Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6187-1:2019 (ISO 9308-1:2014) về Chất lượng nước - Phần 1

11.3  Kiểm tra hiệu năng của oxidase

Ví dụ về các chủng kiểm soát thích hợp là Pseudomonas aeruginosa WDCM 00024 [Z] (chứng dương), Escherichia coli WDCM 00013 [Z], hoặc WDCM 00012 [Z] (chứng âm).

Phụ lục A

(tham khảo)

Thông tin bổ sung về vi khuẩn coliform

Ngoài sinh enzym β-D-galactosidase, vi khuẩn coliform là vi khuẩn gram âm, hình que, không sinh bào tử, âm tính oxidase, có khả năng phát triển hiếu khí và kị khí tùy tiện khi có muối mật (hoặc các chất hoạt tính bề mặt có khả năng ức chế phát triển tương tự), lên men lactose sinh axit và aldehyd trong 48 h sau khi ủ ở nhiệt độ (36 ± 2) °C.

Ngoài sinh enzym β-D-glucuronidase, E. coli là vi khuẩn coliform sinh indol từ tryptophan ở (44,0 ± 0,5) °C trong (21 ± 3) h. Do đó, phép thử indol là một trong những phép thử để khẳng định E. coli. E. coli dương tính với thử nghiệm đỏ metyl và có khả năng khử nhóm cacboxyl của axit L-glutamic nhưng không sinh axetyl metyl carbinol, sử dụng xitrat như nguồn cacbon duy nhất hoặc phát triển trong môi trường KCN.

...

...

...

(quy định)

Thành phần và chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử

B.1  Thạch coliform sinh màu (CCA)

Casein

1,0 g

Chất chiết nấm men

2,0 g

Natri clorua (NaCl)

5,0 g

...

...

...

2,2 g

Di-Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

2,7 g

Natri pyruvat (C₃H₃NaO₃)

1,0 g

Sorbitol (C₆H₁₄O₆)

1,0 g

Tryptophan

1,0 g

...

...

...

0,15 g

6-Chloro-3-indoxyl-β-D-galactopyranoside (Salmon-beta-D-galactosid), (CAS No. 138182-21-5)

0,2 g

Axit 5-Bromo-4-Chloro-3-indoxyl-β-D-glucuronic, muối cyclohexylamoni ngậm một phân tử nước (X-beta-G-glucuronide CHX salt) (CAS No.114162-64-0)

0,1 g

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) (CAS No. 367-93-1)

0,1 g

Thạch dùng cho vi sinh vật (dạng bột hoặc dạng mảnh)

9 g đến 18 g^c

...

...

...

1 000 ml

^a số CAS/ số đăng ký CAS là số nhận dạng duy nhất của hệ thống viết tắt hóa học dành cho các nguyên tố hóa học, hợp chất, polymer, các trình tự sinh học, hợp chất và hợp kim.

^b Tergitol^® là một ví dụ về sản phẩm thương mại phù hợp. Thông tin này được cung cấp tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng sản phẩm nêu trên.

^c Phụ thuộc vào sức đông của thạch.

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng trong bể cách thủy cho đến khi các thành phần được hòa tan hết (khoảng 35 min). Nếu cần, chỉnh pH để sau khi xử lý nhiệt, giá trị pH khoảng (6,8 ± 0,2) ở 25 °C. Không hấp khử trùng, không đun quá nhiệt. Phân phối vào các đĩa petri, độ dày ít nhất là 4 mm. Nếu không dùng ngay, các đĩa được bảo quản ở (5 ± 3) °C trong tối, và bọc để môi trường không bị khô ít nhất trong một tháng. Cần kiểm tra hơi nước trên các đĩa trước khi sử dụng. Khi thấy có hơi nước trên mặt đĩa, cần hong khô trước khi cấy mẫu.

B.2  Thuốc thử oxidase

N,N,N’,N’-Tetrametyl-p-phenyllenediamin dihydroclorua (CAS No. 637-01-4)        0,1 g

Nước                                                                                                                10 ml

Thuốc thử này không ổn định. Nên chuẩn bị mới một lượng nhỏ ngay trước mỗi lần sử dụng, bảo quản tránh ánh sáng.

...

...

...

B.3  Thạch Trypton đậu nành (TSA)

Trypton

15,0 g

Pepton đậu nành

5,0 g

Natri clorua (NaCl)

5,0 g

Thạch (dạng bột hoặc miếng)

15 g đến 25 g^a

...

...

...

1000 ml

^a Phụ thuộc vào sức đông của thạch.

Đun sôi để hòa tan các chất. Điều chỉnh pH nếu cần sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,1 ở 25 °C. Hấp khử trùng ở (121 ± 3) °C trong 15 min. Để nguội môi trường đến 50 °C và rót vào các đĩa petri sao cho độ dày môi trường ít nhất là 4 mm. Các đĩa môi trường chưa sử dụng, có thể bảo quản ở (5 ± 3) °C trong tối và bọc để môi trường không bị khô ít nhất 8 tuần.

CHÚ THÍCH: Bất kì thạch không chọn lọc nào cũng có thể được sử dụng cho việc cấy truyền trước khi thử oxidase, chỉ cần không gây ảnh hưởng đến phản ứng oxidase.

Phụ lục C

(quy định)

Đặc tính hiệu năng

Bảng C.1 - Đặc tính hiệu năng của thạch CCA

...

...

...

E. coli

Vi khuẩn coliform

Số mẫu = 220

Độ nhạy

94 %

91 %

Độ đặc hiệu

...

...

...

94 %

Tỉ lệ dương tính giả

6%

5 %

Tỉ lệ âm tính giả

3 %

11 %

Hiệu suất

96 %

...

...

...

Độ chọn lọc

- 0,78

- 0,32

Dải định lượng (khuẩn lạc trên màng 47 mm)

10 đến 100

10 đến 100

Độ thu hồi

> 80 %

> 70 %

...

...

...

Độ lặp lại

0,046

0,035

Độ tái lập

0,127

0,114

Thời gian ủ bắt buộc

...

...

...

^a Thời gian ủ thích hợp cho mẫu nước là 21 h. Ủ đến 24 h làm tăng độ hồi phục vi khuẩn đích đặc biệt là khi chúng bị tổn thương, ví dụ từ nước đã khử khuẩn

Dữ liệu để tính toán đặc tính hiệu năng được thu thập vào năm 2012 tại IWW Rheinisch-Westfälisches Institut für Wasser Beratungs-und Entwicklungsgesellschaft mbH, ở Mülheim a. d. Ruhr, Đức. Phần lớn các phép thử được thực hiện trên nước uống phân phối ở Mülheim a. d. Ruhr, đây là loại nước được lấy từ nước bề mặt sông Ruhr. Phụ thuộc vào từng loại mẫu nước và phương pháp của mỗi phòng thử nghiệm mà phòng thử nghiệm cần thực hiện thẩm định lần hai. Tất cả dữ liệu được công bố trong bài báo “Performance validation of chromogenic coliform agar for the enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria” in “Letters in Applied Microbiology” in December 2013”, có thể truy cập trên trang http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/lam.12147/suppinfo.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

[2] BYAMUKAMA, D., KANSIIME, F., MACH R.L., FARNLEITNER A.H. Determination of Escherichia coli Contamination with Chromocult Coliform Agar Showed a High Level of Discrimination Efficiency for Differing Fecal Pollution Levels in Tropical Waters of Kampala, Uganda. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66 pp. 864-868

[3] GEISSLER K., MANAFI M., AMOROS I., ALONSO J.L. Quantitative determination of total coliforms and Escherichia coli in marine waters with chromogenic and fluorogenic media. J.Appl.Microbiol. 2000, 88 pp. 280-285

[4] OSSMER R., SCHMIDT W., MENDE U. Chromocult Coliform Agar-Influence of Membrane Filter Quality on Performance. Poster presentation, 1999. Congreso de la Sociedad Espanola de Microbiologia, Granada, Spain (http://www.univie.ac.at/chromogenic/OSSMER.PDF)

[5] USEPA : 40 CFR Part 141) (sec.141.21) Federal Register/Vol.67, No.209, Tuesday October 29, 2002/Rules and Regulations

...

...

...

[7] http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf (viewed 03-01-2014).

1 Bactident® oxidase test đã được sử dụng để đánh giá các đặc tính hiệu năng của môi trường thạch coliform sinh màu trong phục lục C. Đây là một ví dụ về sản phẩm thương mại thích hợp sẵn có. Việc đưa ra thông tin này nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng.