Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-13:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 13

• Số hiệu: TCVN8400-13:2019
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2019

Mục đích	Phương pháp xét nghiệm
	Phân lập Brucella	Realtime PCR	RBT	MRT	EDTA-TAT	ELISA	CFT
Đánh giá vùng/cơ sở an toàn dịch	-	-	++	-	++	+	++
Giám sát để thanh toán dịch bệnh^(a)	-	-	+++	+++	+	++	+++
Giám sát tỷ lệ lưu hành huyết thanh học (đàn)	-	-	+++	+++	+	++	+++
Giám sát định kỳ	-	-	+++	+++	++	++	+++
Khẳng định ca bệnh nghi ngờ	+++	++	+	+	+	+	++
CHÚ THÍCH: +++: Phương pháp phù hợp nhất; ++: Phương pháp phù hợp; +: Phương pháp có thể áp dụng, nhưng có những hạn chế; Phương pháp không phù hợp. (a): Khuyến cáo sử dụng song song 02 phương pháp thích hợp để tăng hiệu quả giám sát.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS)

A.1.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl)

8,5 g

Dipotassium phosphate (K₂HPO₄)

...

...

...

Monotassium Phosphat (KH₂PO₄)

1,0 g

Nước cất

1 000 ml

A.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh pH trong khảng 7.0 ± 0.2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 min, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

A.2  Dung dịch EDTA-PBS

A.2.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl)

...

...

...

Kali clorua (KCl)

0,20 g

Dinatri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

1,15 g

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)

0,20 g

EDTA

3,72 g

Nước cất

...

...

...

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh pH trong khảng 7.2 ± 0.2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 min, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

A.3  Dung dịch Veronal buffer calcium magnesium, pH 7.2 (VB)

A.3.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl)

8,5 g

Barbital

0,575 g

Diethylmalonylurea sodium

...

...

...

Magie clorua (MgCl₂.6 H₂O)

0,168 g

Can xi clorua (CaCl₂)

0,028 g

Nước cất

1 000 ml

A.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh pH trong khảng 7.2 ± 0.2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 min, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 2 tháng.

A.4  Môi trường thạch TSA

...

...

...

VÍ DỤ: dùng môi trường thạch TSA (Tryptic soy agar) của hãng Merck (Cat. No. 105458)

Chuẩn bị môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.5  Môi trường thạch máu

Môi trường thạch máu: sử dụng môi trường thương mại, pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng môi trường thạch máu cơ bản (Blood agar base) của hãng Merck (Cat. No. 110886)

Chuẩn bị môi trường thạch máu cơ bản theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Vô trùng môi trường thạch máu cơ bản ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.1.6). Đợi nhiệt độ của môi trường thạch máu cơ bản đã vô trùng khoảng từ 45 °C đến 50 °C thì bổ sung máu từ 5 % đến 8 % máu thỏ, hoặc máu bê đã loại bỏ fibrin. Lắc đều và chia ra đĩa petri (5.2.5) khoảng 10 ml/ đĩa. Kiểm tra vô trùng môi trường trong tủ ấm (5.4.1) trong 24 h. Bảo quản môi trường ở điều kiện 5 °C ± 3 °C.

A.6  Môi trường thạch u rê cơ bản (Urea agar base - Christensen)

A.6.1  Thành phần

...

...

...

1 g

Dextrose

1 g

Sodium chloride

5 g

Dinatri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

1,2 g

Monotassium phosphat (KH₂PO₄)

0,8 g

...

...

...

0,012 g

Agar

15 g

Nước cất

950 ml

A.6.2  Chuẩn bị

Hòa tan 24 g thạch u rê cơ bản trong 950 ml nước, đun nóng cho tới tan hoàn toàn. Điều chỉnh pH: 6.8 ± 0.2 ở 25 °C. Hấp bằng nồi hấp (5.1.6) trong 20 min. Để nguội ở nhiệt độ phòng cho đến khi môi trường còn khoảng 50 °C, thêm 50 ml dung dịch urê 40 % (4.1.7). Lắc đều, chia ra ống nghiệm (5.2.4) khoảng từ 3 ml đến 5 ml và để nghiêng 30° ở nhiệt độ phòng cho môi trường đông lại. Kiểm tra vô trùng môi trường trong tủ ấm (5.4.1) trong 24 h. Bảo quản môi trường ở 5 °C ± 3 °C.

A.7  Môi trường Farrell’s cải tiến

- Lấy 1 lít môi trường thạch cơ bản (có thể dùng thạch TSA), đun thạch và để nguội đến 56 °C, sau đó bổ sung 5 % huyết thanh bê (4.1.5) và thêm các thành phần kháng sinh sau:

...

...

...

5 mg

Bacitracin:

25 mg

Natamycin:

50 mg

Nalidixic acid:

5 mg

Nystatin:

100.000 đơn vị

...

...

...

20 mg

Trộn đều, đổ ra đĩa petri, đậy nắp và bao gói, bảo quản môi trường ở 5 °C ± 3 °C, sử dụng tốt nhất trong vòng 8 ngày.

A.8  Môi trường thạch CITA

- Lấy 1 lít môi trường thạch máu cơ bản, đun thạch và để nguội đến 56 °C, sau đó bổ sung 5 % huyết thanh bê và thêm các thành phần kháng sinh sau:

Nistatin:

100.000 đơn vị

Nitrofurantoin:

10 mg

Amphotericin B:

...

...

...

Colistin methanesulfonate:

7,5 mg

Vancomycin:

20 mg

Trộn đều, đổ ra đĩa petri, đậy nắp và bao gói, bảo quản môi trường ở 5 °C ± 3 °C, sử dụng tốt nhất trong khoảng 8 ngày.

A.9  Môi trường canh thang Brucella

A.9.1  Thành phần

Enzymatic digest of casein:

10 g

...

...

...

10 g

Yeast extract:

2 g

Sodium chloride:

5 g

Dextrose:

1 g

Sodium bisulfite:

0,1 g

...

...

...

1.000 ml

A.9.2  Chuẩn bị

Điều chỉnh pH: 7.0 ± 0.2 ở 25 °C, hấp 121 °C trong thời gian 15 min, để nguội đến 56 °C

Sau đó bổ sung vào 1 lít môi trường những thành phần sau:

Huyết thanh ngựa:

50 ml

Polymyxin B:

5.000 đơn vị

Bacitracin:

...

...

...

Nystatin:

100.000 đơn vị

Cycloheximide:

100 mg

Trộn đều, đổ ra đĩa petri, đậy nắp và bao gói, bảo quản môi trường ở 5 °C ± 3 °C, sử dụng tốt trong vòng 8 ngày.

Phụ lục B

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

...

...

...

B.1.1  Dung dịch tím tinh thể

B.1.1.1  Thành phần

Tím tinh thể (C₂₅H₃₀N₃Cl)

2,0 g

Etanol 95 % (thể tích)

20 ml

Amoni oxalat [(NH₄)₂C₂O₄.2H₂O]

0,8 g

Nước cất

...

...

...

B.1.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

B.1.2  Dung dịch fuchsin đậm đặc

B.1.2.1  Thành phần

Fuchsin cơ bản (C₂₀H₂₀CIN₃)

1,0 g

Etanol 95 % (thể tích)

10 ml

Phenol (C₆H₆O)

...

...

...

Nước cất

100 ml

B.1.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan Fuchsin cơ bản trong etanol và hòa tan phenol trong nước. Sau đó trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết. Khi dùng, pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ 1:10 (v/v)

B.1.3  Dung dịch lugol

B.1.3.1  Thành phần

Kali iodua (KI)

2,0 g

Iốt (I₂) tinh thể

...

...

...

Nước cất

200 ml

B.1.3.2  Chuẩn bị

Nghiền kali iodua và iốt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

B.1.4  Cồn axeton

B.1.4.1  Thành phần

Etanol 95 % (thể tích)

03 phần

Axeton (C₂H₆O)

...

...

...

B.1.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan và lắc đều 2 dung dịch này với nhau theo tỷ lệ

B.2  Cách tiến hành

Bước 1: nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Bước 2: nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Bước 3: nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Bước 4: nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc để khô.

B.3  Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (5.2.1).

...

...

...

Phụ lục C

(Quy định)

Các phản ứng sinh hóa

C.1  Đặc điểm sinh hóa của các loài vi khuẩn Brucella.

Bảng C.1- Một số đặc trưng của các loài Brucella

Loài

Biovar

PỨ ngưng kết huyết thanh đơn dòng đặc hiệu

Hình thái khuẩn lạc

...

...

...

Phản ứng oxidase

Phản ứng urease

A

M

R

B. abortus

1, 2, 3

+

-

...

...

...

S

+

+

+

4

-

+

-

5

...

...

...

+

-

6

+

-

-

9

-

+

...

...

...

B. suis

1

+

-

-

S

-

+

+

...

...

...

+

-

-

3

+

-

-

4

+

...

...

...

-

5

-

+

-

B. melitensis

1

-

+

...

...

...

S

-

+

+

2

+

-

-

3

...

...

...

+

-

B. ovis

-

-

+

R

-

-

...

...

...

B. canis

-

-

+

R

-

-

+

B. neotomae

...

...

...

-

-

S

+

+

+

CHÚ THÍCH: S: khuẩn lạc nhẵn, R: khuẩn lạc nhám, +: Dương tính

C.2  Phản ứng phân giải urê

C.2.1  Sử dụng que cấy (5.2.7) lấy vi khuẩn thuần khiết từ các đĩa thạch TSA hoặc thạch máu (7.2.2.5) cấy vào ống nghiệm đựng môi trường urea agar base - Christensen (xem A.6, Phụ lục A)

...

...

...

C.2.3  Đánh giá kết quả

- Phản ứng âm tính: môi trường (C.2.2) không thay đổi màu.

- Phản ứng dương tính: môi trường (C.2.2) chuyển từ màu vàng sang màu tím.

C.3  Phản ứng oxidaza

Phản ứng được tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% tetra methyl p-phenyl diamine dihydrochloride (4.1.4)

C.3.1  Dùng que cấy (5.2.7) lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch TSA hoặc thạch máu (7.2.2.5) chà sát lên trên mặt giấy (4.1.4).

C.3.2  Đánh giá kết quả

- Phản ứng dương tính: khi giấy tẩm (C.3.1) xuất hiện màu hồng đậm sau 30 s.

- Phản ứng âm tính: khi giấy tẩm (C.3.1) giữ nguyên màu.

...

...

...

- Đặt phiến kính (5.2.3) trong đĩa lồng petri (5.2.5).

- Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn (4.1.3) vào một ô trên phiến kính và nhỏ một giọt nước sinh lý (4.1.1) vào một ô khác làm đối chứng âm.

- Lấy một lượng nhỏ khuẩn lạc trên môi trường thạch TSA hoặc thạch máu (7.2.2.5) trộn đều với kháng huyết thanh chuẩn (4.1.3), một phần khuẩn lạc khác trộn đều với nước sinh lý (4.1.1). Để ở nhiệt độ phòng trong 5 min.

- Đánh giá kết quả:

+ Phản ứng dương tính: khi có hiện tượng ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn.

+ Phản ứng âm tính: không có hiện tượng ngưng kết giống như đối chứng âm tính.

Phụ lục D

(Tham khảo)

...

...

...

Tách chiết ADN bằng bộ kít DNeasy Blood Tissue Kit (Code: 69504)

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

D.1  Chuẩn bị

- Thêm Ethanol (96-100 %) vào buffers AW1* và AW2+ trước khi sử dụng theo hướng dẫn ở trên nhãn.

- Buffers ATL and AL* có thể kết tủa khi lưu giữ. Nếu có kết tủa, hâm nóng buffer ở 56 °C cho đến khi tan hết.

D.2  Cách tiến hành

D.2.1  Hút 250 µl hỗn dịch (7.1.3.1), mẫu dịch tiết (7.1.3.2) hoặc mẫu canh khuẩn (7.2.1.2) cho vào ống eppendorf 1.5 ml (5.3.5).

D.2.2  Thêm 180 µl buffer ATL vào ống D.2.1.

D.2.3  Thêm 20 µl proteinase K, trộn nhẹ bằng máy lắc trộn vortex (5.1.4), ủ ở bể điều nhiệt (5.3.3) cho đến khi mẫu bị dung giải hoàn toàn. Thỉnh thoảng vortex mẫu trong khoảng 15 s. Thời gian dung giải mẫu có thể từ 1 h - 3 h.

...

...

...

D.2.5  Hút toàn bộ hỗn hợp (D.2.4) vào ống cột lọc đặt trong ống thu. Ly tâm 8000 rpm trong thời gian 1 min. Bỏ ống thu cùng dịch đã qua ly tâm.

D.2.6  Đặt cột lọc vào ống thu mới. Thêm 500 µl buffer AW1. Ly tâm 8000 rpm trong thời gian 1 min. Bỏ ống thu và dịch đã qua ly tâm.

D.2.7  Đặt cột lọc trong ống thu mới. Thêm 500 µl buffer AW2. Ly tâm 8000 rpm trong thời gian 3 min. Bỏ ống thu và dịch đã qua ly tâm.

D.2.8  Đặt cột lọc vào trong ống eppendorf (5.3.5). Thêm 200 µl buffer AE thẳng vào màng ống cột lọc (không được chạm đầu típ vào màng). Để ở nhiệt độ phòng 1 min, rồi ly tâm 8000 rpm trong 1 min. Bỏ cột lọc, giữ và bảo quản mẫu ADN thu được trong ống (5.3.5) trong tủ âm (5.1.2).

CHÚ THÍCH:

1) Bước D.2.1 và D.2.8 ghi mã hiệu mẫu ở cả nắp và thân ống nghiệm để tránh mất nhãn mẫu. Ống nghiệm ở bước D.2.8 là ADN tổng số dùng cho phản ứng PCR và lưu mẫu ở âm 20 °C, nên có thể ghi thêm các thông tin khác nếu cần.

2) Khi chuyển mẫu vào cột lọc (D.2.5), thì không được ghi mã hiệu mẫu vào phần thân cột, để tránh tạp nhiễm mẫu.

3) Chuyển ống cột lọc ra (D.2.7) phải cẩn thận, tránh chạm đáy ống vào dung dịch ở ống thu. Nếu chạm vào, cần ly tâm lại. Nếu dung dịch không xuống hết ống thu, ly tâm lại. Tốt nhất là chuyển sang ống thu mới và ly tâm ở tốc độ tối đa 14.000 rpm thêm 1 min nữa.

4) Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu kiểm tra.

...

...

...

Phụ lục E

(Tham khảo)

Trình tự các cặp mồi, mẫu dò và chu trình nhiệt cho phản ứng realtime PCR

Bảng E.1 - Trình tự các cặp mồi, mẫu dò cho phản ứng realtime PCR

Loài

Cặp mồi, mẫu dò

Trình tự (5’-3’)

Nguồn tham khảo

Brucella sp (IS711)

...

...

...

GCTCGGTTGCCAATATCAATGC

William và cs (2004)

Mồi ngược

GGGTAAAGCGTCGCCAGAAG

Mẫu dò

FAM-AAATCTTCCACCTTGCCCTTGCCATCA-BHQ1

B. abortus (gen BruAb2-0168)

Mồi xuôi

GCACACTCACCTTCCACAACAA

...

...

...

Mồi ngược

CCCCGTTCTGCACCAGACT

Mẫu dò

FAM-TGGAACGACCTTTGCAGGCGAGATC-BHQ1

B. melitensis (gen BME II0466)

Mồi xuôi

TCGCATCGGCAGTTTCAA

Hinić và cs (2008)

Mồi ngược

...

...

...

Mẫu dò

Cy5-CCTCGGCATGGCCCGCAA-BHQ2

B. suis (gen R0952)

Mồi xuôi

CCTGCAAAAAGCAGGAACCA

Hinić và cs (2008)

Mồi ngược

CCTCCGCCAGTCGTGAAA

Mẫu dò

...

...

...

GHI CHÚ:

- Trình tự cặp mồi và mẫu dò trong Bảng E.1 được tiêu chuẩn khuyến cáo sử dụng. Các phòng thí nghiệm có thể sử dụng các cặp mồi, mẫu dò khác được Tổ chức Thú y thế giới (OIE) hoặc Phòng Thí nghiệm tham chiếu của OIE về bệnh sảy thai truyền nhiễm khuyến cáo sử dụng.

Bảng E.2 - Thành phần phản ứng realtime PCR

(Sử dụng kit TaqPath™ qPCR Master Mix, hãng ABI, Cat no: A15297)

Thành phần

Thể tích

(µl)

Nước tinh khiết không có nuclease

...

...

...

Dung dịch đệm (2X)

12,5

Mồi xuôi (20 µM)

0,5

Mồi ngược (20 µM)

0,5

Mẫu dò (6 µM)

0,5

Tổng thể tích

...

...

...

Bảng E.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

(Áp dụng cho kit TaqPath™ qPCR Master Mix, hãng ABI, Cat no: A15297[3])

Vi khuẩn đích

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

Brucella sp

95 °C

5 min

...

...

...

95 °C

15 s

40 chu kỳ

57 °C

60 s

B. abortus/ melitensis/suis

95 °C

5 min

1 chu kỳ

...

...

...

15 s

40 chu kỳ

60 °C

45 s

Phụ lục F

(Quy định)

Phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm (EDTA-TAT)

F.1  Tiến hành phản ứng

...

...

...

- Chuẩn bị 5 ống nghiệm thủy tinh (5.2.4) đánh dấu thứ tự từ 1 đến 5, lấy kháng nguyên đã pha loãng cho vào các ống theo thứ tự từ 1 đến 5 với thể tích như sau: 2,0; 1,0; 1,0; 1,0 và 1,0 ml.

- Cho 0,08 ml huyết thanh kiểm tra (7.1.3.4) vào ống 1.

- Trộn đều và pha loãng bằng cách chuyển 1 ml huyễn dịch từ ống 1 sang ống 2, trộn đều và chuyển 1 ml từ ống 2 sang ống 3, tiếp tục đến ống thứ 5 và bỏ 1 ml cuối cùng. Như vậy các ống có độ pha loãng của huyết thanh theo thứ tự là: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400.

- Ủ trong tủ ấm (5.4.1) trong thời gian 48 h.

Các bước tiến hành được tóm tắt ở bảng dưới đây:

Bảng F.1 - Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm

Các bước

Nguyên liệu

Thứ tự các ống nghiệm

...

...

...

2

3

4

5

Pha loãng

Kháng nguyên 1:100, (ml)

2.0

1.0

1.0

...

...

...

1.0

Huyết thanh kiểm tra (µl)

0.08

Chuyển 1 ml từ ống 1 sang ống 2, trộn đều, chuyển tiếp tuc đến ống 5 rồi hút bỏ 1 ml

Hiệu giá huyết thanh pha loãng

1:25

1:50

1:100

1:200

...

...

...

Hiệu giá tính theo ĐV quốc tế (lU/mL)

25

50

100

200

400

Trộn đều và ủ 37 °C trong thời gian 48 h

F.2  Đánh giá kết quả.

Đánh giá kết quả theo Bảng F.2.

...

...

...

Độ pha loãng

Đàn không tiêm vắc xin

Đàn tiêm vắc xin

1:25

1:50

1:100

1:200

-

-

...

...

...

-

Âm tính

Âm tính

I

-

-

-

Âm tính

Âm tính

...

...

...

-

-

-

Âm tính

Âm tính

+

I

-

-

...

...

...

Âm tính

+

+

-

-

Nghi ngờ

Âm tính

+

+

...

...

...

-

Nghi ngờ

Nghi ngờ

+

+

+

-

Dương tính

Nghi ngờ

...

...

...

+

+

I

Dương tính

Nghi ngờ

+

+

+

+

...

...

...

Dương tính

CHÚ THÍCH: I: Ngưng kết không hoàn toàn; (+): Ngưng kết; Không ngưng kết

Phụ lục G

(Quy định)

Phản ứng kết hợp bổ thể (CFT)

G.1  Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng CFT

G.1.1  Kháng nguyên

- Kháng nguyên (4.3.4) được pha loãng tới nồng độ làm việc và bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

+ Kháng nguyên được pha loãng trong dung dịch nước sinh lý (4.1.1) và phenol ở nồng độ 0,5 % hoặc dung dịch VB (theo A.3, Phụ lục A).

+ Cho phản ứng ức chế dung huyết 50 % với huyết thanh chuẩn ở độ pha loãng 1/200 (theo H.1, phụ lục H).

G.1.2  Huyết thanh chuẩn

Huyết thanh chuẩn (4.3.1) được pha loãng tới một nồng độ nhất định để đưa ra hiệu giá dương tính dự kiến.

G.1.3  Hồng cầu cừu 2,5 %

Hồng cầu cừu (4.3.6) 50 % được pha loãng 1/20 trong dung dịch VB (xem A.3, Phụ lục A) để được nồng độ 2,5 %.

G.1.4  Chuẩn độ dung huyết tố (H)

G.1.4.1  Pha loãng dung huyết tố (4.3.7) ở nồng độ 1/250 (10 µl dung huyết tố + 2490 µl VB).

G.1.4.2  Từ nồng độ 1/250, pha một dãy các nồng độ khác nhau theo bảng G.1

...

...

...

Thành phần

Hiệu giá pha loãng thứ cấp

1/2

1/4

1/8

1/12

1/16

1/20

1/24

...

...

...

50

50

50

50

50

50

50

VBS, µl

50

...

...

...

350

550

750

950

1150

HG pha loãng cuối cùng

1/500

1/1000

1/2000

...

...

...

1/4000

1/5000

1/6000

G.1.4.3  Chuẩn bị bổ thể 1/10: bổ thể (4.3.5) được pha loãng 1/10 trong dung dịch VB (theo A.3, phụ lục A).

G.1.4.4  Chuyển 25 µl của mỗi nồng độ pha loãng dung huyết tố sang một dãy giếng trong đĩa 96 giếng (5.4.7) theo bảng G.2

G.1.4.5  Thêm 25 µl hỗn dịch hồng cầu cừu 2,5 % vào tất cả các giếng.

G.1.4.6  Cho 50 µl VB (A.3, phụ lục A) vào tất cả các giếng (riêng giếng đầu tiên cho 75 µl).

G.1.4.7  Thêm 25 µl bổ thể 1/10 (G.1.4.3) vào tất cả các giếng (trừ giếng đầu tiên).

G.1.4.8  Lắc đĩa hoặc vỗ nhẹ vào thành đĩa để trộn đều, đậy nắp và ủ trong tủ ấm (5.4.1) trong 30 min.

...

...

...

G.1.4.10  Đánh giá kết quả:

+ Đối chứng dung huyết tố: không có hiện tượng dung huyết.

+ Tại nồng độ pha loãng cao nhất gây 100 % dung huyết hồng cầu cừu được xác định là 01 đơn vị dung huyết tố (MHD-Minimum Haemolytic Dose).

+ Sử dụng 02MHD để tiến hành phản ứng CFT.

VÍ DỤ: Từ giếng 2 đến giếng 5 có nhiều dung huyết tố làm tan 100% hồng cầu cừu. Từ giếng 6 đến giếng 9 ít dung huyết tố, do đó không tan hết hồng cầu cừu. Vì vậy, giếng thứ 5 được xác định là 01 đơn vị dung huyết tố, tương ứng với độ pha loãng 1/2000. Hai đơn vị MHD = 1/2000 x 2 = 1/1000 (lấy haemolysin ở nồng độ pha loãng 1/1000 được sử dụng làm phản ứng)

Bảng G.2 - Sơ đồ phản ứng chuẩn độ dung huyết tố

Thành phần

Thứ tự các giếng

1

...

...

...

3

4

5

6

7

8

9

Hiệu giá đã pha loãng

1/250*

...

...

...

1/500

1/1000

1/2000

1/3000

1/4000

1/5000

1/6000

Dung huyết tố, µl

25

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

SRBC 2.5%, µl

25

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

VB, µl

75

...

...

...

50

50

50

50

50

50

50

Bổ thể 1/10,

-

...

...

...

25

25

25

25

25

25

25

Trộn đều và ủ trong tủ ấm (5.4.1) trong 30 min

Ly tâm đĩa ở tốc độ 200 g - 400 g/5 min -10 min

...

...

...

G.1.5  Chuẩn độ bổ thể chứa 6 đơn vị dung huyết tố 50 % (6CH50)

G.1.5.1  Bổ thể (4.3.5) được hoàn nguyên theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bổ thể sau khi hoàn nguyên nếu không sử dụng ngay phải bảo quản ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C cho tới khi thực hiện phản ứng trong ngày. Phần còn lại bảo quản ở nhiệt độ ≤ âm 16 °C.

G.1.5.2  Pha loãng bổ thể (4.3.5) ở nồng độ 1/100 trong dung dịch VB (50 µl bổ thể + 4500 µl dung dịch VB).

G.1.5.3  Tiếp tục pha loãng bổ thể thành một dãy nồng độ và cho các thành phần của phản ứng theo sơ đồ trong bảng G.3.

Bảng G.3 - Sơ đồ phản ứng chuẩn độ bổ thể

Thành phần

Dãy ống nghiệm

Đối chứng

1

...

...

...

3

4

5

6

7

8

9

10

11

...

...

...

13

H100

H0

C 1/100, µl

40

50

60

70

80

...

...

...

100

110

120

130

140

150

160

400

0

...

...

...

160

150

140

130

120

110

100

90

80

...

...

...

60

50

40

0

0

Kháng nguyên, µl

200

200

200

...

...

...

200

200

200

200

200

200

200

200

200

...

...

...

200

VB, µl

200

200

200

200

200

200

200

...

...

...

200

200

200

200

200

0

400

Lắc đều và ủ trong bể điều nhiệt (5.4.2) trong 30 min

CHÚ THÍCH: H100: Ống gây 100 % dung huyết; H0: Ống không gây dung huyết.

...

...

...

G.1.5.5  Lắc đều và ủ trong bể điều nhiệt (5.4.2) trong 30 min.

G.1.5.6  Ly tâm (5.4.6) ở tốc độ 400 g - 800 g/5 min - 10 min.

G.1.5.7  Xác định đơn vị dung huyết 50 % của bổ thể (CH₅₀):

- Trộn một thể tích (500 µl) nước trong của ống H0 hoặc dung dịch VB với một thể tích tương đương (500 µl) nước trong của ống H100. Trong trường hợp không có ống xuất hiện 100 % dung huyết, thì lấy 400 µl trộn với 1600 µl hệ thống dung huyết (SRBCs) để thành ống có 50 % dung huyết (H50). Ống nào trong dãy phản ứng có màu sắc giống với ống H50 được xác định là ống gây 50 % dung huyết.

- Tính toán số lượng bổ thể ban đầu cần cho phản ứng CFT (V_c):

Trong đó: V_Ci: Thể tích bổ thể ở nồng độ pha loãng 1/100

ΣV: Tổng thể tích bổ thể ở nồng độ pha loãng 1/100 pha loãng trong dung dịch VB.

C_i: Nồng độ bổ thể pha loãng ban đầu.

...

...

...

V_CFT: Thể tích bổ thể cần cho 01 phản ứng CFT.

n: Số lượng phản ứng

Ví dụ: số lượng giếng phản ứng là 100; mỗi giếng sử dụng 25 µl bổ thể ở hiệu giá pha loãng. Lượng bổ thể cần = 100 x 25 µl = 2500 µl. Trong quá trình chuẩn độ bổ thể, xác định được ống thứ 7 gây 50 % dung huyết (H50),

Thể tích bổ thể ban đầu cần cho phản ứng = x 6 x 25 x 100 = 75 µl

Lấy 75 µl bổ thể tinh khiết pha loãng trong 2425 µl trong dung dịch VB được 6CH₅₀

G.2  Cách tiến hành phản ứng CFT (xem sơ đồ tại bảng G.4)

- Vô hoạt mẫu huyết thanh (7.1.3.4) và huyết thanh đối chứng (G.1.2) ở bể điều nhiệt (5.4.2) trong 30 min.

- Cho 50 µl dung dịch VB (A.3, phụ lục A) vào giếng 1 và 25 µl dung dịch VB vào giếng 2,4,5,6,7,8.

- Cho 50 µl huyết thanh kiểm tra (đã vô hoạt 59 °C ± 1 °C trong 30 min) vào giếng 1, trộn đều.

...

...

...

- Trộn đều giếng 2 và hút bỏ đi 25 µl.

- Bổ sung thêm 25 µI dung dịch VB vào giếng 1 và 2 để bù vào lượng còn thiếu (giếng 1 và 2 là đối chứng kháng bổ thể).

- Trộn đều huyết thanh và dung dịch VB ở giếng 4 và chuyển từ giếng 4 sang giếng 5, trộn đều và chuyển sang giếng 6, làm tương tự cho đến giếng 8 rồi hút bỏ 25 µl.

- Cho 25 ul kháng nguyên (G.1.1) vào tất cả các giếng, trừ 02 giếng đầu tiên.

- Cho 25 µl bổ thể 6CH₅₀ (G.1.5) vào tất cả các giếng.

- Ủ đĩa phản ứng ở 4 °C qua đêm, hoặc 37 °C ± 2 °C trong 30 min. Nếu ủ qua đêm ở 4 °C thì trước khi đem làm tiếp phải cho vào tủ ấm (5.4.1) trong khoảng 10 min.

- Chuẩn bị hệ thống dung huyết (SRBCs): trộn 1 phần hồng cầu cừu 2,5 % với 1 phần dung huyết tố 2MHD100. Lắc nhẹ để trộn đều, để ở nhiệt độ phòng trong 20 min trước khi tiến hành phản ứng và thỉnh thoảng lại lắc nhẹ lên.

- Cho 50 µl hệ thống dung huyết vào tất cả các giếng, trộn đều và cho vào tủ ấm (5.4.1) trong 30 mln.

- Ly tâm đĩa (5.4.6) ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C trong 10 min, hoặc để ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C trong 2 h - 3 h, sau đỏ đánh giá kết quả.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Khi tiến hành phản ứng phải có một mẫu đối chứng dương (dùng huyết thanh dương tính chuẩn có độ dương tính thấp) và mẫu đối chứng âm tính được tiến hành song song với mẫu kiểm tra. Cách làm tương tự như với mẫu huyết thanh.

G.3  Đánh giá kết quả

- Điều kiện của phản ứng:

Phản ứng có giá trị khi

+ Đối chứng kháng nguyên: 100 % dung huyết

+ Đối chứng bổ thể: 100 % dung huyết

+ Đối chứng hệ thống dung huyết: 0 % dung huyết

+ Đối chứng âm: 100 % dung huyết

...

...

...

+ Đối chứng huyết thanh kháng bổ thể: 100 % dung huyết ở giếng 1 và 2.

- Đánh giá kết quả:

Kết quả được đánh giá mức độ dung huyết, hoặc ngưng kết theo Bảng G.5.

Bảng G.5 - Bảng đánh giá phản ứng kết hợp bổ thể

Mức độ

Dung huyết (%)

Ngưng kết (%)

++++ (4+)

0

...

...

...

+++ (3+)

25

75

++ (2+)

50

50

+ (1+)

75

25

...

...

...

100

0

Phản ứng được đọc ở độ pha loãng cao nhất mà tại đó phản ứng vẫn xảy ra ở mức ngưng kết 1+ hoặc lớn hơn. Sau khi đọc kết quả, hiệu giá kháng thể phải được qui đổi sang đơn vị kết hợp bổ thể quốc tế theo Bảng G.6. Mẫu được coi là dương tính khi có hiệu giá ≥ 20 ICFTU/ml.

Bảng G.6 - Qui đổi hiệu giá huyết thanh sang đơn vị ICFTU/ml

Độ pha loãng huyết thanh

Ức chế dung huyết (Ngưng kết)

25 % (+)

50 % (++)

75 % (+++)

...

...

...

1/2

8,33

10

11,67

13,33

1/4

16,67

20

23,33

...

...

...

1/8

33,33

40

46,67

53,33

1/16

66,67

80

93,33

...

...

...

1/32

133,33

160

187

213,33

1/64

266,67

320

373,33

...

...

...

1/128

533,33

640

746,67

853,33

1/256

1066,67

1280

1493,33

...

...

...

Phụ lục H

(Quy định)

Kiểm soát hiệu giá kháng nguyên dùng cho phương pháp CFT, RBT và MRT

Việc kiểm soát kháng nguyên chỉ áp dụng trong trường hợp phòng thí nghiệm tự sản xuất kháng nguyên chuẩn để sử dụng cho phản ứng huyết thanh học, nhằm đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng nguyên trước khi thực hiện xét nghiệm, đảm bảo tính chính xác của phương pháp thử.

H.1  Kiểm soát kháng nguyên Brucella dùng cho phản ứng CFT

H.1.1  Pha loãng huyết thanh chuẩn (4.3.1) ở nồng độ 1/50 trong dung dịch VB.

H.1.2  Tiếp tục pha loãng (H.1.1) trong một dãy ống nghiệm theo tỷ lệ 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % trong dung dịch VB (theo sơ đồ tại bảng H.1).

Bảng H.1 - Sơ đồ pha loãng huyết thanh chuẩn

...

...

...

Hiệu giá pha loãng

1/50

0,8 %

0,7 %

0,6 %

0,5 %

0,4 %

0,3 %

0,2 %

...

...

...

0,1

-

-

-

-

-

-

-

VB (ml)

...

...

...

0,6

0,65

0,7

0,75

0,8

0,85

0,9

Huyết thanh chuẩn 1/50, ml

-

...

...

...

0,35

0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

H.1.3  Pha loãng kháng nguyên theo Bảng H.2 (kháng nguyên có thể pha loãng tùy theo nồng độ vi khuẩn).

Bảng H.2 - Sơ đồ pha loãng kháng nguyên

Thành phần

...

...

...

1/60

1/80

1/100

1/120

1/140

2,5 %

1,66 %

1,25 %

1%

...

...

...

0,71 %

Kháng nguyên chuẩn (ml)

0,1

-

-

-

-

-

VB (ml)

...

...

...

0,25

0,50

0,75

1,0

1,25

Kháng nguyên chuẩn 2.5% (ml)

-

0,50

0,50

...

...

...

0,50

0,50

H.1.4  Thực hiện phản ứng CFT (theo phụ lục G) bằng cách xét nghiệm từng nồng độ pha loãng huyết thanh với từng nồng độ kháng nguyên pha loãng.

H.1.5  Đánh giá kết quả:

Hiệu giá kháng nguyên trong phản ứng CFT phải cho phản ứng ức chế dung huyết 50 % với huyết thanh chuẩn ở độ pha loãng 1/200 (0,5 %).

Bảng H.3 - Ví dụ về đọc và đánh giá kết quả hiệu giá kháng nguyên

Huyết thanh chuẩn, ml

0,8%

0,7%

...

...

...

0,5%

0,4%

0,3%

0,2%

Hiệu giá kháng nguyên

1/40

50%

25%

...

...

...

0

0

0

0

1/60

<75%

<50%

25%

0

...

...

...

0

0

1/80

75%

<75%

<50%

25%

0

0

...

...

...

1/100

75%

75%

>50%

50%(*)

<25%

0

0

1/120

...

...

...

75%

>50%

50%

25%

0

0

1/140

100%

75%

...

...

...

<50%

25%

0

0

CHÚ THÍCH: (*) Kết quả kháng nguyên ở nồng độ 1/100 cho phản ứng ức chế 50 % với huyết thanh chuẩn ở độ pha loãng 1/200 là đạt yêu cầu

H.2  Kiểm soát hiệu giá kháng nguyên dùng cho phản ứng RBT

H.2.1  Pha loãng huyết thanh chuẩn (4.3.1) ở nồng độ 1/25 trong nước sinh lý (4.1.1).

H.2.2  Tiếp tục pha loãng (H.2.1) trong một dãy ống nghiệm theo Bảng H.4 thành các nồng độ pha loãng 1/40, 1/45, 1/50, 1/55, 1/100.

Bảng H.4 - Sơ đồ pha loãng huyết thanh chuẩn

...

...

...

H.2.3  Thực hiện phản ứng RBT (xem 7.4.1).

H.2.4  Đánh giá kết quả:

Kháng nguyên dùng cho phản ứng RBT phải cho kết quả dương tính với huyết thanh chuẩn ở độ pha loãng 1/45 và phản ứng âm tính ở độ pha loãng 1/55 là đạt yêu cầu.

H.3  Kiểm soát kháng nguyên dung cho phản ứng MRI

H.3.1  Pha loãng huyết thanh chuẩn (4.3.1) ở nồng độ 1/5 trong nước sinh lý (4.1.1).

H.3.2  Tiếp tục pha loãng huyết thanh (H.3.1) trong một dãy ống nghiệm thành các nồng độ pha loãng 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 (xem Bảng H.5).

Bảng H.5 - Sơ đồ pha loãng huyết thanh chuẩn

H.3.3  Chuyển 05 ống huyết thanh đã pha loãng ở 5 nồng độ tương ứng trên và pha loãng 1/10 trong mẫu sữa âm tính, thành các nồng độ pha loãng tương ứng 1/20, 1/100, 1/200, 1/500 và 1/1000.

...

...

...

H.4.4  Đánh giá kết quả:

Kháng nguyên dùng cho phản ứng MRT phải cho kết quả dương tính với huyết thanh chuẩn ở độ pha loãng 1/500 và phản ứng âm tính ở độ pha loãng 1/1.000 là đạt yêu cầu.

CHÚ THÍCH:

1) Khi tiến hành đánh giá nồng độ kháng nguyên, phải tiến hành đánh giá trên các mẫu huyết thanh chuẩn âm tính (ít nhất 05 mẫu).

2) Quy trình sản xuất kháng nguyên phải tuân thủ yêu cầu của Tổ chức Thú y thế giới (Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, chương 2.1.4).

Thư mục tài liệu tham khảo

[1]. OIE (Office International des Epizooties). Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines (May 2016). Chương 2.1.4. Brucellosis (Brucella abortus, B. melitensis and B. suis) (infection with B. abortus, B. melitensis and B. suis)

[2]. Council Directive 64/432/EEC and Decision 2004/226/EC as regards diagnostic tests for bovine brucellosis.

...

...

...

[4]. William S. Probert, Kimmi N. Schrader, and Margot H. Real-Time Multiplex PCR Assay for Detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. Journal of Clinical Microbiology. 2004;42(3):1290-1293.

[5]. Brucellosis: Serological tests. OIE reference laboratory for Brucellosis in Thailand. National Institute of Animal Health.

[6]. Hinić V, Brodard I, Thomann A, Cvetnić Z, Makaya PV, Frey J, Abril C. Novel identification and differentiation of Brucella melitensls, B. abortus, B. suis, B. ovis, B. canis, and B. neotomae suitable for both conventional and real-time PCR systems. J Microbiol Methods. 2008 Oct;75(2):375-8.

[7]. A. Daugaliyeva, S. Peletto, A. Sultanov, S. Baramova, P.L. Acutis, A. Adambaeva O. Tusipkanuly, B. Usserbayev. Development of a Differential PCR Assay for Detection of Brucella abortus and Brucella melitensis: an Analytical Approach for Monitoring of Brucella spp. in Foods of Animal Origin. Journal of Food Quality and Hazards Control 3 (2016) 53-59

[8]. Sung-ll Kang, Moon Her, Jong Wan Kim, Ji-Yeon Kim, Kyung Yuk Ko, Yun-Mi Ha, and Suk Chan Jung. Advanced Multiplex PCR Assay for Differentiation of Brucella Specie. Applied and environmental, Sept. 2011, p. 6726-6728

[9]. Marília Cristina Sola, Eurlone A.G. da Veiga Jardim, Marcius Ribeiro de Freitas, Albenones José de Mesquita. Real-time PCR detection of Brucella spp. ADN in lesions and viscera of bovine carcasses. Journal of Microbiological Methods 104 (2014) 87-91.

[1] Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

[2] Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

[3] Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương. Khi sử dụng nên tuân thủ theo khuyến cáo của nhà sản xuất về thành phần phản ứng realtime PCR và chu trình nhiệt.