...

^a ABC: αβ-Môi trường sinh màu (www.labm.com); BGA: Thạch xanh brilliant; BS:Thạch Bismuth Sulfit; BSA: Thạch Salmonella brilliance™ (thường được gọi là OSCM ll: Môi trường sinh màu Salmonella oxoid; www.oxoid.com): CSE: Estease Salmonella sinh màu ^[10]; DCLS: Thạch Desoxycholat Xitrat Lactose; DCA: Thạch Desoxycholat Xitrat (thạch Leifson); HE: Thạch Hektoen Enteric: MLCB: Thạch xanh briiliant tinh thể tím lysin mannitol: MM: Thạch Miller Mallinson ^[18]; SMID2: Môi trường nhận biết Salmonalla II (còn gọi là chromlD^® Salmonella; www.biomerieux.com); SS: Thạch Salmonella Shigella; XLD: Thạch Deoxycholat Lysin Xylose; XLT4: Thạch Xytose Lysin Tergitol 4.

^b Thuốc thử là L-Lysin hydroclorua.

Thông tin dưới đây đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

^c LABM là ví dụ về nhà cung cấp thích hợp môi trường ABC.

^d BSA^TM là tên thương mại sản phẩm thích hợp có bán sẵn được cung cấp bởi Oxoid.

^e Merck là ví dụ về nhà cung cấp thích hợp môi trường Önöz.

^f chromlD^® Salmonella là tên thương mại sản phẩm thích hợp có bán sẵn được cung cấp bởi bioMerieux.

^g IRIS Salmonella^® là tên thương mại sản phẩm thích hợp có bán sẵn được cung cấp bởi SOLABIA S.A.S và các chẩn đoán BIOKAR

^h Biorad là ví dụ về sản phẩm thích hợp của nhà cung cấp Rapid'Salmonella.

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Cor 1:2004) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch.

[2] Sửa đổi 1:2008 TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Amd. 1:2007) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella spp. trên đĩa thạch - Sửa đổi 1: Phụ lục D: Phát hiện Salmonella spp. trong phân động vật và trong mẫu môi trường từ giai đoạn sản xuất ban đầu

[3] TCVN 10780-2 (ISO/TS 6579-2) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện, định lượng và xác định kiểu huyết thanh của Salmonella - Phần 2: Định lượng bằng kỹ thuật số đếm có xác suất lớn nhất được thu nhỏ

[4] TCVN 6402:2007 (ISO 6785:2001) Sữa và sản phẩm sữa - Phát hiện Salmonella

[5] ISO 16140:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Protocol for the validation of alternative methods

[6] ISO 16140-1, Microbiology of the food chain - Method validation - Part 1: Vocabulary

[7] ISO 16140-2, Microbiology of the food chain - Method validation - Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method.

...

...

...

[9] S. Colombo, J. Crociani, H. Horry ISO16140 validation of the MSRV method for Salmonella spp. Detection in food and environ-mental samples. Poster at IAFP, Rome, 2007

[10] V.M. Cooke, R.J. Miles, R.G. Price, A.c. Richardson A novel chromogenic ester agar medium for detection of Salmonellae. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65 pp. 807-812

[11] Culture Media FOR Food Microbiology In: Progress in Industrial Microbiology. (J.E.L. Corry, G.D.W. Curtis, R.M. Baird eds.). Elsevier, Amsterdam, Vol. 34, 1995

[12] J.M. Smedt De, R.F. Bolderdijk, H. Rappold, D. Lautenschlaeger Rapid Salmonella detection in foods by motility enrichment on a modified semi-solid Rappaport-Vassilladis medium. J. Food Prot. 1986, 49 (7) pp. 510-514

[13] W.H. Ewing Edwards and Ewing’s Identification of Enterobacteriaceae. Elsevier Science publishing Co., Inc, New York, Fourth Edition, 1986

[14] M.M. Ewing, W.H. and Ball, The biochemical reactions of the genus Salmonella. National Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, 1996

[15] P.Feldsine Recovery of Salmonella in Selected Foods by the ISO 6579 Salmonella Culture Procedure and the AOAC International Official Method of Analysis: Collaborative Study. J. AOAC Int. 2001

[16] A.F.A. Kuijpers, C. Veenman, K.A. Mooijman EU Interlaboratory comparison study Veterinary-XI, 2008. Bacteriological detection of Salmonella in chicken faeces. National Institute for Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands. RIVM Report no.: 330604 011/ 2008. Available at: http://www.rivm.nl/bibliotheek/rapporten/330604011.pdf (visited 2016-12-14)

[17] A.F.A. Kuijpers, K.A. Mooijman 2013. EU Interlaboratory comparison study Veterinary-XV (2012) - Detection of Salmonella in pig faeces. National Institute for Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands. RIVM Report no.: 330604 028/ 2013. Available at: http://www.rivm.nl/bibliotheek/rapporten/330604028.pdf (visited 2016-12-14)

...

...

...

[19] Manual of Diagnostic Tests and Vaccines FOR Terrestrial Animals 2009 (OIE Terrestrial Manual) Chapter 2.3.11 Fowl Typhoid and Pullorum Disease, pp. 538-48. Available at: http://www.oie.int/manual-of-diagnostic-tests-and-vaccines-for-terrestrial-animals/ (visited 2016-12-14)

[20] K.A. Mooijman Culture media for the isolation of Salmonella. In: Handbook of Culture media for Food and Water Microbiology, (J.E.L. Corry, G.D.W. Curtis, R.M. Baird eds.). Third Edition, 2012

[21] A.F.A. Kuijpers, K.A. Mooijman EU Interlaboratory comparison study primary production-XVI (2013) - Detection of Salmonella in chicken faeces adhering to boot socks. National Institute for Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands. RIVM Report no.: 330604 031/2014. Available at:http://www.rivm.nl/bibliotheek/rapporten/330604031.pdf (visited 2016-12-14)

[22] O.A. Soutourina, E.A. Semenova, V.V. Parfenova, A. Danchin, P. Berlin Control of bacterial motility by environmental factors in polarly flagellated and peritichous bacteria isolated from Lake Baikal. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67 (9) pp. 3852-3859

[23] C. Veenman, H. Korver, K.A. Mooijman Improvements in the method for detection of Salmonella spp. in animal faeces. National Institute for Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands. RIVM report 330300 010, 2007. Available at: http://www.rivm.nl/bibliotheek/rapporten/330300010.pdf (visited 2016-12-14)

[24] TCVN 10780-3 (ISO/TR 6579-3) VI sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp phát hiện, định lượng và xác định typ huyết thanh của Salmonella - Phần 3: Hướng dẫn xấc định typ huyết thanh của Salmonella spp.

[25] TCVN 8129 (ISO 18593) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu bề mặt sử dụng đĩa tiếp xúc và lau bề mặt

[26] TCVN 11923 (ISO/TS 17728) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lấy mẫu để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

[27] TCVN 6400 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu

...

...

...

[29] TCVN 7925 (ISO 17604) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu thân thịt tươi để phân tích vi sinh vật

[30] D’AOUST J.Y. MAISHMENT C., BRUGENER D.M., CONLEY D.R., LOIT A., MILLING M. AND PURVIS U. Detection of Salmonella in refrigerated preenrichment and enrichment broth cultures. J. Food Prot. 1980, 43 (5) pp. 343-345

[31] D'AOUST J.Y. BECKERS H.J., BOOTHROYD M., MATES A., MCKEE C.R., MORAN A.B., SADO P., SPAIN G.E., SPERBER W.H., VASSILIADIS P., WAGNER D.E. AND WIBERG C. ICMSF methods studies. XIV. Comparative study on recovery of Salmonella from refrigerated preenrichment and enrichment broth cultures. J. Food Prot. 1983,46 (5) pp. 391-399

[32] BECKERS H.J., van LEUSDEN F.M. AND PETERS R. Net effect van koelen van bebroede voorophopings- en selectieve ophopingsbouillon op de isolatie van Salmonella, (in Dutch). De Ware(n). Chemicus. 1984, 14 pp. 75-80

[33] DAVIES R.H. BEDFORD S. AND SHANKSTER S. Enhanced culture techniques for the detection of Salmonella. Vet. Rec. 2001, pp. 539-540

[34] COMMUNITY REFERENCE LABORATORY FOR SALMONELLA. Newsletter 2008, Vol. 14, no. 2, page 8. Available at: http://www.eurlsalmonella.eu/dsresource?type=pdf&disposition=inline& objectid=rivmp:181223&versionid=&subobjectname (visited 2016-12-14)

[35] H. Becker, S. Eberhardt, E. Märtlbauer Comparative studies on the detection of Salmonellae in milk and milk products using a horizontal (ISO 6579:2002) and a vertical (ISO 6785/IDF 93:2001) International Standard. Arch. Lebensmittelhyg. 2003, 54 pp. 118-121

[36] European Union Reference Laboratory for Salmonella. Newsletter 2015, Vol. 21, no. 4, page 4. Available at: http://www.eurlsalmonella.eu/dsresource?type=pdf&disposition=inline&objectid=rivmp:299850&versionid=&subobjectname= (visited 2016-12-14)

[37] ISO 17468, Microbiology of the food chain - Technical requirements and guidance on establishment or revision of a standardized reference method

...

...

...