Thuộc tính
Nội dung
Tiếng Anh (English)
Văn bản gốc/PDF
Lược đồ
Liên quan hiệu lực
Liên quan nội dung
Thuộc tính
Tải về
Các bản dự thảo

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-42:2019 về Bệnh động vật - Phần 42: Bệnh dịch tả loại nhai lại nhỏ

Số hiệu:	TCVN8400-42:2019	Loại văn bản:	Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành:	***	Người ký:	***
Ngày ban hành:	Năm 2019	Ngày hiệu lực:
		Tình trạng:	Đã biết

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-42:2019

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN PHẦN 42: BỆNH DỊCH TẢ LOẠI NHAI LẠI NHỎ

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 42: Peste des petits ruminants

Lời nói đầu

TCVN 8400-42 : 2019 do Cục Thú y biên soạn trên cơ sở tham khảo tài liệu của Tổ chức Thú y thế giới (OIB), Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm 47 phần:

- TCVN 8400-1 : 2019, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

- TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu CátXơn;

- TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11 : 2019, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

...

- TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15 : 2019, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

- TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22 : 2014 phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

...

- TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

...

- TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

- TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Coronavirus;

- TCVN 8400-39 : 2016, phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40 : 2016, phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra.

- TCVN 8400-41 : 2019, phần 41: Bệnh dịch tả lợn Châu Phi.

- TCVN 8400-42 : 2019, phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ;

...

- TCVN 8400-44 : 2019, phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45 : 2019, phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46 : 2019, phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47 : 2019, phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN PHẦN 42: BỆNH DỊCH TẢ LOẠI NHAI LẠI NHỎ

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 42: Peste des petits ruminants

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1 Phạm vi áp dụng

...

2 Tài liệu viện dẫn

TCVN 8402:2010. Bệnh động vật - Quy trình mổ khám.

3 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1 Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ (Peste Des Petits Ruminants)

Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ (PPR) là bệnh truyền nhiễm cấp tính hoặc á cấp tính gây ra bởi vi rút thuộc nhóm Morbillivirus, họ Paramyxovidiae. Bệnh xảy ra chủ yếu trên dê và cừu, đôi khi thấy xuất hiện trên động vật nhai lại hoang dã với đặc trưng là sốt cao, chảy dịch mắt, dịch mũi, loét niêm mạc miệng, viêm phổi và tiêu chảy.

3.2 Chữ viết tắt

- CPE (Cytopathic effect): biến đổi bệnh lý tế bào

- DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium): môi trường DMEM dùng cho nuôi cấy tế bào

...

- FCS (Fetal calf serum): huyết thanh thai bê

- cELISA (Competitive Enzyme -Linked Immunosorbent Assay): phản ứng miễn dịch liên kết enzyme cạnh tranh

- Realtime RT-PCR (Realtime Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction): phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược thời gian thực.

- PBS (Phosphate buffered saline): dung dịch muối đệm phốt phát.

- ARN (Acid ribonucleic): axit ribonucleic.

- Ct (Threshold cycle): chu kỳ ngưỡng.

- DPBS (Phosphate buffered gelatin saline): dung dịch muối đệm phốt phát-gelatin

4 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích,sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

...

4.1.1 Ethanol, từ 70% (v/v) đến etanol tuyệt đối.

4.1.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2 ± 0,2

4.1.3 Tăm bông vô trùng

4.1.4 Xy lanh và kim tiêm loại 22G

4.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp realtime RT-PCR

4.2.1 Kit tách chiết RNA.

4.2.2 Kit nhân gen.

4.2.3 Mồi xuôi, môi ngược và mẫu dò (tham khảo phụ lục C).

4.2.4 Mẫu chuẩn dương, được chứng nhận là dương tính hoặc RNA chuẩn dương tách chiết từ vi rút PPR có giá trị Ct đã biết trước.

...

4.3 Nguyên liệu và vật liệu thử dùng cho phương pháp cELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym).

4.3.1 Kít ELISA. Hiện nay các kít ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể PPRV, khi sử dụng kit ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.3.2 Nước cất khử ion

4.4 Nguyên liệu và thuốc thử dùng cho phân lập vi rút và phản ứng trung hòa vi rút.

4.4.1 Tế bào CV1/SLAM.

4.4.2 Vi rút PPR.

4.4.3 Dung dịch DMEM

4.4.4 FCS (Fetal calf serum).

4.4.5 Dung dịch trypan blue 0.4 %

...

4.4.7 Dung dịch kháng sinh Peniciline/Streptomycine.

4.4.8 DPBS, không có canxi và magie

5 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị, dụng cụ sau:

5.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung.

5.1.1 Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C.

5.1.2 Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

5.1.3 Buồng cấy an toàn sinh học cấp II.

5.1.4 Máy lắc trộn,

...

5.1.6 Pank, kéo, vô trùng.

5.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime RT-PCR

5.2.1 Máy nhân gen (realtime-PCR).

5.2.2 Máy ly tâm, có thể đạt gia tốc ly tâm 900 g/min; 6 000 g/min và 20 000 g/min.

5.2.3 Máy lắc trộn

5.2.4 Máy ly tâm nhỏ (tốc độ thấp).

5.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA

5.3.1 Máy đọc ELISA, có thể đọc ở bước sóng 450 nm.

5.3.2 Thiết bị ủ mẫu, có thể duy trì nhiệt độ ở 37°C.

...

5.4.1 Kính hiển vi đảo ngược

5.4.2 Tủ ấm có chứa 5 % CO₂, duy trì được ở 37°C.

5.4.3 Chai nuôi tế bào, 25 cm², 75 cm².

5.4.4 Đĩa nuôi tế bào, 96 giếng.

5.4.5 Màng lọc, có kích thước lỗ lọc là 0,2 µm

5.4.6 Màng lọc, có kích thước lỗ lọc 0,45 µm

5.4.7 Buồng đếm hồng cầu

5.4.8 Bể điều nhiệt, duy trì nhiệt độ ở 37°C

Ngoài ra còn có các loại pipet và đầu typ, ống 15 ml, 50 ml, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

...

6.1 Đặc điểm dịch tễ.

- Bệnh được cho là xảy ra chủ yếu trên dê và cừu, dê thường mẫn cảm hơn cừu và có xu hướng trầm trọng hơn. Bệnh cũng được thông báo xuất hiện trên lạc đà. Trâu, bò có thể nhiễm vi rút, nhưng không biểu hiện triệu chứng lâm sàng và không thấy có sự bài thải vi rút trên những động vật này.

- Động vật khỏe mắc bệnh do tiếp xúc với động vật bị bệnh. Vi rút thường xâm nhập qua đường hô hấp và tiêu hóa thông qua tiếp xúc, không khí, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi như máng ăn, xe chở gia súc bệnh có chứa mầm bệnh. Phân, nước tiểu, sữa và các sản phẩm sảy thai của gia súc bệnh chứa lượng lớn vi rút.

- Tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: độc lực của vi rút, loài động vật cảm thụ, tuổi, giống, tình trạng miễn dịch và điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, tỷ lệ mắc có thể lên tới 100 % với tỷ lệ chết 90 % trong trường hợp mắc bệnh cấp tính.

- Bệnh biến đổi theo mùa, các ổ dịch thường xảy ra nhiều hơn trong mùa mưa và lúc hanh khô. Hoạt động tập trung buôn bán động vật cũng làm tăng khả năng bùng phát dịch.

- Vi rút có thề tồn tại trong thời gian dài trong mô lạnh hoặc đông lạnh, nhưng dễ bị bất hoạt trong điều kiện môi trường và các tác nhân vật lý, hóa học.

6.2 Triệu chứng lâm sàng

- Thời kỳ ủ bệnh thường từ 4-6 ngày, đôi khi kéo dài khoảng 3-10 ngày. Trong trường hợp cấp tính, con vật sốt cao lên tới 41 °C, kéo dài 3-5 ngày đi kèm với các biểu hiện: ủ rũ, kém ăn, giảm vận động, miệng khô, mắt mũi kết dử. Xoang miệng có những vết lờ loét, tăng tiết nước bọt, xuất hiện cả mảng fibrin trên lưỡi. Trong giai đoạn sau của bệnh, con vật bị viêm phổi, ho dữ dội và thở thể bụng, tiêu chảy mất nước trầm trọng, con vật giảm cân dần và trường hợp nặng dẫn đến tử vong. Động vật mang thai có thể bị sảy thai.

6.3 Bệnh tích đại thể

...

- Có hiện tượng xuất huyết, hoại tử niêm mạc đường tiêu hóa, có thể kéo dài từ niêm mạc miệng đến van hồi manh tràng. Vùng xung huyết hoặc xuất huyết đặc trưng của bệnh có thể xuất hiện dọc theo các nếp gấp của phần ruột già (dải ngựa vằn).

- Phổi bị phù,viêm phổi kẽ và xuất huyết. Có hiện tượng tắc nghẽn thức ăn trong ruột. Mảng payer bị hoại tử, hạch lympho sưng to. Gan, lách có hiện tượng xuất huyết và hoại tử.

6.4 Bệnh tích vi thể.

- Kiểm tra mô bệnh học thấy xuất hiện các tế bào khổng lồ đa nhân và các thể vùi trong tế bào chất, các tế bào khổng lồ này xuất hiện nhiều nhất trong các tế bào biểu mô phổi, biểu mô phế quản, phế nang và biểu mô đại tràng.

- Tế bào gan bị thoái hóa, xuất hiện không bào và bạch cầu ái toan và các tế bào lympho tại tĩnh mạch cửa. Phổi bị xung huyết và xuất huyết điểm, viêm phổi kẽ, và xuất hiện nhiều các tế bào sợi ở phổi.

6.5 Chẩn đoán phân biệt

- Bệnh lưỡi xanh: con vật sốt, chảy nước mắt, nước mũi, khó thở, có xuất hiện mụn nước và các vết loét quanh miệng, niêm mạc bị hoại tử hoặc bong tróc. Lưỡi bị tím tái và nhô ra khỏi miệng. Vành móng bị bong tróc và xung huyết, con vật đau móng và có thể bị què.

- Bệnh lở mồm long móng: niêm mạc miệng, môi, lưỡi, chân răng đỏ ửng, khô, nóng. Mụn nước xuất hiện bên trong má, mép, chân răng, và bề mặt lưỡi. Mụn nước không có mủ, nước bọt chảy đầy quanh miệng và có thể nhỏ chảy thành sợi dài. Con vật bị viêm, sưng vành móng, có thể bong tróc móng và bị què.

- Bệnh đậu cừu, đậu dê: con vật sốt, mí mắt sưng, tiết đầy dịch trong mồm và mũi. Xuất hiện các nốt đậu ở những vùng da mỏng, ít lông và ở miệng gây nên viêm mũi, kết mạc và tuyến lệ.

...

7.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

7.1.1 Mẫu dịch tiết: đối với con vật sống nghi mắc bệnh có thể dùng tăm bông vô trùng (4.1.3) thấm dịch tiết từ mắt, xoang mũi, các biểu mô bị tổn thương trong xoang miệng đặt vào ống chứa dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh (xem A.1, phụ lục A). Ghi đầy đủ thông tin của mẫu và ký hiệu mẫu trên thành ống.

7.1.2 Mẫu máu chống đông: dùng kim tiêm 22G vô trùng (4.1.4) lấy khoảng 5 ml máu của động vật đang sốt nghi mắc bệnh cho vào ống nghiệm có chất chống đông, lắc nhẹ.

7.1.3 Mẫu huyết thanh: dùng xy lanh vô trùng với kim tiêm 22G vô trùng (4.1.4) lấy khoảng 5 ml máu từ tĩnh mạch cổ động vật. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống, ghi ký hiệu mẫu trên cả pit tông và thành ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng chiếu trực tiếp.

7.1.4 Mẫu mô:

- Động vật mới chết, mổ khám theo TCVN 8402 : 2010.

- Tiến hành lấy các mẫu mô trong quá trình mổ khám, lấy khoảng 5 g đến 10 g hạch lâm ba, hạch phổi, hạch màng treo ruột, lách, mô phổi và màng niêm mạc ruột tại phần hồi, manh tràng.

7.2 Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (7.1) phải bao gói, bảo quản trong thùng bảo ôn có nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C, vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng quá 24 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được giữ trong tủ âm 80 °C (5.1.1)

...

7.3 Phát hiện vi rút PPR

7.3.1 Phát hiện vi rút PPR bằng phương pháp realtime RT- PCR

7.3.1.1 Xử lý mẫu.

- Mẫu bệnh phẩm (7.1.4) được cắt nhỏ rồi nghiền trong cối chày sứ vô trùng với dung dịch PBS (theo A.1, phụ lục A) để thu được huyễn dịch 10 % (01 g mẫu mô + 9 ml dung dịch PBS). Cho huyễn dịch vào ống ly tâm 15 ml, đặt vào máy ly tâm (5.2.2), ly tâm ở gia tốc 900 g trong 10 min. Thu lấy dịch nỗi phía trên để chiết tách RNA của vi rút.

7.3.1.2 Tách chiết RNA

- Huyễn dịch bệnh phẩm sau khi xử lý được thực hiện chiết tách ARN bằng các kít thương mại và bảo quản mẫu ARN ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản âm 20 °C trong thời gian dài.

- Các mẫu bệnh phẩm được tách chiết ARN bằng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất (tham khảo phụ lục B).

7.3.1.3 Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen theo phương pháp realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của PPRV sử dụng cặp mồi xuôi và mồi ngược (tham khảo mục C.1, phụ lục C).

...

- Chuẩn bị mồi gốc: mồi gốc và mẫu dò gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (7.2.4) ở gia tốc 6.000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm mồi gốc và mẫu dò gốc.

- Chuẩn bị mồi sử dụng:

+ Mồi sử dụng được dùng ở nồng độ 20 µM: Lấy 20 µl mồi gốc pha với 80 µl nước (4.2.5).

+ Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 6 µM: Lấy 6 µl mẫu dò gốc pha với 94 µl nước (4.2.5).

Trộn cùng 1 thể tích mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò sau khi pha thành hỗn hợp để tiện khi sử dụng.

7.3.1.4 Tiến hành phản ứng realtime RT-PCR

Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (7.3.1.3) và bộ kit thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng có thể tham khảo trong bảng C.2, phụ lục C.

Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu:

- Cho 20 µI hỗn hợp nguyên liệu vào ống PCR 0,2 ml.

...

- Cho 5 µl nước tinh khiết, không có nuclease (4.2.5) vào ống PCR- Mẫu đối chứng âm.

- Cho 5 µl ARN (7.3.1.2) của mẫu vừa tách chiết vào ống PCR.

- Ly tâm nhẹ cho hỗn hợp khong bám trên thành ống

- Đặt ống PCR vào máy realtime PCR (5.2.1)

- Chu trình nhiệt chạy phản ứng (tham khảo bảng C.3, phụ lục C).

CHÚ THÍCH:

1) Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

2) Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

7.3.1.5 Đọc kết quả

...

Với điều kiện phản ứng trên:

1) Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính,

2) Mẫu không có giá trị Ct là âm tính,

3) Mẫu có giá trị Ct ≤ 40 và > 35 được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại lần 2 hoặc xét nghiệm bằng phương pháp khác có độ nhạy và độ chính xác cao hơn để khẳng định và đưa ra kết luận cuối cùng.

7.3.2 Phát hiện vi rút PPR bằng phương pháp phân lập vi rút.

7.3.2.1 Xử lý mẫu

7.3.2.1.1 Mẫu dịch tiết (mẫu swab).

- Mẫu sau khi được trộn dều bằng máy lắc trộn (5.1.4), ly tâm nhẹ cho dung dịch xuống hết dưới, không bám trên thành ống. Dùng xy lanh vô trùng lấy 0.5 ml dịch nồi phía trên, gắn màng lọc 0.2 µl (5.4.5) vào xy lanh, đẩy mẫu qua máng lọc vào trong ống eppendorf vô trùng.

...

- Mẫu mô (7.1.4) được nghiền trong cối chày sử vô trùng, bổ sung dung dịch DMEM không có huyết thanh bê tạo thành hỗn dịch 10 %, ly tâm 5000 g trong 3 min. Lấy 0.5 ml dịch nổi và lọc qua màng lọc 0.2 µl, đẩy mẫu qua màng lọc vào trong ống eppendorf vô trùng.

7.3.2.1.3 Mẫu máu chống đông.

- Ly tâm mẫu máu chống đông ở tốc độ 1.000 rpm trong 5 min, thu lấy tế bào bạch cầu ở lớp giữa hồng cầu và huyết tương. Rửa tế bào bạch cầu bằng dung dịch DMEM không có huyết thanh bê, có bổ sung kháng sinh. Ly tâm ở tốc độ 1.000 rpm trong 5 min, bỏ lớp nước phía trên.

- Bổ sung thêm 1 ml dung dịch DMEM không có huyết thanh bê, có bổ sung kháng sinh, lấy 0.5 ml mẫu để nuôi cấy, phân lập vi rút.

7.3.2.2 Cách tiến hành

Bước 1: chuẩn bị tế bào CV1/SLAM (4.4.1) trong chai nuôi tế bào 25 cm²(5.4.3)

- Giải đông tế bào CV1/SLAM trong bể điều nhiệt ở 37°C (5.4.8).

- Chuyển hỗn hợp tế báo vào ống ly tâm 15 ml vô trùng chứa sẵn 10 ml môi trường phát triển tế bào DMEM đã bổ sung 10 % FCS

- Trộn đều bằng pipet, cho vào ly tâm ở gia tốc 200 g trong 5 min ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ phần dịch nổi phía trên.

...

- Hút chuyển dung dịch này vào chai nuôi tế bào 25 cm²và nuôi trong tủ ấm (5.4.2)

Quan sát sự phát triển của tế bào hàng ngày dưới kính hiển vi đảo ngược (5.4.1). Sau từ 2 ngày đến 4 ngày sẽ thu được một thảm tế bào. Khi tế bào bao phủ 80 % chai nuôi cấy thì dùng cho phân lập vi rút.

Bước 2: gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm

- Hút 0.5 ml dung dịch mẫu đã được xử lý (7.3.2.1) vào chai tế bào 1 lớp 25 cm² đã được chuẩn bị tại bước 1.

- Ủ ở 37 °C trong 1h, cứ 15 min lắc nhẹ 1 lần.

- Bổ sung 5 ml môi trường nuôi tế bảo DMEM đã bổ sung 2 % kháng sinh, ủ 37 °C trong tủ ấm (5.4.2).

- Kiểm tra bệnh tích tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi đảo ngược (5.4.1).

- Từ ngày thứ 4 trở đi, cứ 2 ngày lại thay môi trường nuôi tế bào DMEM bổ sung 1 % kháng sinh.

7.3.2.3 Đánh giá kết quả:

...

- Xác định vi rút bằng phương pháp realtime RT-PCR (7.3.1).

+ Nếu kết quả realtime RT-PCR dương tính thì kết luận mẫu có vi rút PPR trong mẫu,

+ Nếu kết quả realtime RT-PCR âm tính, tiến hành phân lập lần 2.

CHÚ THÍCH: Đối với những mẫu không quan sát thấy bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuối cấy, dùng trypsine để phân tách tế bào, tạo dung dịch cho lần cấy tiếp theo. Mẫu được coi là âm tính khi không có bệnh tích tế bào trong 4 lần cấy chuyển liên tục.

7.4 Phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả loài nhai lại nhỏ

Phản ứng huyết thanh học có ý nghĩa chấn đoán khi con vật mắc bệnh có triệu chứng, bệnh tích nghi ngờ dịch tả loài nhai lại nhỏ. Ngoài ra, các phản ứng này còn dùng để xác định tỷ lệ lưu hành huyết thanh học trong quần thể động vật chưa tiêm phòng vắc xin phòng bệnh PPR, hoặc sử dụng trong đánh giá kết quả sau tiêm phòng vắc xin PPR.

7.4.1 Xử lý mẫu

Mẫu máu sau khi lấy (7.1.3) được chắt huyết thanh từ xy lanh sang ống nghiệm vô trùng. Thời gian kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh. Mẫu huyết thanh kiểm tra được vô hoạt bổ thể ở 56 °C trong 30 min

7.4.2 Phát hiện và định lượng kháng thể bằng phản ứng trung hòa vi rút

...

- Chuẩn bị dung dịch tế bào CV1/SLAM có chứa 6.10⁵ tế bào/ml (theo phụ lục D).

- Cách xác định liều TCID₅₀ của vi rút PPR (theo phụ lục E), pha dung dịch vi rút thành các nồng độ 1000 TCID₅₀/ml, 100 TCID₅₀/ml, 10 TCID₅₀/ml, 1 TCID₅₀/ml và 0.1 TCID₅₀/ml.

- Pha loãng huyết thanh cần kiểm tra theo tỷ lệ 1/5, sau đó tiếp tục pha loãng 1/2 với môi trường nuôi cấy tế bào. Cần đánh dấu vị trí dùng cho đối chứng dương, đối chứng âm và mẫu kiểm tra trên đĩa phản ứng, để tránh nhầm lẫn.

- Hút 100 ul dung dịch chứa vi rút PPR tại nồng độ 1000 TCID₅₀/ml và 100 ul huyết thanh đã pha loãng vào các giếng trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (5.4.4)

- Đối chứng dương: hút 100ul dịch vi rút tại các nồng độ 100 TCID₅₀/ml, 10 TCID₅₀/ml, 1 TCID₅₀/ml, 0.1 TCID₅₀/ml - mỗi nồng độ 6 giếng. Bổ sung 100 ul dung dịch nuôi cấy tế bào vào các giếng đối chứng.

- Đối chứng âm: hút 200 ul dung dịch nuôi cấy tế bào vào 6 giếng.

- Ủ đĩa ở 37°C trong 1 h.

- Thêm 50 ul dung dịch tế bào CV1/SLAM chứa 6.10⁵tế bào/ml vào mỗi giếng, vỗ nhẹ đĩa và đậy nắp. Ủ đĩa ở 37°C trong điều kiện có CO₂ (5.4.2). Đọc kết quả sau 1 tuần - 2 tuần.

7.4.2.2 Đọc kết quả.

...

- Khi quan sát mà không phát hiện thấy CPE trong các giếng, điều đó chứng tỏ trong huyết thanh có kháng thể PPR, kháng thể này đã trung hòa virút nên không có CPE. Ngược lại, nếu phát hiện thấy CPE, chứng tỏ trong huyết thanh kiểm tra không có kháng thể PPR, vi rút không bị trung hòa đã gây nên các tổn thương CPE.

- Hiệu giá kháng thể được xác định là độ pha loãng cuối cùng mà ở đó xảy ra 50 % hiện tượng trung hòa vi rút. Mẫu có hiệu giá > 1/10 được coi là dương tính.

7.4.3 Phát hiện kháng thể PPRV bằng phản ứng ELISA cạnh tranh

Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể PRRV có bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất, các bước thực hiện có thể tham khảo trong phụ lục F.

CHÚ THÍCH: Đối với những mẫu nghi ngờ, cần phải làm lại để khẳng định, nếu vẫn nghi ngờ thì cần dựa vào đặc điểm dịch tễ học để kết luận.

8 Kết luận

Động vật nghi mắc bệnh được coi là dương tính với bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ khi có các đặc điểm về dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích điển hình và có kết quả xét nghiệm dương tính với vi rút PPR bằng các phương pháp trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

...

A.1 Dung dịch đệm phosphat pH ~ 7,4 (PBS).

A.1.1 Thành phần

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄) 9,47 g

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄) 9,08 g

Nước cất 900 ml

A.1.2 Cách chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7.2 ± 0.2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 min, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

Chú thích: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2 Dung dịch kháng sinh đậm đặc.

...

Penicillin

10⁶ IU

Streptomycin

1 g

Kanamycin

1 g

Nước cất

10 ml

...

Lắc đều cho tan, lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.4.6). Sử dụng tốt nhất trong 1 tuần, bảo quản ở âm 20 °C.

A.3 Dung dịch DPBS dùng cho duy trì và cấy chuyển tế bào

- Hòa tan 9,55 g bột DPBS (4.4.8) trong 1 lít nước cất 2 lần, hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min. sử dụng tốt nhất trong 2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.

A.4 Môi trường nuôi tế bào (Sử dụng trong quá trình cấy chuyển và nuôi tế bào)

A.4.1 Thành phần

Môi trường DMEM

500 ml

Huyết thanh thai bê (FCS), 10 %

50 ml

...

5 ml

Kháng nấm (Fungizone 250 µg/ml)

5 ml

A.4.2 Cách chuẩn bị

Bổ sung thành phần kháng sinh và kháng nấm vào môi trường DMEM, sau đó thêm huyết thanh thai bê 10 % theo đúng tỷ lệ. Bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C. Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

A.5 Chuẩn bị 1X TPCK (Tosylphenylalanychloromethane) trypsin: 1 mg/ml

A.5.1 Thành phần

TPCK trypsin 10X

...

PBS (xem A.1)

900 ml

A.5.2 Cách chuẩn bị

Lắc đều TPCK trypsin trong PBS, sau đó lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.12), sau đó chia nhỏ lượng ra ống và bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C. Sử dụng tốt nhất trong 6 tháng.

A.6 Cấy chuyển và nuôi tế bào

A.6.1 Nguyên vật liệu:

Chai nuôi tế bào 25 cm² đã phát triển thành 1 lớp đạt 90 % bề mặt chai

Môi trường nuôi tế bào (xem A.3, phụ lục A)

...

PBS ~ pH 7,4 (xem A.1, phụ lục A)

Chú ý: tất cả các môi trường phải được cân bằng ở 37 °C và các vật tư dùng cho nuôi cấy tế bào đều phải đảm bào vô trùng trước khi sử dụng.

A.6.2 Cách tiến hành

- Hút bỏ môi trường trong chai tế bào 25 cm² đang nuôi tế bào CV1/SLAM 1 lớp 80 % bề mặt chai.

- Rửa bề mặt thảm tế bào bằng 5 ml DPBS 1X, tráng qua và hút bỏ DPBS.

-Thêm 5 ml trypsin 1X EDTA vào chai tế bào 25 cm² láng đều lên bề mặt tế bào sao cho bề mặt tế bảo được phủ trypsin. Ủ trong thời gian từ 5 min đến 10 min trong tủ ấm ở 37 °C (5.8).

Chú ý: Không để tế bào trong trypsin quá 15 min.

Khi tế bào đã tách hết, bổ sung 5 ml DMEM có 10 % FBS vào chai để vô hoạt trypsin, trộn đều, chuyển toàn bộ huyễn dịch tế bào sang ống ly tâm 15 ml.

- Ly tâm huyễn dịch tế bào ở gia tốc 200 g trong 5 min. Loại bỏ phần dung dịch ở trên, giữ cặn tế bào.

...

Nuôi chai tế bào trong tủ ấm 37 °C có 5 % CO₂.

Theo dõi sự phát triển hàng ngày của tế bào trên kính hiển vi soi ngược. Sau 3 ngày lại thay môi trường nuôi cấy. Đến khi tế bào phát triển thành một lớp bao phủ 90 % dĩa nuôi cấy thì lại tiến thành cấy chuyển lặp lại như quy trình trên đây.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết RNA

CẢNH BÁO: Việc tách chiết RNA có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Nếu sử dụng kít chiết tách Qiagen RNeasy minikit1 (4.2.1), thì các bước chiết tách được thực hiện như sau:

B.1 Chuẩn bị

Chuẩn bị dung dịch RLT (600 µl/mẫu) vào ống ly tâm 50 ml vô trùng. Thêm 1/100 β-mercaptoetanol (β-ME) vào dung dịch RLT (sau khi bổ sung β-ME, dung dịch RLT này có thể giữ được 1 tháng ở nhiệt độ phòng).

...

- Cho 200 µl huyễn dịch đã xử lý (7.3.1.1) vào ống eppendorf loại 1,5 ml, thêm 600 µl RLT (xem B.1), lắc đều trên máy lắc trộn (5.1.4 ) rồi ly tâm nhẹ (5.1.7).

- Thêm 500 µl etanol 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy lắc trộn, ly tâm nhẹ.

- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc ≥ 8.000 g ở nhiệt độ phòng.

- Bổ sung 700 µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vảo cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8.000 g, thay ống thu mới vào cột lọc.

- Cho 500 µl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8.000 g, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở gia tốc tối đa, bỏ ống thu.

- Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 µI nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ARN bằng cách ly tâm cột lọc trong 1 min ở gia tốc ≥ 8000 g, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.

- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 °C trong thời gian ngắn trước khi làm phản ứng, nếu sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở âm 20 °C hoặc nhiệt độ thấp hơn.

Phụ lục C

...

Trình tự cặp mồi, mẫu dò, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phương pháp realtime RT-PCR phát hiện vi rút dịch tả loài nhai lại nhỏ

Bảng C.1 - Trình tự cặp mồi, mẫu dò phát hiện vi rút dịch tả loài nhai lại nhỏ

Mẫu dò, mồi

Kí hiệu

Trình tự (5’-3’)

Mẫu dò

PPR-P

FAM-CGGCTGAGGCACTCTTCAGGCTGC-BHQ1

Mồi xuôi

...

GAGTCTAGTCAAAACCCTCGTGAG

Mồi ngược

PPR-R

TCTCCCTCCTCCTGGTCCTC

GHI CHÚ:

Trình tự cặp mồi và mẫu dò trong Bảng C.1 được được Tổ chức Thú y thế giới (OIE) khuyến cáo sử dụng. Các phòng thí nghiệm có thể sử dụng cặp mồi và mẫu do khác theo khuyến cáo của phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE hoặc khi OIE cập nhật trình tự cặp mồi và mẫu dò mới.

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng realtime RT-PCR

Sử dụng Quantabio-qScript™XLM One-step RT-qPCR Tough Mix® (Hãng Quantabio; Cat no: 95132-500)

Thành phần

...

Nước tinh khiết không có nuclease

6,0

2X Reaction buffer

12,5

Mồi xuôi (20µM)

0,5

Mồi ngược (20µM)

0,5

Probe (6µM)

...

Mẫu RNA

5,0

Tổng thể tích

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime RT-PCR

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

50 °C

...

1 chu kỳ

95 °C

2 min

95 °C

15 s

40 chu kỳ

60 °C

45 s

Phụ lục D

...

Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng cách sử dụng Haemocytometer

D.1 Các bước thực hiện.

- Làm sạch buồng đếm và nắp kính.

- Nhẹ nhàng khuấy chai nuôi tế bào để trộn đều đồng nhất.

- Hút 200 ul dung dịch tế bào vào ống eppendorf mới, bổ sung 200 ul trypan blue 0.4 %, trộn đều.

- Hút 100 ul dung dịch tế bào và trypan blue vào buồng đếm, nhỏ dung dịch vào cạnh buồng đếm dung dịch sẽ theo mao dẫn đi vào đầy các ngăn.

- Đếm các tế bào còn sống (là các tế bào không bị nhuộm màu trypan blue) tại 4 hình vuông ở 4 góc.

D.2 Tính toán kết quả

Ct = T x Tb x 1/4 x 10⁴

...

Ct: số lượng tế bào ban đầu có trong 1 ml

T: tổng số tế bào tại 4 góc vuông

Tb: hệ số pha loãng giữa dung dịch tế bào với trypan blue

1/4: hệ số góc vuông

10⁴: hệ số chuyển đổi

Ví dụ: Đếm tổng số tế bào tại 4 góc vuông có 480 tế bào, Ct = 480 x 2 x ¼ x 10⁴ = 240.10⁴ =2.4.10⁶ tb/ml.

Phụ lục E

(Quy định)

Công thức tính liều gây nhiễm 50 % tế bào thí nghiệm(TCID50) của Reed- Muench

...

TCID₅₀ = 10^x

Với x được tính như sau:

Trong đó:

là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm vi rút sát trên 50 %, tính bằng phần trăm (%).

là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm vi rút sát dưới 50 %, tính bằng phần trăm (%).

là nồng độ pha loãng vi rút tại A (lấy giá trị số mũ).

...

là nồng độ pha loãng vi rút tại B (lấy giá trị số mũ).

VÍ DỤ:

Nồng độ vi rút pha loãng

Tỷ lệ giếng nhiễm vi rút⁽^a)

Phản ứng

Giá trị cộng dồn

Tỷ lệ giếng nhiễm vi rút, %

Nhiễm

Không nhiễm

...

Không nhiễm

Tỷ số

10^-6

5/5

11/11

...

10^-7

4/5

6/7

10^-8

...

2/6

10^-9

0/5

...

0/9

CHÚ THÍCH: (a) số giếng nhiễm vi rút/số giếng gây nhiễm với lượng nhiễm là 100 µl/giếng. Mũi tên chỉ hướng tăng lên của số nhiễm và số không nhiễm.

Trong 100 µl dung dịch pha loãng vi rút nhiễm vào mỗi giếng có:

Vậy TCID₅₀ là: 10⁷^,⁶⁸/ 100 µl dung dịch pha loãng vi rút.

Phụ lục F

...

Quy trình thực hiện phản ứng ELISA cạnh tranh để phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả loài nhai lại nhỏ

Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể PRRV có bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.Có thể sử dụng ID Screen PPR Competition kit - Code 4P2

F.1 Chuẩn bị nguyên liệu

- Nguyên liệu trong bộ kít (4.3.1) để ở nhiệt độ phòng 30 min trước khi làm phản ứng.

- Pha loãng dung dịch rửa 1X: 10 ml dung dịch nước rửa đặc 10X với 90 ml nước cất khử ion (4.3.2). Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 µl/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng. Thiết lập sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có đối chứng âm (Negative Control - NC), đối chứng dương (Positive Control - PC)

F.2 Cách tiến hành

1 Nhỏ 25 µl Dilution Buffer 13 vào các giếng;

Nhỏ 25 µl Positive Control vào hai giếng A1 và B1

Nhỏ 25 µl Negative Control vào hai giếng C1 và D1

...

2. Ủ dĩa thí nghiệm ở nhiệt độ 37 °C ± 3 °C trong 45 min

3. Đổ bỏ dung dịch trong đĩa; rửa đĩa bằng cách thêm 300 µl dung dịch rửa 1X vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần, tránh làm khô đĩa giữa các lần rửa.

4. Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha loãng Conjuate 10X 1/10 với Dilution Buffer 4

5. Nhỏ 100 µl dung dịch Conjugate 1X vào các giếng;

6. Ủ đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ 21 °C ± 5 °C trong 30 min ± 3 min

7. Đổ bỏ dung dịch trong đĩa; rửa đĩa bằng cách thêm 300 µl dung dịch rửa 1X vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Rửa lặp lại 3 lần, tránh làm khô đĩa giữa các lần rửa

8. Nhỏ 100 µl dung dịch Subtrate Solution vào các giếng;

9. Ủ đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ 21 °C ± 5 °C trong 15 min ± 2 min trong phòng tối

10. Nhỏ 100 µl dung dịch stop Solution (dừng phản ứng) vào các giếng để dừng phản ứng

...

F.3 Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mật độ quang học (OD) của đối chứng âm (ODNC) > 0,7.

- Mật độ quang học của đối chứng dương (ODPC)/OD của đối chứng âm (ODNC) <0,3.

Đánh giá kết quả

+ Mẫu dương tính khi: S/N% ≤ 50%.

+ Mẫu âm tính khi: S/N % > 60%

+ Mẫu có 50% < S/N % ≤ 60% được cho là nghi ngờ.

...

[1] Adombi, C. M., Lelenta, M., Lamien, C. E., Shamaki, D., Koffi, Y. M., Traore, A., & Luckins, A. G. (2011). Monkey CV1 cell line expressing the sheep-goat SLAM protein: a highly sensitive cell line for the isolation of peste des petits ruminants virus from pathological specimens. Journal of Virological Methods, 173(2), 306-313.

[2] Aktas et al, 2011. Peste des petits ruminants in suckling lambs case report Israel journal of veterinary medicine, Vol 66(1).

[3] Ammerman Nicole et al, 2008. Growth and Maintenance of Vero Cell Lines. Curr Protoc Microbiol.

[4] Naveen Kumar et al, 2014. Peste Des Petits Ruminants Virus Infection of Small Ruminants: A Comprehensive Review. Viruses 2014, 6, 2287-2327.

[5] OIE, 2013. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Chapter 2.7.10: Peste des petits ruminants (Infection with peste des petits ruminants virus).

[6] Olivier Kwiateka et al, 2010. Quantitative one-step real-time RT-PCR for the fast detection of the four genotypes of PPRV. Journal of Virological Methods 165, 168-177.