Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12609:2019 về Dầu, mỡ động thực vật và thực vật

• Số hiệu: TCVN12609:2019
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2019

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12609:2019

DẦU, MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT PHENOL CHỐNG OXY HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal and vegetable fats and oils - Determination of phenolic antioxidants content by high performance liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 12609:2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 983.15 Phenolic antioxidants in oils, fats, butter oil. Liquid chromatographic method;

TCVN 12609:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

DẦU, MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT PHENOL CHỐNG OXY HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

...

...

...

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV để xác định hàm lượng chất phenol chống oxy hóa trong sản phẩm dầu, mỡ động vật và thực vật.

Giới hạn định lượng của phương pháp đối với propyl gallate [PG], 2,4,5-trihydroxybutyrophenone [THBP], tert-butylhydroquinone [TBHQ], axit nordihydroguaiaretic [NDGA], 2- và 3-terf-butyl-4-hydroxyanisole [BHA], 2,6-di-tert-butyl-4-hydroxymethylphenol [lonox-100], 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene [BHT] là từ 20 µg/g đến 200 µg/g trong dầu, mỡ, từ 10 µg/g đến 100 µg/g trong dầu bơ và đối với octyl gallate [OG], dodecyl gallate [DG] là từ 10 µg/g đến 100 µg/g trong dầu bơ.

2  Nguyên tắc

Các chất chống oxy hóa được chiết bằng axetonitril. Dịch chiết được cô đặc và hòa lại bằng 2-propanol. Các chất chống oxy hóa được tách bởi hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV tại bước sóng 280 nm.

3  Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng là nước đã loại ion, được lọc qua màng lọc 0,45 µm (4.11) hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Axetonitril (CH₃CN).

3.2  Metanol (CH₃OH).

...

...

...

3.4  2-Propanol ((CH₃)₂CHOH).

3.5  Axitaxetic (CH₃COOH).

3.6  Dung môi pha loãng, hỗn hợp của 2-propanol (3.4) và axetonitril (3.1) (1:1 phần thể tích).

3.7  Dung môi chiết

3.7.1  Hexan bão hòa axetonitril

Bão hòa 300 ml hexan (3.3) trong phễu chiết bằng cách thêm axetonitril (3.1) cho đến khi 2 lớp phân biệt rõ sau khi lắc 2 min. Loại bỏ lớp axetonitril phía dưới.

3.7.2  Axetonitril bão hòa hexan

Bão hòa 300 ml axetonitril (3.1) trong phễu chiết bằng cách thêm hexan (3.3) cho đến khi 2 lớp phân biệt rõ sau khi lắc 2 min. Loại bỏ lớp hexan phía trên.

3.8  Pha động

...

...

...

Kênh B: Axetonitril (3.1) - metanol (3.2) (1:1 thể tích) trộn kỹ, loại khí.

3.9  Chất chuẩn BHA (hỗn hợp 2- và 3-BHA), BHT, TBHQ, lonox-100, THBP và PG; NDGA, OG, và DG, độ tinh khiết ≥ 97 % (khối lượng)

3.10  Dung dịch chuẩn

CHÚ THÍCH: TBHQ rất dễ bị oxy hóa, đặc biệt dưới ánh sáng. Bảo quản lạnh tất cả dung dịch chất chống oxy hóa và tránh ánh sáng trực tiếp. Kiểm tra tín hiệu của TBHQ thông qua PG hoặc THBP và chuẩn bị mới nếu tín hiệu giảm trên 5 %.

3.10.1  Dung dịch chuẩn gốc, 1 mg/ml

Cân khoảng 50 mg mỗi chất chống oxy hóa (3.9), chính xác đến 0,1 mg, và chuyển vào các bình định mức 50 ml (4.7) riêng biệt. Hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi pha loãng (3.6), trộn kỹ.

3.10.2  Dung dịch chuẩn làm việc, 0,01 mg/ml (10 µg/ml)

Dùng pipet hút chính xác 1 ml mỗi loại dung dịch chuẩn gốc (3.10.1) chuyển vào bình định mức 100 ml (4.7), pha loãng đến vạch bằng dung môi pha loãng (3.6), trộn kỹ.

4  Thiết bị, dụng cụ

...

...

...

4.1  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm bộ loại khí dung môi, bơm gradient 2 kênh, bộ bơm mẫu có thể bơm 10 µl, detector UV tại bước sóng 280 nm. Điều kiện hoạt động: đầu dò có độ nhạy 0,05 AUFS, tốc độ dòng 2,0 ml/min và bộ phân tích dữ liệu.

4.2  Cột phân tích HPLC

Cột LC: cột nhồi C18 silica hoặc loại tương đương, có khả năng phân tách được tất cả 9 chất chống oxy hóa được thể hiện như trong Hình A.1. Xác nhận thời gian lưu của từng chất bằng cách bơm từng dung dịch chuẩn riêng rẽ, nếu cần.

Sử dụng cột bảo vệ, nếu cần.

CHÚ THÍCH: Các cột có chiều dài 150 mm với cỡ hạt nhồi nhỏ hơn (< 3,5 µm) cũng có thể cho độ phân giải tương đương.

4.3  Dụng cụ thủy tinh

Rửa sạch tất cả dụng cụ thủy tinh lần lượt bằng cloroform, axeton, metanol và thổi khô bằng khí nitơ.

4.4  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

4.5  Phễu chiết các loại có nắp, dung tích 125 ml, 250 ml.

...

...

...

4.7  Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml, 1 000 ml.

4.8  Cốc thủy tinh, dung tích 50 ml.

4.9  Máy lắc, tốt nhất là loại có thể xoay hoặc lắc đảo chiều.

4.10  Máy cô quay.

4.11  Màng lọc xyranh, làm bằng polyvinyliden florua (PVDF), đường kính 13 mm hoặc 25 mm, cỡ lỗ 0,45 µm.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng màng polypropylen (PP) ưa nước hoặc polytetrafloetylen (PTFE) nhưng không được dùng màng lọc nylon.

4.12  Ống đong chia vạch, có nắp bằng thủy tinh, dung tích 10 ml.

4.13  Lọ HPLC, phù hợp với bộ bơm mẫu của máy HPLC.

4.14  Pipet các loại, có thể phân phối chính xác 0,5 ml.

...

...

...

Việc lấy mẫu không được quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Chiết

Cân cốc thủy tinh 50 ml (4.8) cùng lượng mẫu thử thích hợp có chứa khoảng 5,5 g dầu lỏng hoặc dầu bơ hoặc 3,0 g mỡ lợn hoặc mỡ khác loại (hóa lỏng bằng cách sử dụng bể điều nhiệt tại 60 °C hoặc tủ sấy và lắc xoáy (4.9) hoặc lắc để đảm bảo đồng nhất), chính xác đến 0,01 g. Gạn nhiều nhất có thể phần mẫu thử vào phễu chiết 125 ml (4.5) có chứa 20 ml (22,5 ml đối với mỡ) hexan bão hòa (3.7.1). Cân lại cốc để xác định khối lượng mẫu thử. Lắc để trộn phần dung dịch thử với hexan và chiết ba lần, mỗi lần sử dụng 50 ml axetonitril bão hòa hexan (3.7.2). Nếu xuất hiện nhũ tương, giữ phễu chiết dưới vòi nước nóng 5 s đến 10 s. Gộp dịch chiết vào phễu chiết 250 ml (4.5) và cho dịch chiết chảy từ từ vào bình cầu đáy tròn 250 ml hoặc 500 ml (4.6) và loại bỏ các giọt dầu-hexan phía trên.

CHÚ THÍCH 1: Tại bước này, có thể bảo quản 150 ml dịch chiết axetonitril qua đêm trong tủ lạnh.

Cho bay hơi đến 3 ml đến 4 ml, sử dụng máy cô quay (4.10) với nhiệt độ bể ≤ 40 °C trong vòng 10 min.

CHÚ THÍCH 2: Thời gian cô quay dài có thể làm mất TBHQ. Để giảm thời gian cô quay, sử dụng nguồn chân không và hệ thống làm lạnh hiệu quả.

CHÚ THÍCH 3: Sử dụng bình cầu 500 ml để giảm mất mát trong quá trình sử dụng chân không. Cần thêm để đảm bảo lượng chiết xuất đủ sau khi bay hơi dung môi.

...

...

...

CHÚ THÍCH 4: Việc chiết xuất kéo dài có thể làm mất TBHQ.

Đối với mẫu trắng thuốc thử: lấy 25 ml hexan bão hòa axetonitril (3.7.1) và thực hiện như mẫu thử, từ giai đoạn “…chiết ba lần, mỗi lần sử dụng 50 ml dung dịch axetonitril bão hòa hexan”.

6.2  Xác định

6.2.1  Điều kiện vận hành HPLC

Các điều kiện vận hành sau đây được coi là thích hợp:

- Detector: UV tại bước sóng 280 nm

- Thể tích mẫu bơm: 10 µl;

- Tốc độ dòng: 2 ml/min;

- Nhiệt độ lò cột: nhiệt độ phòng.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Các thông số về thể tích mẫu bơm, tốc độ dòng, nhiệt độ cột có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLC được sử dụng.

6.2.2  Tiến hành phân tích

Sử dụng bộ bơm mẫu (4.1), bơm 10 µl dung dịch chiết và rửa giải bằng chương trình gradient cho dung dịch chiết (6.2.1). Cứ trước và sau 3 lần đến 4 lần bơm dung dịch thử, hoặc thường xuyên hơn nếu chiều cao pic của các dung dịch chuẩn sai khác > 5 %, bơm 10 µl dung dịch chuẩn làm việc (3.10.2) và rửa giải bằng chương trình gradient cho dung dịch chuẩn (xem 6.2.1). Đối với những pic có độ lớn nằm ngoài thang đo hoặc lớn hơn 3 lần chuẩn, pha loãng dịch chiết mẫu thử bằng dung môi pha loãng (3.6) và bơm lại. Xác định pic bằng so sánh với thời gian lưu của chất chuẩn.

Bơm 10 µl dung dịch chiết mẫu trắng thuốc thử và rửa giải bằng chương trình gradient cho dung dịch mẫu thử. Mẫu trắng thuốc thử phải không có pic tạp nào ảnh hưởng đến các chất chống oxy hóa được phân tích.

Sử dụng chiều cao pic được tính toán bởi hệ thống, hoặc đo chiều cao pic đến 0,1 mm, sử dụng sắc ký đồ mẫu trắng gradient để làm đường nền cơ sở. Xác định chiều cao pic chất chống oxy hóa và trung bình chiều cao pic chất chuẩn (cho bơm lặp trước và sau khi bơm dịch thử, hiệu chỉnh bằng mẫu trắng gradient).

7  Tính kết quả

Tính hàm lượng mỗi chất chống oxy hóa, X, biểu thị bằng microgam trên gam (µg/g), theo công thức sau:

Trong đó:

...

...

...

w là khối lượng của phần mẫu thử trong 10 ml dịch thử trước khi pha loãng, tính bằng gam trên mililit (g/ml);

C_s là nồng độ chất chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);

D là hệ số pha loãng nếu dung dịch bơm được pha loãng.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

...

...

...

f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bằng phương pháp sắc ký

Hình A.1 - Sắc ký đồ các dung dịch chuẩn chất chống oxy hóa (khoảng 0,1 µg mỗi chất) 1, PG; 2, THBP; 3, TBHQ; 4, NDGA; 5, BHA; 6, lonox-100; 7, OG; 8, BHT; 9, DG.

Phụ lục B

...

...

...

Kết quả thử nghiệm liên phòng

Bảng B.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng xác định chất chống oxy hóa trong dầu bằng phương pháp sắc ký

Hoạt chất^a

Trung bình, mg/g thu hồi

Độ lặp lại

Độ tái lập

Lượng thêm^b

Thu hồi

%

...

...

...

RSD_r, %

s_R

RSD_R, %

PG

193,7

184

95,2

16,0

8,66

...

...

...

8,66

PG

96,7

93,8

96,9

4,50

4,80

4,50

4,80

...

...

...

19,4

17,6

90,9

2,01

11,5

2,52

14,3

THBP^c

203,2

...

...

...

98,1

9,99

5,01

9,99

5,01

THBP

101,6

99,1

97,5

...

...

...

5,30

5,58

5,63

THBP

20,3

19,6

96,7

0,97

4,94

...

...

...

7,77

TBHQ

196,1

201

103

8,77

4,36

22,8

11,4

...

...

...

98,1

100

102

3,63

3,63

21,5

21,5

TBHQ

19,6

...

...

...

97,5

1,50

7,85

3,17

16,6

NDGA

93,8

91,7

97,8

...

...

...

5,51

6,39

6,97

NDGA

18,8

18,4

98,3

0,34

1,83

...

...

...

3,24

BHA

198,5

197

99,1

6,54

3,32

6,61

3,36

...

...

...

99,2

99,7

101

5,43

5,45

6,15

6,17

BHA

19,9

...

...

...

98,0

0,43

2,19

0,76

3,92

IONOX-100

208,2

198

95,3

...

...

...

8,92

19,4

9,76

IONOX-100

104,1

98,7

94,8

10,2

10,4

...

...

...

10,6

IONOX-100^d

20,8

20,2

97,0

0,71

3,54

1,14

5,63

...

...

...

202,9

170

83,8

3,50

2,06

4,54

2,67

BHT^d

101,5

...

...

...

83,1

2,36

2,80

2,36

2,80

BHT

20,3

17,2

85,1

...

...

...

5,22

1,06

6,18

^a PG = propyl gallate, THBP = 2,4,5-trihydroxybutyrophenone, TBHQ = tert-butylhydroquinone, NDGA = nordihydroguaiaretic axit, BHA = 2- và 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole, lonox-100 = 2,6-di-tert-butyl-4-hydroxymethylphenol, BHT = 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene.

^b Các giá trị được xác định đến 4 số có nghĩa, nhưng làm tròn đến gần 0.1 µg/g.

^c 2 trong 7 phòng thử nghiệm bị loại bỏ kết quả theo thử nghiệm kép Grubbs.

^d 1 trong 7 phòng thử nghiệm bị loại bỏ kết quả theo thử nghiệm đơn Grubbs.

s_r là độ lệch chuẩn lặp lại;

s_R là độ lệch chuẩn tái lập;

...

...

...

RSD_R là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

Bảng B.2 - Kết quả thử nghiệm liên phòng xác định chất chống oxy hóa trong mỡ bằng phương pháp sắc ký

Hoạt chất^a

Trung bình, mg/g thu hồi

Độ lặp lại

Độ tái lập

Lượng thêm^b

Thu hồi

%

...

...

...

RSD_r, %

s_R

RSD_R, %

PG

96,9

90,1

93,0

3,18

3,53

...

...

...

3,53

PG

38,7

34,6

89,4

1,55

4,48

1,55

4,48

...

...

...

101,6

97,9

96,4

6,75

6,89

14,3

14,6

THBP^c

40,7

...

...

...

89,5

1,35

3,71

1,47

4,06

TBHQ

98,1

95,6

97,5

...

...

...

8,07

22,1

23,2

TBHQ

39,3

35,0

89,0

6,04

17,3

...

...

...

33,2

NDGA

93,8

87,8

93,6

2,65

3,02

4,74

5,40

...

...

...

37,5

35,3

94,2

1,06

3,01

1,79

5,06

BHA

99,2

...

...

...

98,2

2,49

2,56

3,72

3,82

BHA

39,7

38,3

96,6

...

...

...

4,97

1,90

4,97

IONOX-100

104,1

99,3

95,4

4,83

4,87

...

...

...

5,49

IONOX-100

41,7

40,7

97,7

3,49

8,56

4,90

12,0

...

...

...

101,5

87,9

86,6

4,63

5,27

4,90

5,58

BHT

40,6

...

...

...

85,2

1,11

3,22

1,17

3,39

^a PG = propyl gallate, THBP = 2,4,5-trihydroxybutyrophenone, TBHQ = tert-butylhydroquinone, NDGA = axit nordihydroguaiaretic, BHA = 2- và 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole, lonox-100 = 2,6-di-tert-butyl-4-hydroxymethylphenol, BHT = 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene.

^b Các giá trị được xác định đến 4 số có nghĩa, nhưng làm tròn đến gần 0,1 µg/g.

^c 1 trong 7 phòng thử nghiệm bị loại bỏ kết quả theo thử nghiệm đơn Grubbs.

s_r là độ lệch chuẩn lặp lại;

...

...

...

RSD_r là độ lệch chuẩn tương đối lặp lại;

RSD_R là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

Bảng B.3 - Kết quả thử nghiệm liên phòng xác định chất chống oxy hóa trong dầu bơ bằng phương pháp sắc ký

Hoạt chất^a

Trung bình, mg/g thu hồi

Độ lặp lại

Độ tái lập

Lượng thêm^b

Thu hồi

...

...

...

s_r

RSD_r, %

s_R

RSD_R, %

PG

92,1

89,3

97,0

4,76

...

...

...

6,08

6,81

PG

46,0

46,9

102

3,86

8,23

4,54

...

...

...

PG

9,20

9,53

104

0,45

4,72

0,875

9,17

THBP

...

...

...

82,3

94,6

5,34

6,48

11,2

13,6

THBP

43,6

42,8

...

...

...

3,77

8,81

6,68

15,6

THBP

8,69

8,7

101

1,39

...

...

...

2,00

22,9

TBHQ

105,9

111

105

10,9

9,78

24,3

...

...

...

TBHQ

52,8

51,8

98,2

2,01

3,87

11,0

21,2

TBHQ

...

...

...

11,3

107

1,55

13,8

3,82

34,0

NDGA^c

96,5

93,0

...

...

...

6,27

6,74

6,27

6,74

NDGA

48,3

47,0

97,3

3,22

...

...

...

4,66

9,91

NDGA

9,63

8,9

92,5

2,11

23,7

2,39

...

...

...

BHA

101,3

96,3

95,2

8,49

8,81

8,49

8,81

BHA

...

...

...

48,8

96,5

2,29

4,70

2,50

5,12

BHA

10,1

10,2

...

...

...

0,515

5,06

0,597

5,87

IONOX-100

105,7

103

97,4

4,79

...

...

...

7,52

7,31

IONOX-100

52,9

50,2

94,9

3,77

7,51

4,13

...

...

...

IONOX-100

10,6

9,36

88,6

1,22

13,0

1,25

13,4

OG

...

...

...

86,3

96,8

3,80

4,40

4,37

5,06

OG

43,7

42,0

...

...

...

2,89

6,87

2,89

6,87

OG

8,76

8,19

93,5

1,69

...

...

...

1,69

20,6

BHT

96,5

76,7

79,4

9,16

12,0

9,51

...

...

...

BHT^c

48,4

38,8

80,2

2,58

6,64

3,16

8,12

BHT^d

...

...

...

7,47

77,4

0,443

5,94

1,03

13,8

DG

101,1

96,7

...

...

...

4,02

4,16

7,94

8,21

DG

50,6

48,8

96,5

2,98

...

...

...

3,05

6,24

DG

10,1

9,76

96,4

0,468

4,80

0,742

...

...

...

^a PG = propyl gallate, THBP = 2,4,5-trihydroxybutyrophenone, TBHQ = tert-butylhydroquinone, NDGA = axit nordihydroguaiaretic, BHA = 2- và 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole, lonox-100 = 2,6-di-tert-butyl-4-hydroxymethylphenol, BHT = 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene.

^b Các giá trị được xác định đến 4 số có nghĩa, nhưng làm tròn đến gần 0,1 µg/g.

^c 2 trong 9 phòng thử nghiệm bị loại bỏ kết quả theo thử nghiệm kép Grubbs.

^d 2 trong 9 phòng thử nghiệm bị loại bỏ kết quả theo thử nghiệm Cochran sau đó là thử nghiệm đơn Grubbs.

s_r là độ lệch chuẩn lặp lại;

s_R là độ lệch chuẩn tái lập;

RSD_r là độ lệch chuẩn tương đối lặp lại;

RSD_R là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.