Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-20:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 20

• Số hiệu: TCVN8710-20:2019
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2019

Trường hợp	Phản ứng PCR		Kết quả
	Cặp mồi: 309F/309R	Căp mồi: MG831F/MG831R
1	Dương tính	Dương tính	Phát hiện vi rút IHHN typ gây bệnh
2	Dương tính	Âm tính	Phát hiện vi rút IHHN typ gây bệnh
3	Âm tính	Dương tính	Không phát hiện vi rút IHHN typ gây bệnh

7  Kết luận

Tôm được xác định là mắc bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu khi thể hiện các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và đồng thời có kết quả xét nghiệm dương tính với phản ứng realtime PCR và PCR (cặp mồi 309F/309R) hoặc kết quả xét nghiệm dương tính với phản ứng PCR (cặp mồi 309F/309R).

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A  Dung dịch muối đệm phốt phát pH ~ 7,2 (PBS)

A.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl)

...

...

...

Kali clorua (KCl)

0,2 g

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

1,15g

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)

0,2 g

Nước cất

1000 ml

A.2  Cách chuẩn bị

...

...

...

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

B.2  Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

- Hút 200 µl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 µl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 µl dung dịch Elution Buffer.

...

...

...

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 µl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

Phụ lục C

(Quy định)

Sơ đồ chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu trong phòng thí nghiệm

...

...

...

Hình C.1 - Sơ đồ chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu trong phòng thí nghiệm

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phát hiện vi rút IHHN bằng phương pháp realtime PCR

D.1  Trình tự cặp mồi, đoạn dò

Bảng D.1 - Trình tự cặp mồi, đoạn dò

Mồi và đoạn dò

Trình tự nucleotit (từ 5' đến 3')

...

...

...

bp

Mồi xuôi: IHHNV 1608F

TAC-TCC-GGA-CAC-CCA-ACC-A

81

Mồi ngược: IHHNV 1688R

GGC-TCT-GGC-AGC-AAA-GGT-AA

Đoạn dò: IHHNV-p

Texas Red ACC-AGA-CAT-AGA-GCT-ACA-ATC-CTC-GCC-TAT-TTG BHQ2

D.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

...

...

...

- Pha hỗn hợp nhân gen (Master mix) theo hướng dẫn của bộ kít.

- Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp Master mix tiến hành:

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml;

+ Cho 5 µl ADN mẫu vừa chiết tách vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix;

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng realtime PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi rút IHHNV (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút IHHNV) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (20 µl hỗn hợp Master mix và 5 µl) vào máy realtime PCR (4.2.1) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng realtime PCR.

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng realtime PCR

...

...

...

Nồng độ

µM

Thể tích cho 01 phản ứng

µl

Nước không có DNAse và RNAse

6,0

Mồi xuôi: IHHNV1608F

20

...

...

...

Mồi ngược: IHHNV1688R

20

0,5

Đoạn dò: IHHNVp

6

0,5

Dung dịch SuperMix

12,5

...

...

...

5

Tổng thể tích

25

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

...

...

...

2 phút (*)

1

95 (*)

2 phút (*)

1

95

15 giây

40

60

...

...

...

(Ghi nhận tín hiệu quang)

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG, Cat. No.: 11730-017.

Phụ lục E

(Tham khảo)

Phát hiện và phân biệt typ vi rút IHHN bằng phương pháp PCR

E.1  Trình tự mồi

Bảng E.1 - Trình tự mồi

Mồi

...

...

...

Kích thước sản phẩm

(bp)

Mồi xuôi: 309F

TCC-AAC-ACT-TAG-TCA-AAA-CCA-A

309

Mồi ngược: 309R

TGT-CTG-CTA-CGA-TGA-TTA-TCC-A

Mồi xuôi: MG831F

TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT

...

...

...

Mồi ngược: MG831R

GTC-CAT-CCA-CTG-ATC-GGA-CT

CHÚ THÍCH:

Cặp mồi 309F/309R dùng để phát hiện vi rút IHHN typ gây bệnh

Cặp mồi MG831F/MG831R dùng để phát hiện vi rút IHHN typ không gây bệnh

E.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

- Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kít nhân gen PCR. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix HotstarTaq^®Master Mix, Catalogue Number: 203445 của hãng Qiagen (thành phần bao gồm: HotStarTaq ADN Polymerase, PCR Buffer (với 3 mM MgCl₂) và 400 µM dNTP).

- Tổng thể tích của phản ứng PCR là 25 µl (20 µl hỗn hợp Master mix và 5 µl mẫu ADN):

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

...

...

...

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi rút IHHNV (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút IHHNV) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (hỗn hợp Master mix và mẫu ADN) vào máy PCR (4.2.1) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR.

Bảng E.2 - Thành phần phản ứng PCR

Thành phần nguyên liệu

(Theo hướnq dẫn của kít HotStarTaq DNA Polymerase)

Nồng độ

µM

...

...

...

µl

Nước không có DNAse/RNAse

5,5

Mồi xuôi: 309F

10

0,5

Mồi ngược: 309R

10

...

...

...

Mồi xuôi: MG831F

10

0,5

Mồi ngược: MG831R

10

0,5

Dung dịch HotStarTaq Master Mix

12,5

...

...

...

5

Tổng thể tích

25

Bảng E.3 - Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

...

...

...

15 phút (*)

01

94

30 giây

55

30 giây

35

72

...

...

...

72

7 phút

01

Giữ ở 4 °C

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít HotstarTag^®Master Mix, Cat. No.: 203445 (Qiagen).

E.3  Điện di sản phẩm PCR

+ Chuẩn bị thạch 1,5 %: cho 1,5 g agarose (3.2.4) vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, bổ sung thêm 100 ml TBE 0,5X, đun dung dịch thạch trong lò vi sóng và mang ra lắc nhẹ sau mỗi 30 giây cho đến khi thạch tan hoàn toàn. Mang lọ thạch ra khỏi lò vi sóng và đợi đến khi nhiệt độ thạch bên trong lọ giảm xuống còn khoảng 50 °C.

+ Cho 2,5 µl Gelred (3.2.5) vào 25 ml thạch 1,5 % (thể tích này sử dụng cho 17 hoặc 25 giếng) và lắc đều nhẹ nhàng để Gelred hòa tan hoàn toàn, tránh tạo bọt khí. Sau đó đổ thạch vào khuôn đã có gắn sẵn lược, chờ khoảng 1 giờ để thạch đông.

...

...

...

+ Các sản phẩm PCR được pha với dung dịch nạp mẫu (3.2.6). Sau đó cho hỗn hợp này vào giếng thạch.

+ Hút 7 µl thang chuẩn ADN (3.2.7) cho vào giếng cuối cùng.

+ Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.

+ Sau khi điện di xong, chụp ảnh và ghi nhận kết quả.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCCS 02:2016/TY-TS: Tiêu chuẩn cơ sở quy trình phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime PCR và PCR.

[2] RAHO6_V615-11:2017. Quy trình phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) trên tôm bằng kỹ thuật realtime PCR và PCR.

[3] OIE. 2018. Infection with infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals (OIE Aquatic Manual 2017, chapter 2.2.4).

...

...

...

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.