Thuộc tính
Nội dung
Tiếng Anh (English)
Văn bản gốc/PDF
Lược đồ
Liên quan hiệu lực
Liên quan nội dung
Thuộc tính
Tải về
Các bản dự thảo

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8161:2009 thực phẩm - Xác định patulin trong nước táo trong, nước táo đục

Số hiệu:	TCVN8161:2009	Loại văn bản:	Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành:	***	Người ký:	***
Ngày ban hành:	Năm 2009	Ngày hiệu lực:
ICS:	67.080.10, 67.120.10	Tình trạng:	Đã biết

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8161 : 2009

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH PATULIN TRONG NƯỚC TÁO TRONG, NƯỚC TÁO ĐỤC VÀ PUREE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÓ LÀM SẠCH PHÂN ĐOẠN LỎNG/LỎNG

Foodstuffs - Determination of patulin in clear and cloudy apple juice and puree - High performance liquid chromatographic (HPLC) method with liquid/liquid partition clean-up

Lời nói đầu

TCVN 8161:2009 hoàn toàn tương đương với EN 14177:2003;

TCVN 8161:2009 do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm và Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH PATULIN TRONG NƯỚC TÁO TRONG, NƯỚC TÁO ĐỤC VÀ PUREE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÓ LÀM SẠCH PHÂN ĐOẠN LỎNG/LỎNG

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng patulin trong nước táo và puree táo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này đã được khảo nghiệm để xác định patulin qua phân tích các mẫu bị nhiễm tự nhiên và các mẫu đã được bổ sung lượng biết trước trong nước táo trong ở các mức từ 26 mg/l đến 128 mg/l, trong nước táo đục ở các mức từ 26 mg/l đến 106 mg/l và trong puree táo ở các mức từ 23 mg/kg đến 121 mg/kg.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Nguyên tắc

Nước táo đục và puree táo được xử lý bằng enzym pectinaza. Patulin được chiết ra khỏi nước táo hoặc puree đã được xử lý enzym bằng dung dịch etyl axetat. Dịch chiết bằng dung môi được làm sạch bằng chiết pha lỏng-lỏng với dung dịch natri cacbonat. Dịch chiết bằng etyl axetat được làm khô bằng natri sulfat khan. Sau khi cho bay hơi etyl axetat, patulin được định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tử ngoại (UV).

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

...

4.2. Dung dịch natri cabonat, nồng độ khối lượng r(Na₂CO₃) » 15 g/l.

Hòa tan 1,5 g natri cacbonat trong 100 ml nước.

4.3. Axit axetic, nồng độ thể tích j(CH₃COOH) » 98 %.

4.4. Natri sulfat khan

4.5. Nước có pH = 4.

Dùng axit axetic để chỉnh pH của nước đến 4.

4.6. Etanol tuyệt đối, j(CH₃CH₂OH) ≥ 99,7 %.

4.7. Etyl axetat

4.8. Axit percloric, j(HClO₄) = 60 %.

...

4.10. Dung dịch enzym endogalacturonaza, có hoạt độ điển hình 1400 U/g.

Đơn vị (U) là lượng enzym xúc tác giảm 20% độ nhớt của dung tịch pectin 1 % trong vòng 5 min ở pH 3,4 và 25 ⁰C.

CHÚ THÍCH: Thực tế có các lượng bao gói 100 ml đến 200 ml.

4.11. Pha động của HPLC

Trộn 95 phần thể tích nước với 5 phần thể tích axetonitril (4.9) và 0,095 phần thể tích axit percloric (4.8) và khử khí.

4.12. Dung dịch gốc patulin

CẢNH BÁO: Patulin được nghi ngờ là chất gây đột biến và đã được ghi lại là có các đặc trưng về gây độc miễn dịch và gây độc về thần kinh. Luôn luôn phải mang găng tay, kính bảo vệ và tất cả các bước chuẩn bị mẫu, chất chuẩn phải được thực hiện trong tủ hút.

Hòa tan 5 mg patulin hoặc lượng chứa trong 1 ống (nếu patulin ở dạng màng) trong etyl axetat (4.7). Chuyển dung dịch sang bình định mức 25 ml và pha loãng bằng etyl axetat đến vạch để thu được dung dịch có chứa khoảng 200 mg/ml patulin. Bảo quản dung dịch gốc trong tủ lạnh dưới 0⁰C.

4.13. Dung dịch chuẩn patulin

...

Để xác định chính xác nồng độ, ghi lại đường hấp thụ ở bước sóng từ 250 nm đến 350 nm trong cuvet thạch anh 1 cm có etanol làm đối chứng. Xác định bước sóng có độ hấp thụ tối đa. Tính nồng độ khối lượng của patulin, r_pat, bằng microgam trên mililit, theo công thức 1:

(1)

Trong đó:

A_max là độ hấp thụ xác định được tại điểm tối đa của đường hấp thụ (ở đây: tại khoảng 276 nm);

M là khối lượng phân tử tương đối của patulin (M = 154,12 g/mol);

e là hệ số hấp thụ mol tương đối của patulin trong etanol [ở đây: 1460 m²mol, như trong AOAC 1995, Natural Toxins, Patulin (các độc tố tự nhiên, patulin) 49.6.01.C(d)];

d là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng centimet (cm).

Bảo quản dung dịch chuẩn trong tủ lạnh ở nhiệt độ dưới 0 ⁰C. Các dung dịch có thể bền trong 2 tháng. Trước khi sử dụng, đưa các dung dịch này về nhiệt độ phòng để tránh nước bị lẫn vào do ngưng tụ.

4.14. Dung dịch chuẩn patulin hiệu chuẩn

...

Dung dịch này có thể bảo quản được trong tủ lạnh ở 4 ⁰C. Dung dịch này có thể bền ít nhất 8 tuần.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.2. Pipet, dung tích 5 ml, 1 ml, 200 ml và 50 ml có các đầu pipet thích hợp.

5.3. Cân phân tích

5.4. Máy đo quang phổ UV, hai chùm tia và ghi được ở bước sóng 250 nm đến 350 nm.

5.5. Cuvet thạch anh, chiều dài đường quang 1 cm.

5.6. Máy ly tâm, có gia tốc ly tâm 4500 g.

...

5.8. Máy cô quay, có nồi cách thủy để ở 40 ⁰C.

5.9. Giấy lọc, có cỡ lỗ 20 mm đến 25 mm.

5.10. Bộ lọc bằng xyranh sử dụng một lần, có cỡ lỗ 0,2 mm (tùy chọn).

Kiểm tra từng mẻ trước khi sử dụng để đảm bảo rằng patulin không bị hấp phụ trên bộ lọc.

5.11. Thiết bị HPLC, gồm:

5.11.1. Hệ thống bơm, hệ thống bơm van có vòng bơm 50 ml.

5.11.2. Bơm đẳng dòng, không xung, có thể duy trì tốc độ 1 ml/min.

5.11.3. Detector UV, được gắn với cuvet dòng chảy được cài đặt ở 276 nm.

5.11.4. Cột HPLC pha đảo phân tích, ví dụ: cột C₁₈ octyldecylsilane (ODS) (được nhồi bằng cacbon 12% đến 17% được coi là thích hợp) có thể tách patulin ra khỏi các pic khác. Chiều cao tối đa đường lề pic chồng nhau phải nhỏ hơn 10 % của chiều cao pic tối đa (cần phải điều chỉnh pha động về phân giải đường nền). Nên sử dụng cột trước thích hợp.

...

5.11.6. Van chuyển mạch hoặc bơm HPLC thứ hai, tùy chọn, để rửa cột phân tích giữa các lần bơm.

5.12. Bình cầu đáy tròn, dung tích 250 ml có khớp nối thủy tinh mài.

6. Cách tiến hành

6.1. Chuẩn bị mẫu thử

6.1.1. Nước táo trong

Không cần chuẩn bị mẫu. Tiến hành theo 6.2 đến 6.4.

6.1.2. Nước táo đục

Chuyển 20 ml ± 0,1 ml nước táo đục sang ống ly tâm (5.7) và thêm 150 ml dung dịch enzym (4.10). Vặn chặt nắp và lắc kỹ bình. Để qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc để 2 h ở 40 ⁰C, sau đó cho ly tâm 5 min ở gia tốc 4500 g.

6.1.3. Puree táo

...

6.2. Chiết patulin

Dùng pipet lấy 10 ml nước táo trong hoặc nước táo đục đã chuẩn bị trong 6.1.2 cho vào phễu chiết 100 ml. Đối với puree táo thì dùng pipet lấy 10 ml mẫu đã chuẩn bị trong 6.1.3, tương đương với 5 g puree, cho vào phễu chiết 100 ml. Thêm 20 ml etyl axetat (4.7) và lắc trong 1 min. Để yên cho tách lớp rồi tách riêng hai pha này vào hai bình nón riêng rẽ. Chuyển phần nước vào lại phễu chiết và chiết lại lần hai bằng 20 ml etyl axetat. Lại để yên cho tách lớp rồi chuyển lớp nước phía dưới vào một bình nón rỗng và lớp phía trên vào bình nón có chứa sẵn lớp etyl axetat từ lần chiết thứ nhất. Lặp tại quy trình chiết này lần ba, nhưng sau khi tách lớp thì tháo bỏ lớp nước phía dưới. Gộp ba phần dịch chiết etyl axetat này vào phễu chiết. Tráng bình nón được dùng để đựng các dịch chiết etyl axetat bằng 5 ml etyl axetat mới và gộp nước rửa này vào dịch chiết etyl axetat trong phễu chiết.

6.3. Loại bỏ các hợp chất axit gây nhiễu

Cho 4 ml dung dịch natri cacbonat (4.2) vào phễu chiết đựng dịch chiết etyl axetat và lắc trong 30 s. Đợi cho tách lớp rồi tháo lớp nước phía dưới chảy sang bình nón. Rót lớp phía trên sang bình cầu đáy tròn (5.12) qua phễu chiết và giấy lọc (5.9) có chứa khoảng 15 g natri sulfat khan (4.4). Chuyển phần nước trở lại phễu chiết rồi tráng bình nón bằng khoảng 10 ml etyl axetat (4.7), cho nước tráng vào phễu chiết và lắc 30 s. Để yên cho tách lớp, tháo bỏ lớp nước phía dưới và cho lớp phía trên chảy qua natri sulfat sang bình cầu đáy tròn (5.12). Tráng phễu chiết bằng 15 ml etyl axetat và cho qua natri sulfat vào bình cầu đáy tròn.

Thực hiện bước này trong vòng 3 min.

6.4. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Cho bay hơi dung dịch thu được trong 6.3 đến thể tích nhỏ (< 1 ml) trong chân không, sử dụng nồi cách thủy ở 40 ⁰C. Chuyển lượng còn lại sau khi bay hơi sang một lọ thủy tinh. Tránh phía trong bình cầu đáy tròn bằng etyl axetat (4.7) để đảm bảo rằng chuyển được tất cả patulin sang lọ. Cho bay hơi dung dịch đến khô bằng dòng nitơ trên tấm gia nhiệt hoặc trên nồi cách thủy ở 40⁰C. Hòa tan lại cặn bằng cách dùng pipet lấy 1 ml (V₁) nước (500 ml với mẫu puree) (4.5) cho vào lọ. Dùng máy trộn Vortex để hòa tan hoàn toàn mẫu. Chuyển dung dịch mẫu thử sang lọ nhỏ của HPLC. Lọc qua bộ lọc xyranh dùng một lần (5.10), nếu cần.

7. Quy trình thêm chuẩn

7.1. Nước táo trong

...

7.2. Nước táo đục

Dùng pipet lấy 10 ml nước táo đục cho vào ống ly tâm (5.7). Dùng pipet lấy 50 ml dung dịch chuẩn (4.13) hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 mg patulin tuyệt đối cho vào nước táo đục không chứa patulin. Đậy bình và lắc kỹ để trộn. Tiến hành như trong 6.1.2.

7.3. Puree táo

Cân 10 g puree táo không chứa patulin, chính xác đến 0,1 g, cho vào ống ly tâm (5.7). Dùng pipet lấy 50 ml dung dịch chuẩn (4.13) hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 mg putulin tuyệt đối cho vào puree táo không chứa patulin. Sau khi thêm, lắc kỹ để trộn dung dịch. Tiến hành như trong 6.1.3.

8. Xác định bằng HPLC

8.1. Đường chuẩn

8.1.1. Yêu cầu chung

Dựng đường chuẩn trong ngày phân tích.

8.1.2. Dung dịch hiệu chuẩn patulin dùng cho HPLC

...

Bảng 1 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn

Nước (4.5)
(ml)

Dung dịch chuẩn làm việc patulin (ml)

Nồng độ khối lượng (mg/ml)

1000

0,50

...

1200

800

0,40

1500

500

0,25

1800

...

0,10

1900

100

0,05

8.2. Các điều kiện vận hành của HPLC

Khi sử dụng cột quy định trong 5.11 và pha động quy định trong 4.11, thì cài đặt như sau là thích hợp:

Tốc độ dòng của pha động (cột): 1,0 ml/min;

Bước sóng của detector UV: 276 nm;

...

9. Tính kết quả

Đọc từ đường chuẩn khối lượng patulin trong dung dịch mẫu thử đã bơm lên cột HPLC, bằng nanogam. Tính phần khối lượng patulin, w_PAT, bằng nanogam trên mililit (hoặc gam đối với puree) theo công thức (2):

(2)

Trong đó:

m_a là khối lượng patulin trong dung dịch thử được bơm lên cột, tính bằng nanogam (ng);

V₂ là thể tích phần dung dịch thử (6.4) được bơm lên cột, tính bằng mililit (ml);

V₁ là thể tích dung dịch mẫu thử (6.4), (V₁ = 1,0 ml đối với nước táo, V₁ = 0,5ml đối với puree) tính bằng mililit (ml);

M_s là thể tích mẫu được chiết, tính bằng mililit đối với nước táo (m_s = 10 ml) hoặc gam đối với puree (m_s = 5 g).

Kết quả cuối cùng có thể được biểu thị bằng microgam trên lit (hoặc kilogam đối với puree) và tương đương với nanogam trên mililit (hoặc gam).

...

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ/chất nền khác với các giá trị đã nêu.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, được phép vượt quá giá trị giới hạn lại r sau đây nhưng không quá 5% trường hợp.

Đối với nước táo trong:

= 26 mg/l

= 54 mg/l

= 67 mg/l

= 128 mg/l

...

r = 16,8 mg/l

r = 23,5 mg/l

r = 27,7 mg/l

Đối với nước táo đục:

= 26 mg/l

= 60 mg/l

= 69 mg/l

= 106 mg/l

r = 10,36 mg/l

...

r = 11,8 mg/l

r = 28,6 mg/l

Đối với puree táo:

= 23 mg/kg

= 38 mg/kg

= 69 mg/kg

= 121 mg/kg

r = 17,9 mg/kg

r = 10,6 mg/kg

...

r = 66,1 mg/kg

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm khác nhau thực hiện, được phép vượt quá giá trị giới hạn tái lập R sau đây nhưng không quá 5% trường hợp:

Đối với nước táo trong:

= 26 mg/l

= 54 mg/l

= 67 mg/l

= 128 mg/l

R = 23,5 mg/l

...

R = 42,8 mg/l

R = 39,2 mg/l

Đối với nước táo đục:

= 26 mg/l

= 60 mg/l

= 69 mg/l

= 106 mg/l

R = 23,5 mg/l

R = 35,0 mg/l

...

R = 36,1 mg/l

Đối với puree táo:

= 23 mg/kg

= 38 mg/kg

= 69 mg/kg

= 121 mg/kg

R = 23,8 mg/kg

R = 25,3 mg/kg

R = 23,8 mg/kg

...

10.4. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, ký hiệu);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày lấy mẫu và phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết);

d) ngày phòng thử nghiệm nhận được mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) kết quả thử nghiệm thu được và đơn vị tính;

g) độ lặp lại đã được kiểm tra;

...

i) mọi chi tiết thao tác khác với quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Số liệu về độ chụm

Các kết quả thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này [1] theo hướng dẫn của AOAC về quy trình nghiên cứu cộng tác để đánh giá hiệu lực các đặc trưng của phương pháp phân tích [2].

Bảng A.1 - Dữ liệu về độ chụm - Nước táo trong

Mẫu

Mức thấp

...

Mức cao

Mẫu bổ sung Blind

Năm thực hiện phép thử liên phòng thử nghiệm

1998-1999

Số lượng phòng thử nghiệm

...

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ

...

Số lượng kết quả được chấp nhận

Giá trị trung bình , mg/l

...

128

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/l

3,7

6,0

9,9

8,4

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD_r, %

...

Giới hạn lặp lại r[r = 2,8 x s_r]. mg/l

10,36

16,8

27,7

23,5

Độ lệch chuẩn tái lập s_R, mg/l

8,4

...

15,3

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R, %

Giới hạn tái lập R[R = 2,8 x s_R], mg/l

23,5

...

39,2

42,8

Độ thu hồi, %

89%±20%

Bảng A.2 - Dữ liệu về độ chụm - Nước táo đục

Mẫu

...

Mức trung bình

Mức cao

Mẫu bổ sung Blind

Năm thực hiện phép thử liên phòng thử nghiệm

1998-1999

Số lượng phòng thử nghiệm

...

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ

...

Số lượng kết quả được chấp nhận

Giá trị trung bình , mg/l

...

106

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/l

3,7

4,2

10,2

7,8

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD_r, %

...

Giới hạn lặp lại r[r = 2,8 x s_r]. mg/l

10,36

11,8

28,6

21,8

Độ lệch chuẩn tái lập s_R, mg/l

...

12,9

12,5

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R, %

Giới hạn tái lập R[R = 2,8 x s_R], mg/l

...

36,1

Độ thu hồi, %

80%±16%

Bảng A.3 - Dữ liệu về độ chụm- Puree táo

...

Mức thấp

Mức trung bình

Mức cao

Mẫu bổ sung Blind

Năm thực hiện phép thử liên phòng thử nghiệm

1998-1999

...

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

...

Số lượng kết quả được chấp nhận

...

121

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/kg

6,4

23,6

7,5

...

Giới hạn lặp lại r[r = 2,8 x s_r]. mg/kg

17,9

10,6

66,1

...

9,2

12,6

34,8

8,5

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R, %

...

25,7

35,3

97,4

23,8

Độ thu hồi, %

92%±12%

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] MacDonald S., Long M., Gilbert J., Felguerias, I. 2000, Liquid chromatography method for determination of patulin in clear and cloudy apple juices apple puree: collaborative study. J AOAC Int 83 (6), 1387 - 1394.

[2] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, pp. 23-51.