Thuộc tính
Nội dung
Tiếng Anh (English)
Văn bản gốc/PDF
Lược đồ
Liên quan hiệu lực
Liên quan nội dung
Thuộc tính
Tải về

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-46:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 46

Số hiệu:	TCVN8400-46:2019	Loại văn bản:	Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành:	***	Người ký:	***
Ngày ban hành:	Năm 2019	Ngày hiệu lực:
		Tình trạng:	Đã biết

Log₁₀ (độ pha loãng HT)					0,48	0,95	1,43	1,91	2,39	2,87
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	Chuẩn độ lại vi rút				HT dương chuẩn 2 IU						Chứng VR	Chứng TB
B
C
D
E					HT dương chuẩn 0,5 IU				HT âm chuẩn
F
G
H

Cho 150 µl môi trường DMEM 10 % FCS vào các giếng AH 1 đến AH 4 và các giếng chứng tế bào AD 12. Các giếng còn lại cho 100 µl môi trường.

Cho 50 µl huyết thanh chuẩn 2 IU vào các giếng AD 5.

Cho 50 µl huyết thanh chuẩn 0,5 IU vào các giếng EH 5.

Cho 50 µl huyết thanh chứng âm vào các giếng EH 9.

Trộn đều bằng cách hút nhả nhiều lần, chuyển 50 µl ở nồng độ pha loãng trước sang các giếng tiếp theo cho đến cột cuối cùng, bỏ 50 µl ở cột cuối cùng đi.

Pha huyết thanh cần xét nghiệm theo sơ đồ sau:

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

...

Log₁₀
(độ pha loãng HT)

0,48

0,95

1,43

1,91

2,39

...

0,48

0,95

1,43

1,91

2,39

4,23

Mỗi đĩa chuẩn độ cho 4 huyết thanh theo sơ đồ, mỗi nồng độ cho 4 giếng.

Cho 100 µl môi trường vào các giếng trừ AH 6 và AH 12 cho 200 µl môi trường.

Cho 50 µl huyết thanh vào các giếng AH 1 và AH 7, mỗi mẫu cho vào 4 giếng liền kề.

...

Chuyển 10 µl huyết thanh pha loãng ở cột AH 5 và AH 11 sang AH 6 và AH 12, trộn đều sau đó bỏ 180 µl đi, thêm vào 70 µl môi trường.

CHÚ Ý:

- Loại bỏ 40 µl huyết thanh ở cột AH 5 và AH 11 đi để đảm bảo thể tích trong các giếng là 100 µl.

Cho vi rút

Lấy chủng CVS-11 (3.2.11) từ tủ - 80 °C. Đông tan nhanh dưới vòi nước chảy, đặt vi rút trong đá xốp để giữ lạnh.

Pha loãng vi rút trong môi trường DMEM 10 % FCS (xem A4 phụ lục A) để đạt nồng độ 100TCID₅₀ trong 50 µl. Cho 50 µl vi rút vào mỗi giếng đã có sẵn huyết thanh.

Để chuẩn độ lại vi rút, cho 50 µl vi rút 100TCID₅₀ vào các giếng A1 - A4. Trộn đều và chuyển 50 µl sang hàng tiếp theo và cho tới hàng H1 - H4. Bỏ 50 µl ở hàng cuối cùng

Cho 50 µl vi rút chứng vào các giếng AD 11.

Ủ đĩa trong tủ ấm 37 °C, 5% CO₂ (4.3.8) trong 1 h.

...

Tế bào BHK-21 vừa kín, tách tế bào, tính nồng độ tế bào 4 x 10⁵ TB/ ml DMEM 10% FCS. Cho 50 µl tế bào/giếng.

Ủ đĩa trong tủ ấm 37 °C, 5% CO₂ (4.3.8) trong 48 h.

Cố định và nhuộm

Đổ môi trường trong đĩa. Rửa đĩa phản ứng 1 lần bằng PBS, pH = 7,2 - 7,4 (3.2.14) và một lần bằng acetone 80% (3.2.4). Sau đó, đĩa được cố định trong acetone 80% trong 30 min tại nhiệt độ phòng. Sau đó để khô ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 min.

Nhỏ 50 µl dung dịch cộng hợp (kháng thể gắn FITC) (3.2.6) pha theo hiệu giá.

Ủ đĩa trong tủ ấm 37 °C, ở điều kiện ẩm và tối trong 30 min.

Loại bỏ hết kháng thể, rửa đĩa ba lần bằng dung dịch PBS (3.1.14).

Để khô đĩa ở nhiệt độ phòng.

6.3.1.7 Đọc kết quả

...

- Đối chứng vi rút và đối chứng tế bào được quan sát đầu tiên.

- Đối chứng vi rút: có xuất hiện tượng phát huỳnh quang ở tất cả các giếng.

- Chuẩn độ vi rút: vi rút cho vào là 2log₁₀ và nên khi vi rút chuẩn độ ngược nên nằm trong khoảng 1,5-2,5log₁₀.

- Đối chứng tế bào không có có hiện tượng trung hòa vi rút ở bất kỳ giếng nào (tức là không có hiện tượng bắt màu huỳnh quang). Đối chứng âm có hiện tượng bắt màu huỳnh quang.

- Quan sát toàn bộ các vi trường. Kiểm tra các giếng nếu có tế bào bắt màu huỳnh quang giống chứng dương (chứng vi rút) đánh dấu (+), nếu giếng không bắt màu huỳnh quang, nền tế bào giống chứng âm (chứng tế bào) đánh dấu (-).

- Xác định D₅₀ của huyết thanh chứng dương và huyết thanh cần chuẩn độ theo phương pháp Spearman - Kärber.

- Hiệu giá huyết thanh thử nghiệm là độ pha loãng huyết thanh mà 100 % vi rút được trung hòa trong 50 % số giếng được thực hiện. Hiệu giá này được thể hiện bằng IU/ml bằng cách so sánh độ pha loãng huyết thanh của OIE có nguồn gốc từ chó trong cùng điều kiện thí nghiệm.

6.3.2. Phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể dại có bán sẵn trên thị trường. Thực hiện phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục H).

...

Động vật được xác định mắc bệnh Dại khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích của bệnh Dại và có kết quả xét nghiệm Dại dương tính bằng một trong những phương pháp sau:

- Có kết quả xét nghiệm kháng nguyên vi rút Dại dương tính bằng phương pháp DFAT.

- Có kết quả xét nghiệm kháng nguyên vi rút Dại dương tính bằng phương pháp realtime RT-PCR.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1 Dung dịch kháng sinh đậm đặc

Penicillin 1 000 000 IU

...

Nystatin 500 000 IU

Nước cất 10 ml

Lắc đều cho tan, lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

Sử dụng tốt nhất trong 1 tuần, bảo quản ở 4 °C.

A.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) 10x, pH ~ 7,2, sản phẩm thương mại

Dung dịch muối đệm phosphat 10x 100 ml

Nước cất (vô trùng) 900 ml

A.3 Dung dịch muối đệm photphat (PBS) pH ~ 7,2

Natri clorua (NaCl) 8 g

...

Kali dihydro photphat (KH₂PO₄) 0,2 g

Kali clorua (KCl) 0,2 g

Nước cất 1 000 ml

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M (3.2.7) hoặc dung dịch HCl 1 M (3.2.8). Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.

Để dùng làm dung dịch bảo quản mẫu: pha 9 phần PBS với 1 phần dung dịch kháng sinh đậm đặc (xem A1 phụ lục A). Trường hợp mẫu cần bảo quản lâu có thể pha thành môi trường đệm glycerin bằng cách trộn đều 1 phần PBS với 1 phần glycerin. Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.

A.4 Môi trường nuôi tế bào

Môi trường DMEM 440 ml

Huyết thanh bào thai bê (FCS) 10 % 50 ml

Kháng sinh (Penicillin/streptomycin: 10 000 UI/ml) 5 ml

...

* Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C

A.5 Cấy chuyển và nuôi tế bào

Nguyên liệu: 1 chai nuôi tế bào BHK-21 75 cm² đã phát triển 1 lớp đạt 100 % bề mặt nuôi

1 đĩa tế bào BHK-21 12 giếng

Môi trường nuôi tế bào (xem A4 phụ lục A)

Trypsin có 0,05 % EDTA

PBS (xem A2 phụ lục A)

CHÚ Ý: Tất cả các môi trường phải được cân bằng ở 37 °C trước khi sử dụng và vật tư dùng cho tế bào đều phải được hấp vô trùng trước khi sử dụng.

Tiến hành như sau:

...

Bước 2: Rửa bề mặt thảm tế bào bằng PBS 2 lần với 10 ml/chai 75 cm², tráng qua và hút bỏ PBS.

Bước 3: Tách tế bào

- Cho 2 ml trypsin (có 0,05 % EDTA) vào chai tế bào 75 cm², láng đều lên bề mặt tế bào sao cho bề mặt tế bào được phủ một lớp trypsin.

- Ủ trong thời gian từ 3 min đến 10 min trong tủ ấm ở 37 °C.

CHÚ Ý: không để tế bào trong trypsin quá 15 phút.

- Khi tế bào đã tách hết, bổ sung 5 ml môi trường nuôi tế bào (xem A4 phụ lục A) vào chai để vô hoạt trypsin, trộn đều, chuyển toàn bộ huyễn dịch tế bào sang ống ly tâm 15 ml.

Bước 4: Loại bỏ Trypsin

- Ly tâm huyễn dịch tế bào ở gia tốc 3 000 g trong 5 phút.

- Loại bỏ phần dung dịch ở trên, giữ cặn tế bào.

...

- Làm long cặn tế bào bằng cách búng nhẹ vào thân ống chứa cặn tế bào.

- Bổ sung 10 ml môi trường nuôi tế bào, sau đó dùng pipet (4.1.1) hút lên hút xuống nhẹ nhàng cho đến khi các tế bào phân tán đều trong dịch môi trường.

- Đếm tế bào: Pha loãng tế bào 100 lần (10 µl tế bào trong 990 µl môi trường nuôi tế bào), đếm tế bào bằng buồng đếm (4.3.7) trên kính hiển vi (4.3.6), tính số tế bào trong 1 ml.

Bước 6: Cấy chuyển tế bào:

- Ghi nhãn chai nuôi tế bào mới (tên dòng tế bào, ngày nuôi cấy, lần cấy chuyển)

- Chia huyễn dịch tế bào vào 1 chai 75 cm² và 1 đĩa 12 giếng:

* Chai tế bào 75 cm² khi nuôi cấy cần 6 x 10⁶ tế bào/chai (4.3.2) (hoặc chai tế bào 25 cm² khi nuôi cấy cần 2 x 10⁶ tế bào/chai (4.3.3).

* Đĩa tế bào 96 giếng khi nuôi cấy cần 1x10⁶ tế bào/đĩa (4.3.1)

Bước 7: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển:

...

- Đĩa tế bào 12 giếng: Ống ly tâm 50 ml có 18 ml môi trường nuôi tế bào và 1 x 10⁶ tế bào BHK-21 sau khi đếm, trộn đều và chia nhỏ ra 12 giếng mỗi giếng 1,5 ml.

Bước 8: Nuôi chai tế bào và đĩa tế bào trong tủ ấm có 5 % CO₂ duy trì ở 37 °C.

Theo dõi sự phát triển hàng ngày của tế bào bằng kính hiển vi (4.3.6).

Phụ lục B

(Tham khảo)

Phương pháp chiết tách ARN

Dùng huyễn dịch đã xử lý (xem 6.2.3.1) để chiết tách ARN. Có thể sử dụng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep (hoặc kít khác tương đương để chiết tách RNA) theo quy trình dưới đây:

Nhỏ 200 µl dịch nghiền mô vào ống ly tâm loại 1,5 ml cùng với 600 µl Qiagen® buffer RLT có 1% β- ME, lắc đều trên máy Vortex rồi ly tâm nhẹ.

...

Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc 10 000 g ở nhiệt độ phòng.

Bổ sung 700 µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc 10 000 g, thay ống thu mới vào cột lọc.

Nhỏ 500 µl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s ở gia tốc 10 000 g, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở gia tốc 12 000 g trở lên, bỏ ống thu.

Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 µl nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm trong 1 min ở gia tốc 10 000 g, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.

Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 °C trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR, nếu để sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở - 20 °C hoặc nhiệt độ thấp hơn.

Phụ lục C

(Tham khảo)

...

C.1 Trình tự mồi - mẫu dò, lượng hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime RT-PCR^{[2] [3]}

Bảng C1: Trình tự mồi-mẫu dò phát hiện vi rút Dại trong rRT-PCR ^{[2] [3]}

Tên mồi (Ng.gốc)

Mồi, mẫu dò

Trình tự (5'-3')

Lyssa N1

(Coertse, 2010)

Mẫu dò

FAM-CATCACACCTTGATGACAACTCACAA-BHQ1

...

CACMGSNAAYTAYAARACNAA

Mồi ngược

GTRCTCCARTTAGCRCACAT

Rabies N2

(RABV-N2)

(Hoffman, 2010)

Mẫu dò

FAM-CAGCAATGCAGTTYTTTGAGGGGAC-BHQ1

Mồi xuôi

...

Mồi ngược

RGATTCCGTAGCTRGTCCA

CHÚ THÍCH 1:

- Việc lựa chọn các mồi và mẫu dò cho phản ứng cần tham khảo theo hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật của OIE, CDC, FAO và các bài báo khoa học hàng năm để cập nhật mồi cho phù hợp

- Trình tự các mồi và mẫu dò được trình bày ở bảng C1 được công bố theo tài liệu tham khảo [2] [3].

Bảng C2: Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml với các lượng cụ thể cho mỗi phản ứng

Thành phần

(Theo hướng dẫn của Kít Invitrogen Superscript III platinum One-Step qRT-PCR Kit. REF. 11732-020)

Thể tích

...

2x Reaction buffer

12,5

Mồi xuôi 20 µM

0,5

Mồi ngược 20 µM

0,5

Mẫu dò 6 µM

0,5

Enzyme

...

Nước không có nuclease

5,5

Mẫu ARN

Tổng

CHÚ THÍCH 2: Có thể sử dụng kít khác tương đương để tạo hỗn hợp phản ứng cho phản ứng realtime RT-PCR). Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng C3: Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR phát hiện vi rút Dại ^[5]

Nhiệt độ

...

Số chu kỳ

48 °C

30 min

1 vòng

95 °C

2 min

95 °C

90 s

5 vòng

...

90 s

50 °C

20 s

72 °C

60 s

95 °C

30 s

40 vòng

45 °C

...

50 °C

20 s

72 °C

60 s

95 °C

30 s

1 vòng

45 °C

90 s

...

20 s

68 °C

10 min

CHÚ THÍCH 3:

- Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime - RT PCR được trình bày ở bảng C3 được công bố theo tài liệu tham khảo [5]

C.2 Trình tự mồi - mẫu dò, lượng hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR ^[4]

Bảng C4: Trình tự mồi-mẫu dò phát hiện vi rút Dại trong rRT-PCR ^[4]

Tên mồi

Mồi, mẫu dò

...

LN34 Forward Primer 1

Mồi xuôi

ACGCTTAACAACCAGATCAAAGAA

LN34 Forward Primer 2

Mồi xuôi

ACGCTTAACAACAAAATCADAGAAG

LN34 Reverse Primer

Mồi ngược

CMGGGTAYTTRTAYTCATAYTGRTC

...

Mẫu dò

FAM-AACACCYCTACAATGGA-BHQ1

LN34 Lagos Probe

Mẫu dò

FAM-AACACTACTACAATGGA-BHQ1

β - Actin Forward Primer

Mồi ngược

CGATGAAGATCAAGATCATTGC

β - Actin Reverse Primer

...

AAGCATTTGCGGTGGAC

β - Actin Probe

Mẫu dò

HEX-TCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCA-BHQ1

CHÚ THÍCH 4:

- Trình tự các mồi và mẫu dò được trình bày ở bảng C4 được công bố theo tài liệu tham khảo [4]

Bảng C5: Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml với các lượng cụ thể cho mỗi phản ứng ^[4]

Thành phần

(Theo hướng dẫn của Kít Invitrogen Superscript III platinum One-Step qRT-PCR Kit. REF. 11732-020)

...

(µl)

2x Reaction buffer

12,5

Mồi xuôi 20 µM

0,5

Mồi ngược 20 µM

0,5

Mẫu dò 10 µM

0,5

...

0,5

Nước không có nuclease

5,5

Mẫu ARN

Tổng

Bảng C6: Chu trình nhiệt cho phản ứng rRT-PCR phát hiện vi rút Dại ^[4]

Nhiệt độ

...

Số chu kỳ

50 °C

30 min

1 vòng

95 °C

10 min

95 °C

15 s

45 vòng

...

30 s

CHÚ THÍCH 5:

- Hỗn hợp phản ứng cho phương pháp realtime RT-PCR được trình bày ở bảng C5 được công bố theo tài liệu tham khảo [4].

- Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR được trình bày ở bảng C6 được công bố theo tài liệu tham khảo [4].

Phụ lục D

(Qui định)

Sơ đồ chẩn đoán bệnh Dại

...

Phụ lục E

(Quy định)

Cách tính D50 cho thử nghiệm FAVN

Ví dụ: đám huỳnh quang ở mỗi nồng độ

0,48

0,95

1,43

1,91

...

4,23

...

Ghi chú: (+) đám huỳnh quang; (-) không đám huỳnh quang

- Tính cộng dồn số đám huỳnh quang và không ở mỗi nồng độ

Nồng độ

Cộng dồn không đám huỳnh quang

Cộng dồn có đám huỳnh quang

0,48

...

0,95

4 + 9 = 13

1,43

4 + 5 = 9

1,91

3 + 2 = 5

...

2,39

2 + 0 = 2

2 + 1 = 3

4,23

4 + 3 = 7

- Tính số phần trăm không đám huỳnh quang ở mỗi nồng độ theo công thức

Cộng dồn số không đám huỳnh quang x 100

...

Tổng số cộng dồn đám huỳnh quang và không

Ở nồng độ 1,91

Ở nồng độ 2,39

- Lấy 2 giá trị để tính D₅₀: Giá trị nhỏ nhất lớn hơn 50% và giá trị lớn nhất nhỏ hơn 50 %

- Công thức tính D₅₀

...

D₅₀ = 1,91 +0,11 = 2,02

Ghi chú: Log pha loãng 1/70 = 1,845

Log 4 = 0,602

Phụ lục G

(Quy định)

Cách quy đổi giá trị Log D50 sang giá trị IU/ml

Hiệu giá huyết thanh (IU/ml) =

...

x 0,5

10^{(log D}₅₀^{của huyết thanh dương chuẩn OIE 0,5 IU/ml)}

Ví dụ:

- Log D₅₀ của huyết thanh = 2,27

- Hiệu giá lý thuyết của huyết thanh dương chuẩn OIE 0,5IU/ml = 0,5IU/ml

- Log D₅₀ của huyết thanh OIE = 1,43

Hiệu giá huyết thanh

Hiệu giá huyết thanh (IU/ml) = = 3,46 IU/ml

...

(Tham khảo)

Phương pháp ELISA

Hiện nay có rất nhiều các loại kít phát hiện kháng thể Dại khác nhau được cung cấp trên thị trường nên khi sử dụng tuân theo qui trình của nhà sản xuất (hoặc kít khác tương ứng để phát hiện kháng thể kháng vi rút Dại).

Nếu sử dụng bộ kít chẩn đoán Dog Rabies virus Antibody IgG (RABV) ELISA Kid của Abbexa với Cat No.:abx05582 thì các bước tiến hành được thực hiện như sau:

1. Chuẩn bị mẫu và thuốc thử

- Chuẩn bị bộ số mẫu huyết thanh cần kiểm tra (6.1.2) + đối chứng dương + đối chứng âm. Mẫu huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng 10 lần với dung dịch pha loãng mẫu.

- Nước rửa: pha loãng dung dịch nước rửa đậm đặc 25 lần (1/25) với nước cất. Ví dụ như pha 20 ml dương dịch rửa đậm đặc trong 480 ml nước cất.

- Chuẩn bị HRP conjugate: Ly tâm ống conjugate trước khi mở. Pha loãng HRP conjugate 100 lần với dung dịch pha pha loãng HRP Conjugate. Ví dụ như cho 10 µl HRP conjugate vào trong 990 µl dung dịch pha loãng HRP conjugate.

2. Các bước tiến hành

...

- Bước 1: Chuẩn bị tất cả thuốc thử và mẫu như đã miêu tả trong phần 1.

- Bước 2: Xác định số giếng được sử dụng. Tất cả các dải nào không được sử dụng phải được giữ khô và bảo quản ở 4 °C.

- Bước 3: Thiết kế hai giếng trống (blank) mà không cần bất kỳ dung dịch gì.

- Bước 4: Nhỏ 100 µl đối chứng âm vào mỗi giếng như bố trí (2 giếng đối chứng âm).

- Bước 5: Nhỏ 100 µl đối chứng dương vào mỗi giếng như bố trí (2 giếng đối chứng dương).

- Bước 6: Nhỏ 100 µl mẫu huyết thanh cần kiểm tra đã pha loãng vào mỗi giếng như bố trí.

- Bước 7: Đậy nắp đĩa. Vỗ nhẹ đĩa để trộn kỹ. Ủ ở 37 °C trong 30 phút.

- Bước 8: Tháo nắp, đổ bỏ môi trường trong đĩa và rửa đĩa 3 lần với nước rữa đã chuẩn bị ở phần 1. Mỗi giếng 200 µl và ngâm trong 2 phút. Sau đó đổ bỏ nước rủa và thấm đĩa trên khăn hoặc giấy.

- Bước 9: Nhỏ 100 µl HRP conjugate đã pha loãng vào từng giếng (trừ giếng blank). Đậy nắp đĩa. Vỗ nhẹ đĩa để trộn kỹ. Ủ ở 37 °C trong 30 phút.

...

- Bước 11: Nhỏ 90 µl cơ chất (Substrate) TMB vào mỗi giếng. Đậy nắp đĩa. Vỗ nhẹ đĩa để trộn kỹ. Ủ ở 37°C trong 30 phút. Ủ tại 37 °C trong 20 phút trong điều kiện tối.

- Bước 12: Dừng phản ứng bằng cách nhỏ 50 µl dung dịch stop vào mỗi giếng. Vỗ nhẹ đĩa để trộn kỹ. Ở đây sẽ có sự thay đổi màu sang màu vàng

- Bước 13: Để 10 phút và đọc kết quả ở bước sóng 450 nm.

3. Phân tích kết quả

- Kết quả âm tính: Giá trị OD của mẫu < 2.1 x giá trị OD trung bình của đối chứng âm

- Kết quả dương tính: Giá trị OD của mẫu ≥ 2.1 x giá trị OD trung bình của đối chứng dương.

Sơ đồ đĩa:

...

ĐC(-)

S11

S19

S27

S35

S43

S51

...

S67

S75

S83

ĐC(-)

S12

S20

S28

...

S44

S52

S60

S68

S76

S84

ĐC(+)

...

S21

S29

S37

S45

S53

S61

S69

S77

S85

...

ĐC(+)

S14

S22

S30

S38

S46

S54

S62

...

S78

S86

Blank

S15

S23

S31

S39

...

S55

S63

S71

S79

S87

Blank

S16

...

S32

S40

S48

S56

S64

S72

S80

S88

...

S17

S25

S33

S41

S49

S57

S65

S73

...

S89

S10

S18

S26

S34

S42

S50

...

S66

S74

S82

S90

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] O.I.E. (2018). Rabies. In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2018).

[2] Jessica Coertse, Jacqueline Weyer, Louis H. Nel, and Wanda Markotter1* (2010). Improved PCR Methods for Detection of African Rabies and Rabies-Related Lyssaviruses. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, p. 3949-3955.

[3] B. Hoffmann, C. M. Freuling, P. R. Wakeley, T. B. Rasmussen, S. Leech, A. R. Fooks, M. Beer, and T. Mu"ller (2010). Improved Safety for Molecular Diagnosis of Classical Rabies Viruses by Use of a TaqMan Real-Time Reverse Transcription-PCR “Double Check” Strategy. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, p. 3970-3978.

...

[5] CSIRO. (2017). Procedues for rabies and lyssavirus diagnosis including rabies fluorescent antibody test (FAT) and virus isolation.