TCVN-8400-58-2026-Benh-dong-vat-Quy-trinh-chan-doan-Phan-58-Benh-viem-da-noi-cuc

• Số hiệu: TCVN8400-58:2026
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2026

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-58:2026

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 58: BỆNH VIÊM DA NỔI CỤC Ở TRÂU, BÒ

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 58: Lumpy Skin Disease

Lời nói đầu

TCVN 8400-58:2026 do Trung tâm Chẩn đoán và Xét nghiệm thú ý Trung ương I - Cục Chăn nuôi và Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

- TCVN 8400-1:2019, Phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2:2010, Phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

...

...

...

- TCVN 8400-4:2010, Phần 4: Bệnh Niu cát xơn;

- TCVN 8400-5:2011, Phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6:2011, Phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7:2011, Phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8:2011, Phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9:2011, Phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10:2022, Phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11:2019 Phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12:2011, Phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

...

...

...

- TCVN 8400-14:2011, Phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15:2019, Phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16:2011, Phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. coli;

- TCVN 8400-17:2011, Phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18:2014, Phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19:2014, Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20:2014, Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21:2014, Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22:2014 Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

...

...

...

- TCVN 8400-24:2014, Phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TGVN 8400-25:2014, Phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26:2014, Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27:2014, Phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28:2014, Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29:2015, Phần 29: Bệnh lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30:2015, Phần 30: Bệnh marek ở gà;

- TCVN 8400-31:2015, Phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32:2015, Phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

...

...

...

- TCVN 8400-34:2015, Phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35:2015, Phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

-TCVN 8400-36:2015, Phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

- TCVN 8400-37:2015, Phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38:2015, Phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus;

- TCVN 8400-39:2016, Phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40:2016, Phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Reimerella anatipestifer gây ra;

-TCVN 8400-41:2019, Phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi;

- TCVN 8400-42:2019, Phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại;

...

...

...

- TCVN 8400-44:2019, Phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45:2019, Phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46:2019, Phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47:2019, Phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

- TCVN 8400-48:2020, Phần 48: Bệnh tiêu chảy có màng nhày do vi rút ở bò;

- TCVN 8400-49:2020, Phần 49: Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-50: 2020, Phần 50: Bệnh viêm não Nhật Bản;

- TCVN 8400-51:2020, Phần 51: Bệnh viêm phổi, màng phổi truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-52:2022, Phần 52: Bệnh nhiệt thán ở gia súc;

...

...

...

- TCVN 8400-54:2022, Phần 54: Bệnh tỵ thư ở gia súc;

- TCVN 8400-55:2022, Phần 55: Bệnh u nhày ở thỏ;

- TCVN 8400-56:2023, Phần 56: Bệnh tụ huyết trùng ở lợn, trâu, bò, gia cầm;

- TCVN 8400-57:2024, Phần 57: Bệnh glasser ở lợn;

- TCVN 8400-58:2026, Phần 58: Bệnh viêm da nổi cục ở trâu, bò;

- TCVN 8400-59:2026, Phần 59: Bệnh cúm gia cầm A/H9N2;

- TCVN 8400-60:2026, Phần 60: Bệnh rụt mỏ ở thủy cầm;

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 58: BỆNH VIÊM DA NỔI CỤC Ở TRÂU, BÒ

...

...

...

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khà năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn này.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh viêm da nổi cục (VDNC) ở trâu, bò do vi rút Capripox gây ra.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

- TCVN 8402:2010 Bệnh động vật - Quy trình mổ khám.

3  Thuật ngữ và định nghĩa, các từ viết tắt

3.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

...

...

...

- Bệnh viêm da nỗi cục ở trâu, bò (VDNC) là bệnh truyền nhiễm ở trâu, bò do vi rút Capripox (CaPV) gây ra. Bệnh có tính đặc hiệu loài và không lây sang dê, cừu.

- Vi rút gây bệnh là một ADN vi rút thuộc chi Capripoxvirus (CaPV), phân họ Chordopoxviridae, hộ Poxviridae.

3.2  Từ viết tắt

- ADN (Acid deoxyribonucleic): Axit deoxyribonucleic;

- ARN (Acid ribonucleic): Axit ribonucleic;

- CPE (Cytopathic effect): Biến đổi bệnh lý tế bào;

- Ct (Cycle threshold): Chu kỳ ngưỡng;

- DMEIVI (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium): Môi trường nuôi cấy tể bào DMEM;

- DNase (Deoxyribonuclease): Enzyme thủy phân liên kết của phân tử axit Deoxyribonucleic;

...

...

...

- FBS (Fetal bovine serum): Huyết thanh thai bê;

- GTPV (Goat pox virus): Vi rút gây bệnh đậu dê;

- LSDV (Lumpy skin disease virus): Vi rút gây bệnh viêm da nổi cục;

- LT (Lamb testis): Tế bào tinh hoàn cừu;

- MDBK (Madin-Darby bovine kidney): Tế bào thận bò;

- PBS (Phosphate Buffered Saline): Dung dịch muối đệm phốt phát;

- Real-time PCR (Real-time polymerase chain reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực;

- RNase (Ribonuclease): Enzyme thủy phân liên kết của phân tử axit ribonucleic;

- SPPV (Sheep pox virus): Vi rút gây bệnh đậu cừu;

...

...

...

- VDNC: Bệnh viêm da nổi cục;

- VNT (Virus Neutralization test): Phản ứng trung hòa vi rút;

4  Thuốc thử, vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, không có DNase/RNase, trừ các trường hợp có quy định khác.

4.1  Nguyên liệu, vật liệu thử sử dụng chung

4.1.1  Ethanol, từ 70 % (v/v) đến tuyệt đối.

4.1.2  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,4 ± 0,2 (xem A2, Phụ lục A).

4.1.3  Dung dịch kháng sinh, bao gồm các loại penicillin, kanamycin, streptomycin,...(xem A.1, Phụ lục A).

4.1.4  Nước cất hoặc nước khử khoáng hoặc nước tinh khiết, không có DNase/RNase.

...

...

...

4.2.1  Kít tách chiết ADN vi rút.

4.2.2  Kít nhân gen.

4.2.3  Cặp mồi và mẫu dò cho phương pháp real-time PCR phát hiện vi rút Capripox;

4.2.4  Cặp mồi Snapback cho phương pháp real-time PCR phát hiện vi rút VDNC và phân biệt các vi rút Capripox.

4.2.5  Mẫu dương chuẩn cho phương pháp real-time PCR

Mẫu dương chuẩn vi rút gây bệnh VDNC, vi rút gây bệnh đậu dê, vi rút gây bệnh đậu cừu được chứng nhận dương tính hoặc kháng nguyên vi rút thực địa hoặc ADN chuẩn dương tính tách chiết từ vi rút gây bệnh VDNC, bệnh đậu dê, bệnh đậu cừu có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) đã biết trước.

4.3  Thuốc thử, vật liệu thử dùng cho phương pháp phân lập vi rút, trung hòa vi rút trên tế bào và ELISA.

4.3.1  Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (xem A3, Phụ lục A).

4.3.2  Dung dịch Trypsin 0,05 % EDTA (Ethylene diamine tetra-acetic acid).

...

...

...

4.3.4  MDBK (Madin-darby bovine kidney): Tế bào thận bò.

4.3.5  LT (Lamb testis): Tế bào tinh hoàn cừu.

4.3.6  Huyết thanh dương chuẩn.

4.3.7  Huyết thanh âm chuẩn.

4.3.8  Kít ELISA phát hiện kháng thể VDNC.

4.3.9.  HEPES.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

5.1  Thiết bị, dụng cụ dùng chung

...

...

...

5.1.2  Bơm tiêm, dung tích 1 ml, 5 ml.

5.1.3  Ống ly tâm, dung tích 0,5 ml, 1,5 - 2 ml, 15 ml, 50 ml.

5.1.4  Dụng cụ bảo hộ: khẩu trang, găng tay, áo bảo hộ, kính

5.1.5  Tủ an toàn sinh học cấp II

5.1.6  Nồi hấp ướt

5.1.7  Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C

5.1.8  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C

5.2  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp real-time PCR

5.2.1  Ống nghiền mẫu.

...

...

...

5.2.3  Máy nghiền mẫu.

5.2.4  Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1 500 g đến 2 500 g, 10 000 g, 12 000 g.

5.2.5  Máy tách chiết ADN/ARN.

5.2.6  Máy ủ nhiệt, nhiệt độ từ 37 °C đến 100 °C.

5.2.7  Máy real-time PCR.

5.2.8  Ống PCR, 0,1 ml đến 0,2 ml, không chứa DNase/RNase.

5.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp phân lập vi rút, trung hòa vi rút và ELISA

5.3.1  Tủ ấm CO2.

5.3.2  Đĩa nuôi tế bào 96 giếng.

...

...

...

5.3.4  Kính hiển vi soi ngược.

5.3.5  Buồng đếm tế bào.

5.3.6  Máy đọc đĩa ELISA.

5.3.7  Màng lọc vô trùng, cỡ lỗ 0,45 nm.

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Dịch tễ học

- Bệnh VDNC là bệnh truyền nhiễm do vi rút gây ra ở trâu, bò, đặc trưng bởi các nốt sần trên da. Bệnh có tính đặc hiệu loài và không lây sang dê, cừu. Thời gian ủ bệnh thường khoảng 1 đến 4 tuần. Các đợt bùng phát bệnh VDNC thường không liên tục và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như sự di chuyển của động vật, tình trạng miễn dịch, điều kiện thời tiết (gió, mưa) ảnh hưởng đến các loài véc tơ truyền bệnh. Sự lây truyền vi rút gây bệnh VDNC chủ yếu do các véc tơ động vật chân đốt khác nhau.

- Trâu, bò mắc bệnh VDNC có đặc trưng sốt cao, nổi u cục trên da, niêm mạc và các cơ quan nội tạng; các hạch bạch huyết nông nổi to, da phù nề. Bệnh có tỷ lệ mắc bệnh thường từ 10 % đến 20 % nhưng ở một số khu vực có thể lên tới 80 % - 90 % và tỷ lệ chết được báo cáo khoảng: 10 % - 40 %. Bệnh gây thiệt hại kinh tế đáng kể do gia súc mắc bệnh suy nhược kéo dài, phát triển chậm, giảm sản lượng sữa và thịt, tổn thương da và vô sinh ở bò đực, vô sinh và sảy thai ở bò cái.

- Vi rút gây bệnh viêm da nổi cục tồn tại lâu trong môi trường, đặc biệt là ở dạng vảy khô. Trong các nốt da hoại tử, vi rút có thể tồn tại đến 33 ngày hoặc lâu hơn, trong lớp vảy khô tồn tại tối đa 35 ngày.

...

...

...

- Thời gian ủ bệnh ở điều kiện gây nhiễm thử nghiệm từ 6 ngày đến 9 ngày, sau đó động vật bị nhiễm bắt đầu sốt, có thể trên 41 °C kéo dài trong 1 tuần. Thời điểm này tất cả các hạch bạch huyết bề mặt đều to ra. Các nốt sần xuất hiện từ 7 ngày đến 19 ngày sau khi nhiễm vi rút.

- Các nốt sần trên da, niêm mạc nhiều, có giới hạn rõ ràng, đường kính 0,5 đến 5 cm, nốt sần chắc, có đỉnh phẳng thường thấy ở đầu, cổ, bầu vú, mông.

- Chân của trâu, bò nhiễm bệnh bị phù nề, khiến con vật không muốn di chuyển.

- Bệnh gây sảy thai cho trâu, bò đang mang thai; ở trâu, bò đang cho con bú có sự giảm lượng sữa rõ rệt, bò đực nhiễm bệnh có thể vô sinh tạm thời hoặc vĩnh viễn, vi rút bài tiết qua tinh dịch trong thời gian dài.

- Quá trình phục hồi sau nhiễm bệnh diễn ra chậm, con vật gầy còm, có thể bị viêm phổi và viêm vú, có các nốt hoại tử trên da, gây ảnh hưởng kinh tế nghiêm trọng.

- Mức độ nghiêm trọng của các dấu hiệu lâm sàng bệnh VDNC khác nhau phụ thuộc vào một số yếu tố như chủng vi rút, tuổi, tình trạng miễn dịch, giống, loài của vật mắc bệnh.

Về triệu chứng lâm sàng cần chẩn đoán phân biệt bệnh VDNC với bệnh đậu dê, đậu cừu.

- Bệnh VDNC: trâu bò mắc bệnh có các nốt sần chắc và có đường kính 0,5 cm đến 5 cm, có thể hoại tử, lõm ở giữa. Các nốt sần phân bố toàn thân trên da cổ, ngực, mông, chân và bộ phận sinh dục.

- Bệnh đậu dê, đậu cừu: các mụn là mụn nước, mụn mủ, vảy. Các nốt mụn thường tập trung ở vúng ít lông như quanh miệng, mũi, mắt, bẹn, vú và trong niêm mạc miệng.

...

...

...

- Bệnh tích đặc trưng là nổi cục trên da. Các nốt sần có thể nhiều ở niêm mạc của miệng và đường tiêu hóa, đặc biệt ở dạ múi khế, khí quản và phổi, dẫn đến các bệnh thứ phát như viêm phổi.

- Các nốt sần trên niêm mạc mắt, mũi, miệng, trực tràng, bầu vú và cơ quan sinh dục nhanh chóng loét. Cùng với sự xuất hiện của các nốt sần, dịch tiết ra từ mắt và mũi trở thành mủ nhầy. Khi đó tất cả dịch tiết, nước mắt, nước mũi và nước bọt đều chứa vi rút VDNC.

- Các nốt u cục trên da ở lớp hạ bì và lớp biểu bì, có thể lan đến lớp dưới da và đôi khi đến cơ vân liền kề. Các tổn thương ở da bao gồm hoại tử, phù nề, huyết khối, viêm bạch huyết và thâm nhiễm viêm hỗn hợp. Các tổn thương mãn tính là đặc trưng bởi mô nhồi máu với lỗ hoại tử, thường được bao bọc bởi mô hạt dần được thay thế bằng xơ hóa trưởng thành.

7  Chẩn đoán trong phòng thử nghiệm

Để chẩn đoán phát hiện bệnh viêm da nổi cục ở trâu, bò thực hiện theo Sơ đồ chẩn đoán bệnh VDNC (tham khảo Phụ lục E).

7.1  Lấy mẫu, bảo quản và xử lý mẫu

7.1.1  Lấy mẫu

- Lấy mẫu theo hướng dẫn của quy trình mổ khám theo TCVN 8402:2010.

- Mẫu xét nghiệm gồm tổ chức da nổi u cục, nốt vảy hoặc dịch nốt sần, dịch nhầy mũi, nước bọt (mẫu probang), máu chống đông (bằng EDTA), huyết thanh. Đối với động vật chết có thể lấy hạch bạch huyết và phủ tạng (hạch lympho, hạch amidan, lách, thận, phổi, gan) để phát hiện vi rút VDNC.

...

...

...

- Dùng tăm bông, bông thấm, hút dịch nốt sần, nước bọt, dịch nhày mũi cho vào ống ly tâm 15 ml (5.1.3) có chứa dung dịch bảo quản mẫu (dung dịch PBS) (4.1.2).

- Mẫu huyết thanh để phát hiện kháng thể viêm da nỗi cục: sử dụng bơm tiêm 5 ml (5.1.2) để lấy 2 ml máu, rút cán bơm tiêm tới mức cao nhất để tạo nhiều, khoảng trống bên trong, đặt bơm tiêm nằm nghiêng 5° ở nhiệt độ 20 °C đến 30 °C trong thời gian 30 phút để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh.

7.1.2  Bảo quản mẫu

- Tất cả các mẫu bệnh phẩm (xem 7.1.1) phải được dán nhãn, có ký hiệu phù hợp và kèm theo các thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh (nếu mổ khám).

- Các mẫu bệnh phẩm (xem 7.1.1) được bảo quản trong túi nylon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thử nghiệm sớm nhất (≤ 48 giờ) bằng phương tiện vận chuyển đảm bảo không ảnh hưởng đến chất lượng mẫu và kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm.

- Đối với mẫu mô để phân lập vi rút và phát hiện vi rút, nếu trường hợp mẫu vận chuyển trên quãng đường dài không bảo quản lạnh thì môi trường bảo quản cần bổ sung 10 % glycerol.

- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C (5.1.7) tối đa trong 7 ngày.

- Mẫu bệnh phẩm lưu trong thời gian dài cần được bảo quản ở nhiệt độ âm 80 °C (5.1.8).

7.1.3  Xử lý mẫu

...

...

...

- Mẫu dịch nốt sần, nước bọt, dịch nhày mũi trong dung dịch bảo quản được được lắc đều (5.2.2) và ly tâm (5.2.4) ở gia tốc 2 500 g trong 15 phút và thu phần dịch trong ở phía trên vào ống ly tâm 2 ml (5.1.3).

- Mẫu huyết thanh: sau khi lấy máu của trâu, bò vào bơm tiêm 5 ml (5.1.2), rút hết cán bơm tiêm tạo khoảng trống, để ở nhiệt độ phòng, sau đó tách lấy huyết thanh chuyển sang ống ly tâm 2 ml (5.1.3).

- Mẫu máu chống đông (bằng EDTA) được chuyển sang ống ly tâm 2 ml (5.1.3).

- Mẫu sau khi được xử lý được bảo quản và dùng để tách chiết ADN.

- Mẫu huyết thanh dùng trong phản ứng trung hòa phải được bất hoạt ở 56 °C (5.2.6) trong 30 phút. Sau khi bất hoạt, để huyết thanh ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C (5.1.7). Nếu mẫu đã bất hoạt thì không cần bất hoạt lại.

7.2  Phát hiện vi rút

7.2.1  Phương pháp real-time PCR

Để phát hiện vi rút VDNC bằng phương pháp real-time PCR gồm 2 bước sau:

- Bước 1: Sàng lọc vi rút Capripox bằng phương pháp real-time PCR sử dụng cặp mồi CaPV074 trên gen ORF074 mã hóa protein P32.

...

...

...

7.2.1.1  Tách chiết ADN

- Sau khi xử lý mẫu, tiến hành chiết tách ADN từ các dịch bệnh phẩm bằng kít tách chiết ADN/ARN theo hướng dẫn của nhà sản xuất (tham khảo phụ lục B). ADN thu được sau khi chiết tách dùng làm mẫu xét nghiệm.

- Mẫu ADN đã chiết tách lưu ở nhiệt độ âm 20 °C (5.1.8) và sử dụng cho phương pháp real-time PCR.

7.2.1.2  Phương pháp real-time PCR phát hiện vi rút Capripox

Phản ứng real-time PCR được sử dụng để phát hiện sự có mặt của các vi rút thuộc giống Capripoxvirus bao gồm vi rút VDNC (LSDV), vi rút đậu cừu (SPPV), vi rút đậu dê (GTPV) bằng cặp mồi CaPV074 (tham khảo Bảng C1, Phụ lục C) được thực hiện như sau:

Tiến hành phản ứng

- Chuẩn bị các cặp mồi xuôi/ ngược (với nồng độ 20 µM) và mẫu dò (với nồng độ 6 µM) (tham khảo Bảng C2, phụ lục C) với nước tinh khiết không chứa DNase/RNase (4.1.4).

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng (tham khảo Bảng C2, Phụ lục C).

+ Cho 20 µl hỗn hợp phản ứng vào ống PCR (5.2.8).

...

...

...

+ Cho 5 µl nước tinh khiết (4.1.4) vào ống PCR đối chứng âm.

+ Cho 5 µl ADN của mẫu đã tách chiết vào ống PCR.

- Cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng real-time PCR (tham khảo Bảng C3, Phụ lục C).

- Đặt ống PCR (5.2.8) chứa hỗn hợp phản ứng vào máy real-time PCR (5.2.7) và chạy máy theo chương trình đã cài đặt.

Đọc kết quả

Kết quả của phản ứng real-time PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: ct).

- Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) cho kết quả dương tính, có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2), mẫu đối chứng âm tính không có giá trị Ct.

+ Nếu một trong số mẫu đối chứng không đạt yêu cầu thì phải thực hiện lại xét nghiệm.

- Với điều kiện phản ứng trên:

...

...

...

+ Mẫu không có giá trị Ct được coi là âm tính.

+ Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 40 < Ct ≤ 45 được coi là nghi ngờ. Những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

7.2.1.3  Phương pháp real-time PCR sử dụng cặp mồi Snapback phát hiện vi rút VDNC và phân biệt các vi rút Capripox

Phản ứng real-time PCR sử dụng cặp mồi Snapback để phát hiện và phân biệt sự có mặt của vi rút VDNC (LSDV) với các vi rút Capripox khác như vi rút đậu dê (GTPV), vi rút đậu cừu (SPPV) bằng việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu dựa trên vùng gen RPO30 của 3 vi rút trên và dựa vào sự khác nhau về điểm nhiệt độ nóng chảy Snapback và khuếch đại (tham khảo Bảng D1, Phụ lục D).

Tiến hành phản ứng

- Chuẩn bị các cặp mồi với nồng độ 5 µM (tham khảo bảng D2, phụ lục D) với nước tinh khiết không chứa DNase/RNase (4.1.4).

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng (tham khảo Bảng D2, Phụ lục D).

+ Cho 20 µl hỗn hợp phản ứng vào ống PCR (5.2.8).

+ Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi rút VDNC (4.2.5) có giá trị nhiệt độ nóng chảy đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương.

...

...

...

+ Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi rút đậu cừu (4.2.5) có giá trị nhiệt độ nóng chảy đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương.

+ Cho 5 µl nước tinh khiết (4.1.4) vào ống PCR đối chứng âm.

+ Cho 5 µl ADN của mẫu đã tách chiết vào ống PCR.

- Cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng real-time PCR trên máy real-time PCR (Biorad) (tham khảo Bảng D3, Phụ lục D).

- Đặt ống PCR (5.2.8) chứa hỗn hợp phản ứng vào máy real-time PCR (5.2.7) và chạy máy theo chương trình đã cài đặt.

Đọc kết quả:

- Điều kiện phản ứng được công nhận: Phản ứng được công nhận khi mẫu đối chứng dương cho kết quả dương tính khi có nhiệt độ nóng chảy (Snapback và khuếch đại) tương ứng với vi rút VDNC, vi rút đậu dê và vi rút đậu cừu; mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính.

+ Nếu một trong số mẫu đối chứng không đạt yêu cầu thì phải thực hiện lại xét nghiệm

Nhiệt độ nóng chảy (Snapback và khuếch đại) của các vi rút Capripox đối với máy CFX96™ real-time PCR (Biorad) như sau:

...

...

...

- VI rút đậu dê (GTPV): 58 °C, 72,5 °C

- Vi rút đậu cừu (SPPV): 52 °C, 72,5 °C

Với điều kiện phản ứng trên:

- Mẫu được coi là dương tính với vi rút gây bệnh VDNC (LSDV) khi có nhiệt độ nóng chảy (Snapback và khuếch đại) giống với đối chứng vi rút VDNC dương chuẩn là 51 °C, 73,5 °C;

- Mẫu được coi là dương tính với vi rút đậu dê (GTPV) khi có nhiệt độ nóng chảy (Snapback và khuếch đại) giống với đối chứng vi rút đậu dê dương chuẩn là 58 °C, 72,5 °C;

- Mẫu được coi là dương tính với vi rút đậu cừu (SPPV) khi có nhiệt độ nóng chảy (Snapback và khuếch đại) giống với đối chứng vi rút đậu cừu dương chuẩn là 52 °C, 72,5 °C;

- Mẫu không có nhiệt độ nóng chảy như đối chứng âm được coi là âm tính.

- Những mẫu nghi ngờ (nhiệt độ nóng chảy không giống với nhiệt độ nóng chảy của vi rút VDNC) cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

CHÚ THÍCH: Đối với các máy real-time PCR khác nhau có nhiệt độ nóng chảy khác nhau:

...

...

...

Vi rút VDNC (LSDV): 52,2 °C, 74,9 °C

Vi rút đậu dê (GTPV): 56,5 °C, 73,9 °C

Vi rút đậu cừu (SPPV): 52,6 °C, 73,9 °C

+ Đối với máy LightCycler 480 (Roche) nhiệt độ nóng chảy (Snapback và khuếch đại) của các vo rút Capripox như sau:

Vi rút VDNC (LSDV): 50,7 °C, 74,3 °C

Vi rút đậu dê (GTPV): 56 °C, 73,3 °C

Vi rút đậu cừu (SPPV): 51,4 °C, 73,3 °C

+ Đối với máy MimiOption™ Real-time PCR detection system (Biorad) nhiệt độ nóng chảy (Snapback và khuếch đại) của các vi rút Capripox như sau:

Vi rút VDNC (LSDV): 50,5 °C, 74 °C

...

...

...

Vi rút đậu cừu (SPPV): 51,5 0C, 73 °C

7.2.2  Phương pháp phân lập vi rút

Phương pháp phân lập vi rút có sử dụng vi rút sống, vì vậy phải tiến hành trong phòng thử nghiệm an toàn sinh học cấp III để hạn chế lây lan vi rút ra ngoài môi trường. Các bước tiến hành phải được thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp II (5.1.5).

Trong quá trình thực hiện, nhân viên phòng thử nghiệm cần sử dụng đầy đủ các trang thiết bị bảo hộ như quần áo, khẩu trang, găng tay, mũ... (5.1.4).

7.2.2.1  Chuẩn bị tế bào

- Tế bào MDBK (4.3.4) hoặc LT (4.3.5) được khôi phục từ ống tế bào gốc được cất giữ trong Ni tơ hoặc âm 80 °C và nuôi trong môi trường DMEM 5 % FBS (xem A3 phụ lục A) trong 48 giờ đến 72 giờ để phát triển 1 lớp tế bào đơn đạt 100 % bề mặt nuôi chai tế bào T75 (5.3.3).

- Hút bỏ môi trường đang nuôi trong chai tế bào 1 lớp.

- Rửa bề mặt thảm tế bào 2 lần. Mỗi lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) (4.1.2) vởi 10 ml/chai T75, sau đó hút bỏ PBS.

- Cho 2 ml trypsin (có 0,05 % EDTA) (4.3.2) ủ trong thời gian từ 5 đến 10 phút ở nhiệt độ 37 °C, 5 % CO₂ (5.3.1).

...

...

...

- Ly tâm tế bào ở gia tốc 1 500 g trong 5 phút bằng máy ly tâm (5.2.4) để loại bỏ môi trường chứa trypsin. Đổ bỏ hỗn dịch phía trên, giữ lại phần cặn là tế bào ở dưới.

- Cho tiếp 10 ml DMEM 5 % FBS (xem A3, Phụ lục A) vào phần tế bào, dùng pipet 5 ml (5.1.1) trộn đều bằng cách hút nhả vài lần.

- Đếm tế bào (5.3.5), thêm một lượng môi trường DMEM 5 % FBS sao cho đạt mật độ 2 x 10^5tế bào/ml môi trường nuôi tế bào và có bổ sung dung dịch kháng sinh (xem A3, Phụ lục A) để phát triển 1 lớp tế bào đơn và đạt 90 % đến 100 % diện tích bề mặt chai nuôi.

7.2.2.2  Gây nhiễm tế bào

- Lấy chai tế bào đã chuẩn bị (7.2.2.1), đổ bỏ môi trường nuôi và rửa 2 lần bằng dung dịch PBS (4.1.2).

-1 ml huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý (7.1.3) và lọc qua màng lọc vô trùng (5.3.7) được nhiễm vào chai tế bào một lớp đã chuẩn bị trong chai nuôi tế bào T75 (5.3.3) và để vi rút hấp phụ trong 1 giờ ở 37 °C, 5 % CO₂ (5.3.1).

- Sau đó, chai nuôi cấy được rửa bằng dung dịch PBS 1X (4.1.2) và bổ sung 10 ml môi trường GMEM (xem A4, Phụ lục A) có chửa khẳng sinh và 2 % FBS (Xem A4, Phụ lục A).

- Ủ chai tế bào ở 37 °C, 5 % C02 (5.3.1) và kiềm tra chai tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi (5.3.4) để quan sát biến đổi bệnh lý tế bào (CPE) trong 7 ngày đến 14 ngày.

7.2.2.3  Đọc kết quả

...

...

...

- Không có biến đổi bệnh lý tế bào (không có CPE): nếu khống có CPE vào ngày thứ 14 nuôi cấy, chai nuôi tế bào nuôi cấy được đông tan 3 lần và sau đó sẽ được nhiễm lần 2. Thụ dịch nuôi cấy tế bào vào ống ly tâm 50 ml (5.1.3), ly tâm lấy nước trong ở trên và tiến hành phân lập lần 2. Nếu sau 3 lần phân lập không có CPE, kết luận mẫu âm tính với vi rút VDNC.

7.3  Phát hiện kháng thể

7.3.1  Phương pháp ELISA.

Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA (4.3.8) phát hiện kháng thể kháng vi rút gây bệnh VDNC có bán sẵn trên thị trường. Thực hiện phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục G.

7.3.2  Phương pháp trung hòa vi rút trên môi trường tế bào

Phương pháp trung hòa có sử dụng vi rút sống nên phải tiến hành trong phòng thử nghiệm an toàn sinh học cấp III. Các bước tiến hành phải được thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp II (5.1.5).

Trong quá trình thực hiện, nhân viên phòng thử nghiệm cần sử dụng đầy đủ các trang thiết bị bảo hộ như quần áo, khẩu trang, găng tay, mũ... (5.1.4).

7.3.3.1  Nguyên lý

...

...

...

Nguyên lý của phương pháp trung hòa là huyết thanh được pha loãng ở các nồng độ khác nhau sau đó trung hòa với một lượng vi rút (100 TCID₅₀) hoặc có thể vi rút được pha loãng các nồng độ khác nhau sau đó trung hòa với một nồng độ huyết thanh thử nghiệm để tính chỉ số trung hòa. Do độ nhạy không ổn định của nuôi cấy vi rút Capripox và khỏ khăn trong việc chuẩn độ ngược (back tritration) của liều 100 TCID₅₀/giếng. Vì vậy phương pháp trung hòa theo cách pha loãng vi rút ở các nồng độ khác nhau sau đó trung hòa với một nồng độ kháng thể để tính chỉ số trung hòa được ưu tiên thực hiện trong hầu hết các phòng thử nghiệm.

7.3.3.2  Cách tiến hành

Các bước tiến hành phản ứng trung hòa tham khảo Phụ lục H.

8  Kết luận

Trâu, bò được xác định mắc bệnh VDNC khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh VDNC và có kết quả xét nghiệm vi rút VDNC dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:thuyvy

- Kết quả xét nghiệm vi rút gây bệnh VDNC dương tính bằng phương pháp real-time PCR.

- Phân lập được vi rút trên môi trường tế bào và giám định vi rút VDNC dương tính.

- Phát hiện kháng thể dương tính ở trâu, bò chưa tiêm phòng bằng phương pháp ELISA hoặc phương pháp trung hoà trên tế bào.

...

...

...

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Dung dịch kháng sinh đậm đặc

Thành phần:

Penicillin

10^θ IU

Streptomycin

1 g

Kanamycin

...

...

...

Nước cất

10 ml

Cách chuẩn bị:

Chuẩn bị các nguyên vật liệu theo lượng như trên, hòa tan các nguyên liệu trong 10 ml nước cất (4.1.4), lắc đều cho tan, lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.3.7). Sử dụng tốt nhất trong 1 tuần, bảo quản ở 4 °C đến 8 °C (5.1.7).

A.2  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) pH 7,4 ± 0,2

Thành phần

Natri choride (NaCl)

8g

Kali chloride (KCl)

...

...

...

Dinatri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

1,15 g

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)

0,2 g

Nước cất

1000 ml

Cách chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần trên vào trong 1 000 ml nước cất (4.1.4), lắc đều cho tới khi tan hoàn toàn. Điều chỉnh pH về khoáng 7,4 ± 0,2. Hấp ở 121 °C trong 15 phút (5.1.6), bảo quản ở 4 °C đến 8 °C (5.1.7). Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

Thành phần:

Môi trường DMEM (4.3.1)

470 ml

Huyết thanh bào thai bê (FBS) 5 % (4.3.3)

25 ml

Kháng sinh (4.1.3) (Penicillin/streptomycin: 10 000 Ul/ml)

5 ml

Cách chuẩn bị:

Bổ sung FBS (4.3.3) và dung dịch kháng sinh (4.1.3) với lượng như trên vào 470 ml môi trường DMEM (4.3.1), lắc đều cho tới khi dung dịch đồng nhất và bảo quản ở nhiệt độ 4 °C đến 8 °C (5.1.7). Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

...

...

...

Thành phần:

Môi trường DMEM (4.3.1)

485 ml

Huyết thanh thai bê (FBS) 2 % (4.3.3)

10 ml

Kháng sinh (4.1.3) (Penicillin/Streptomycin: 10 000 Ul/ml)

5 ml

Cách chuẩn bị:

Bổ sung FBS (4.3.3) và dung dịch kháng sinh (4.1.3) với lượng như trên vào 470 ml môi trường DMEM (4.3.1), lắc đều cho tới khi dung dịch đồng nhất và bảo quản ở nhiệt độ 4 °C đến 8 °C (5.1.7). Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

...

...

...

Thành phần:

Môi trường DMEM (4.3.1)

487,5 ml

HEPES 2 % (4.3.9)

12,5 ml

* Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C (5.1.7).

Cách chuẩn bị:

Bổ sung 12,5 ml dung dịch HEPES (4.3.9) vào trong 487,5 ml môi trường DMEM (4.3.1), lắc đều cho tới khi dung dịch đồng nhất và bảo quản ở nhiệt độ 4 °C đến 8 °C (5.1.7). Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

...

...

...

(Tham khảo)

Phương pháp chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít tách chiết ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít tách chiết khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thử nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít TACO DNA/RNA extraction kit (GeneReach Cat. No. Atc-d/ARN) hoặc kít Invitrogen PureLink Viral DNA/RNA Mini Kit (Cat. No. 12280-050) thì các bước thực hiện như sau:

B.1  Kít TACO DNA/RNA extraction kit (cat. No. Atc-d/RNA)1)

B.1.1  Chuẩn bị

- Pha dung dịch đệm rửa (Washing buffer A) với 135 ml cồn Ethanol tuyệt đối.

- Pha dung dịch đệm rửa (Washing buffer B) với 230 ml cồn Ethanol tuyệt đối.

B.1.2.  Cách tiến hành

Các bước thực hiện trên theo sơ đồ sau:

...

...

...

- Nhỏ 200 µl Ethanol tuyệt đối vào cột 1 (cột 7)

- Nhỏ 500 µl dung dịch Lysis buffer vào cột 1 (cột 7)

- Nhỏ 750 µl dung dịch đệm rửa Washing buffer A vào cột 2 (cột 8)

- Nhỏ 750 µl dung dịch đệm rửa Washing buffer A vào cột 3 (cột 9)

- Nhỏ 750 µl dung dịch đệm rửa Washing buffer B vào cột 4 (cột 10)

- Nhỏ 750 µl dung dịch đệm rửa Washing buffer B vào cột 5 (cột 11)

- Nhỏ 100 µl dung dịch Elution buffer vào cột 6 (cột 12)

- Nhỏ 50 µl dung dịch Magnet beads vào cột 2 (cột 8). Lắc đều dung dịch Magnet beads trước khi nhỏ.

- Cho 200 μl huyễn dịch mẫu sau khi ly tâm vào các giếng ở cột 1 hoặc cột 7.

...

...

...

- Đặt đĩa vào máy tách chiết (5.2.5) và cho máy chạy.

- Sau khi máy chạy xong, thu 100 μl ADN từ các giếng tại cột 6 hoặc 12 sang các ống ly tâm 1,7 ml (5.1.3) mới để tiến hành xét nghiệm.

B.2  Kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA mini kit (Cat. No. 12280-050)^2^)

B.2.1  Chuẩn bị

- Chuẩn bị dung dịch Carrier RNA: Nhỏ 310 µl nước tinh khiết vào ống Carrier RNA đông khô (310 µg Carrier RNA/ống).

- Chuẩn bị dung dịch Wash buffer (1X): Thêm 60 ml Ethanol tuyệt đối vào lọ dung dịch Wash buffer (5X).

B.2.2  Cách tiến hành

- Nhỏ 25 µl Proteinase K vào ống ly tâm 1,5 đến 2 ml (5.1.3).

- Nhỏ 200 µl huyễn dịch bệnh phẩm vào ống trên.

...

...

...

- Lắc ống trong 15 giây và ly tâm (5.2.4). Ủ ở 56 °C trong 15 phút (5.2.6) rồi ly tâm (5.2.4).

- Nhỏ 250 µl Ethanol tuyệt đối vào ống trên, lắc đều (5.2.2) trong 15 giây rồi ly tâm (5.2.4).

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

- Chuyển toàn bộ dịch trong ống (675 µl) vào cột lọc có ống thu.

- Ly tâm (5.2.4) cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 800 g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Chuyển cột lọc sang ống thu mới.

- Nhỏ 500 µl dung djch Wash buffer (1X), ly tâm (5.2.4) ở gia tốc 6 800 g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Chuyển cột lọc sang ống thu mới.

- Nhỏ 500 µl dung dịch Wash buffer (1X), ly tâm (5.2.4) ở gia tốc 6 800 g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

...

...

...

- Chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1,5 đến 2 ml sạch DNase/ RNase (5.1.3).

- Nhỏ 50 µl nước tinh khiết không có DNase/ RNase vào cột lọc, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm (5.2.4) cột lọc và ống ly tâm 1,5 đến 2 ml (5.1.3) ở gia tốc 14 000 g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Bỏ cột lọc, giữ lại ống ly tâm 1,5 đến 2 ml chứa 50 µl ADN/ARN. Bảo quản ADN/ARN ở 4 °C nếu thực hiện xét nghiệm ngay hoặc ở âm 20 °C (5.1.8) nếu xét nghiệm sau 24 giờ.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phương pháp real-time PCR phát hiện vi rút Capripox

Bảng C1: Trình tự mồi - mẫu dò phát hiện vi rút Capribox trong phương pháp real-time PCR

...

...

...

Tên

Trình tự (5’-3’)

1

Mồi xuôi (CaPV074F1)

AAA ACG GTA TAT GGA ATA GAG TTG GAA

2

Mồi ngược (CaPV074R1)

AAA TGA AAC CAATGG ATG GGA TA

3

...

...

...

6FAM-TGG CTC ATA GAT TTC CT-MGB/NFQ

CHÚ THÍCH 1:

- Việc lựa chọn các mồi và mẫu dò cho phản ứng cần tham khảo theo hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật của Tổ chức Thú y Thế giới (WOAH) và các bài báo khoa học hàng năm để cập nhật mồi cho phù hợp.

- Trình tự các mồi và mẫu dò được trình bày ở bảng C1 được công bố theo tài liệu tham khảo [2].

Bảng C2: Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml với các lượng cụ thể cho mỗi phản ứng

TT

Thành phần

(Theo hướng dẫn của kit Platinum ® Quantitative PCR SuperMix-UDG. Cat No: 11730-017)3)

Nồng độ cuối cùng

...

...

...

1

Nước tinh khiết, không có ARN/ADN

6

2

Dung dịch supermix

1X

12,5

3

...

...

...

400 nM

0,5

4

Mồi ngược (20 µM)

400 nM

0,5

5

Mẫu dò (6 µM)

200 nM

...

...

...

6

Mẫu ADN

5

Tổng

25

CHÚ THÍCH 2:

...

...

...

Bảng C3: Chu trình nhiệt cho phản ứng real-time PCR phát hiện vi rút Capribox

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

50 °C

02 phút

1

95 °C

...

...

...

1

95 °C

15 giây

45

60 °C*

60 giây

Ghi nhận tín hiệu quang ở bước này

CHÚ THÍCH 3:

- Nhiệt độ và thời gian này chỉ phù hợp với kit Platinum ® Quantitative PCR SuperMix-UDG. Cat No: 11730-017. Việc thực hiện cài đặt nhiệt độ và thời gian nên tuân thủ theo hướng dẫn của từng bộ kit được sử dụng.

...

...

...

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp real-time PCR sử dụng cặp mồi Snapback phát hiện vi rút VDNC và phân biệt các vi rút Capripox

Bảng D1: Trình tự mồi - mẫu dò phân biệt vi rút gây bệnh VDNC và phân biệt các vi rút Capripox

TT

Tên

Trình tự (5’ - 3’)

1

Mồi Snapback (Cp-HRM-SBF)

...

...

...

2

Mồi ngược (Cp-HRM1R)

AATTTCTTTCTCTGTTCCATTTG

CHÚ THÍCH 1:

- Việc lựa chọn các mồi và mẫu dò cho phản ứng cần tham khảo theo hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật của Tổ chức Thú y Thế giới (WOAH) và các bài báo khoa học hàng năm để cập nhật mồi cho phù hợp.

- Trình tự các mồi được trình bày ở bảng D1 được công bố theo tài liệu tham khảo [3].

Bảng D2: Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml với các lượng cụ thể cho mỗi phản ứng

TT

Thành phần

...

...

...

Nồng độ cuối cùng

Thể tích 1 phản ứng (µl)

1

Nước tinh khiết, không có ARN/ADN

5,84

2

SsoFast ™ EvaGreen Supermix 2X (Bio-Rad)

1X

...

...

...

3

Mồi Snapback (Cp-HRM-SBF) (5 µM)

500 nM

2

4

Mồi ngược (Cp-HRM1R) (5 µM)

40 nM

0,16

6

...

...

...

2

Tổng

20

CHÚ THÍCH 2:

- Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít sử dụng.

...

...

...

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

(vòng)

95 °C

3 phút

1

95 °C

15 giây

...

...

...

58 °C

80 giây*

45

(ghi nhận tín hiệu ở đây)

95 °C

1 phút

40 °C

...

...

...

40 - 85 °C*

10 giây/0,5°C

nhiệt độ nóng chảy (*1 lần đọc ở từng điểm nhiệt độ)

37 °C

1 phút

* Đọc tín hiệu huỳnh quang ở FAM/Sybr

CHÚ THÍCH 3:

...

...

...

Phụ lục E

(Tham khảo)

Sơ đồ chẩn đoán bệnh viêm da nổi cục

Phụ lục G

(Tham khảo)

Phương pháp ELISA

...

...

...

Nếu sử dụng bộ kít IDvet, mã số N26 CPVDA-5P5) phát hiện kháng thể kháng vi rút VDNC thì các bước tiến hành được thực hiện như sau:

G.1  Chuẩn bị hóa chất

Trước khi sử dụng tất cả các nguyên liệu phải được để ổn định ở nhiệt độ phòng 21 °C (±5 °C). Các nguyên liệu được lắc đều trước khi sử dụng.

DUNG DỊCH WASHING

- Cách pha loãng: pha dung dịch Washing (20X) (cấp sẵn) theo tỉ lệ 1 phần dung dịch Washing đậm đặc với 19 phần nước cất hoặc nước khử ion (4.1.4). Ví dụ: 25 ml dung dịch Washing đậm đặc với 475 ml nước cất.

- Dung dịch Washing (1X) sau khi chuẩn bị bảo quản ở 2 °C đến 8 °C (5.1.7).

ĐỐI CHỨNG

- Một khi đã mở, đối chứng âm và đối chứng dương có thể bảo quản ở 2 °C đến 8 °C (5.1.7).

CONJUGATE:

...

...

...

- Cần trộn kĩ (5.2.2) dung dịch Conjugate 1/10 trước khi cho vào đĩa.

- Nên chỉ chuẩn bị một lượng Conjugate 1/10 cần đủ cho mỗi lần thực hiện, nếu còn dư sẽ không được sử dụng cho lần thực hiện tiếp theo.

G.2  Các bước thực hiện

- Nhỏ 50 µl dung dịch pha loãng mẫu (Dilution Buffer 19) vào tất cả các giếng.

- Nhỏ 50 µl đối chứng âm chuẩn (Negative Control) vào 2 giếng (A1 và B1).

- Nhỏ 50 µl đối chứng dương chuẩn (Positive Control) vào 2 giếng (C1 và D1).

- Nhỏ 50 µl mẫu vào các giếng tiếp theo (1 giếng/ mẫu).

- Che phủ đĩa phẫn ứng bằng tấm film trong (có sẵn trong bộ kít) hoặc giấy bạc. Ủ đĩa trong 1 giờ 30 phút (±9 phút) ở 21 °C (±5°C).

- Sau khi ủ, đổ bỏ dung dịch trong đĩa. Rửa đĩa 5 lần với 300 µl Wash Solution (1X), đập khô đĩa.

...

...

...

- Che phủ đĩa và ủ 30 phút (±3 phút) ở 21 °C (±5°C).

- Sau khỉ ủ, đổ bỏ dung dịch trong đĩa. Rửa đĩa 5 lần với 300 µl Wash Solution (1X), đập khô đĩa.

- Nhỏ 100 µl Substrate Solution vào tất cả các giếng.

- Ủ đĩa 15 phút (±2 phút) ở 21 °C (±5 °C).

- Nhỏ 100 µl Stop Solution vào tất cả các giếng.

- Đọc kết quả (5.3.6) ở bước sóng 450 nm không quá 5 phút sau khi nhỏ Stop Solution.

G.3  Đọc và diễn giải kết quả

Xác định tính hợp lệ (Validation) của xét nghiệm

Một xét nghiệm được công nhận khi:

...

...

...

+ Giá trị OD của đối chứng âm (NC) ít nhất cao gấp 3 lần giá trị OD của đối chứng dương (PC): ODNC/ODPC > 3

Tính toán kết quả

a. Cách tính Blocking % (S/P %) của mẫu huyết thanh:

Nếu:     S/P % ≥ 30%: Dương tính

            S/P% < 30%: Âm tính

Sơ đồ đĩa:

1

...

...

...

3

4

5

6

7

8

9

10

11

...

...

...

A

ĐC (-)

S5

S13

S21

S29

S37

S45

S53

...

...

...

S69

S77

S85

B

ĐC (-)

S6

S14

S22

S30

...

...

...

S46

S54

S62

S70

S78

S86

C

ĐC (+)

S7

...

...

...

S23

S31

S39

S47

S55

S63

S71

S79

S87

...

...

...

ĐC (+)

S8

S16

S24

S32

S40

S48

S56

S64

...

...

...

S80

S88

E

S1

S9

S17

S25

S33

S41

...

...

...

S57

S65

S73

S81

S89

F

S2

S10

S18

...

...

...

S34

S42

S50

S58

S66

S74

S82

S90

G

...

...

...

S11

S19

S27

S35

S43

S51

S59

S67

S75

...

...

...

S91

H

S4

S12

S20

S28

S36

S44

S52

...

...

...

S68

S76

S84

S92

CHÚ THÍCH:

- ĐC (-): Đối chứng âm.

- ĐC (+): Đối chứng dương.

- S1, S2, S3.....S92: mẫu huyết thanh cần kiểm tra số 1, số 2, số 3,... đến mẫu số 92.

...

...

...

(Quy định)

Phương pháp trung hòa vi rút trên môi trường tế bào

H.1  Chuẩn bị tế bào

- Nuôi tế bào MDBK (4.3.4) hoặc tế bào sơ cấp như tế bào LT (4.3.5) để phát triển một lớp đạt 100 % bề mặt trên chai tế bào T75 (5.3.3).

- Hút (5.1.1) bỏ môi trường đang nuôi trong chai tế bào MDBK hoặc LT 1 lớp.

- Rửa bề mặt thảm tế bào 2 lần. Mỗi lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) (4.1.2) với 10 ml/chai T75 cm^2, tráng qua và hút bỏ PBS.

- Cho 2 ml trypsin (có 0,5 % EDTA) (4.3.2) ủ trong thời gian từ 5 phút đến 10 phút ở nhiệt độ 37 °C, 5% CO₂ (5.3.1).

- Khi tế bào đã tách hết, bổ sung 5 ml môi trường DM EM 5 % FBS (xem A3 phụ lục A) vào chai để vô hoạt trypsin, trộn đều, chuyển toàn bộ hỗn dịch này vào ống ly tâm 15 ml (5.1.3).

- Ly tâm tế bào (5.2.4) ở gia tốc 1 500 g trong 5 phút để loại bỏ môi trường chứa trypsin. Loại bỏ hỗn dịch phía trên, giữ lại phần cặn là tế bào ở dưới.

...

...

...

- Đếm tế bào (5.3.5), thêm một lượng môi trường phảt triển GMEM (xem A4, Phụ lục A) sao cho đạt mật độ 2 x 10^5 tế bào/ml môi trường phát triển.

H.2  Chuẩn bị vi rút

Chủng vi rút Capripox tham chiếu thường là chủng vắc xin đã biết, phát triển tốt trong nuôi cấy mô, với hiệu giá lớn hơn 10^6 TCID₅₀/ml. Vi rút được pha loãng để tạo ra độ pha loãng log₁₀ 5.0, 4.0, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5 TCID₅₀/ml (tương đương với log₁₀ 3.7, 2.7, 2.2, 1.7, 1.2, 0.7, 0.2 TClD₅₀/50 µl).

H.3 Trung hòa vi rút

- Huyết thanh trâu, bò, bao gồm cả đối chứng âm, đối chứng dương pha loãng 1/5 trong môi trường pha loãng DMEM (xem mục A5 phụ lục A) và bất hoạt ở 56 °C trong 30 phút (5.2.6).

- Nhỏ 50 µl huyết thanh mẫu 1 vào cột 1 và 2, từ hàng A đến H của đĩa tế bào 96 giếng (5.3.2),

- Nhỏ 50 µl huyết thanh mẫu 2 vào cột 3 và 4, từ hàng A đến H của đĩa tế bào 96 giếng (5.3.2)

- Nhỏ 50 µl huyết thanh mẫu 3 vào cột 5 và 6, từ hàng A đến H của đĩa tế bào 96 giếng (5.3.2)

- Nhỏ 50 µl huyết thanh dương chuẩn (4.3.6) vào cột 7 và 8, từ hàng A đến H của đĩa tế bào 96 giếng (5.3.2).

...

...

...

- Nhỏ 50 µl môi trường pha loãng DMEM (xem A.5, Phụ lục A) vào cột 11 và 12 và tất cả các giếng ở hàng H.

- Nhỏ 50 µl vi rút mỗi độ pha loãng vào mỗi giếng của từng hàng sao cho độ pha loãng vi rút có hiệu giá cao nhất được đặt vào hàng A, độ pha loãng vi rút có hiệu giá thấp nhất được đặt vào hàng G cụ thể như sau:

- Bắt đầu với hàng G và vi rút pha loãng đã chuẩn bị, 50 µl vi rút độ pha loãng thấp nhất (0.2 TCID₅₀/50 µl) được thêm vào mỗi giếng trong hàng G. Điều này được lặp lại lần lượt với mỗi độ pha loãng vi rút tiếp theo với các hàng thiếp theo. Cuối cùng, 50 µl độ pha loãng vi rút có hiệu giá cao nhất (3,7 TCID₅₀/50 µl) được nhỏ vào tất cả các giếng hàng A.

- Ủ đĩa ở 37 °C, 5 % CO₂ trong 1 giờ (5.3.1).

- Nhỏ 100 µl tế bào đã được chuẩn bị vào tất cả các giếng trừ giếng H11 và H12 để làm đối chứng môi trường, giếng từ H1 đến H10 đóng vai trò là đối chứng tế bào và huyết thanh.

- Đĩa tế bào được đậy nắp, ủ ở 37 °C, 5 % CO₂ (5.3.1) trong 9 ngày.

- Sử dụng kính hiển vi soi ngược (5.3.4) kiểm tra đĩa tế bào hàng ngày từ ngày thứ 4 để tìm biến đổi bệnh lý tế bào (CPE).

Đọc kết quả:

+ Có biến đổi bệnh lý tế bào (có CPE): Các tế bào bị nhiễm vi rút sẽ xuất hiện CPE bao gồm sự co lại của màng tế bào khỏi các tế bào xung quanh, các tế bào bám vào nhau tạo thành các cụm.

...

...

...

+ Kết quả đọc cuối cùng được ghi nhận vào ngày thứ 9 và hiệu giá vi rút trong mỗi lần chuẩn độ lặp lại được tính toán bằng phương pháp Kärber.

+ Chỉ số trung hòa (NI) là chênh lệch hiệu giá log giữa hiệu giá của vi rút trong đối chứng âm và hiệu giá của vi rút trong mẫu huyết thanh thử nghiệm. Chỉ số trung hòa ≥ 1,5 là dương tính.

Cách tính chỉ số trung hòa:

Độ pha loãng vi rút (Log₁₀)

3,7

2,7

2,2

1,7

1,2

...

...

...

0,2

TCID₅₀

(log₁₀)

NI

HT đối chứng âm

(+) 2/2

(+) 2/2

(+) 2/2

(+) 2/2

...

...

...

(+)2/2

(+) 2/2

0

HT kiểm tra

(+) 2/2

(+) 2/2

(+) 1/2

(-) 2/2

...

...

...

(-) 2/2

(-) 2/2

2,2

2,2

Kết quả: NI = 2,2 - 0 = 2,2

Ghi chú: (+): có CPE tức là không có kháng thể để trung hòa vi rút

(-): không có CPE tức là có mẫu HT có kháng thể để trung hòa vi rút

Sơ đồ đĩa phản ứng:

...

...

...

(độ pha loãng VR)

3,7

2,7

2,2

1,7

1,2

0,7

0,2

...

...

...

A

B

C

D

E

F

G

H

Mẫu HT số 1

...

...

...

2

...

...

...

Mẫu HT số 2

3

...

...

...

4

...

...

...

Mẫu HT số 3

5

...

...

...

6

...

...

...

Đối chứng dương

7

...

...

...

8

...

...

...

Đối chứng âm

9

...

...

...

10

...

...

...

Môi trường pha loãng

11

...

...

...

12

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

1. WOAH Terrestrial Manual 2023. Chapter 3.4.12 Lumpy skin disease.

2. Bowden TR, Babiuk SL, Parkyn GR, Copps JS, Boyle DB, 2008. Capripoxvirus tissue tropism and shedding: A quantitative study in experimentally infected sheep and goats. Virology. 371(2):380-93.

3. Gelaye E, Lamien CE, Silber R, Tuppurainen ES, Grabherr R, Diallo A, 2013. Development of a cost-effective method for capripoxvirus genotyping using snapback primer and dsDNA intercalating dye. PLoS One. 8(10):e75971.

1) và ^2) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương đương. Khi sử dụng nên tuân thủ theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

3) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẫn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương đương. Khi sử dụng nên tuân thủ theo khuyến cáo của nhà sản xuất

...

...

...

5) Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm thương mại của nhà cung cấp này. Có thể sử các sản phẩm khác nếu cho kết quả tương đương. Khi sử dụng nên tuân thủ theo khuyến cáo của nhà sản xuất