Tiêu chuẩn TCVN 13842-4:2023 về Phát hiện nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng real-time PCR - Phần 4: Phương pháp phát hiện ADN của gà

• Số hiệu: TCVN13842-4:2023
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2023

Chicken-77bp-F gồm các cặp base 313-328, Chicken-77bp-R gồm các cặp base 368-389 và Chicken-77bp-P gồm các cặp base 342-364 của gen TGF-β3 của gà, có mã số truy cập trong Ngân hàng gen là AY685072.1. Có thể sử dụng thuốc nhuộm reporter và/hoặc thuốc nhuộm quencher tương tự nếu cho các kết quả tương đương hoặc tốt hơn.

6  Thiết bị, dụng cụ

Các yêu cầu liên quan đến thiết bị, dụng cụ và vật liệu phải tuân theo TCVN 13841 (ISO 20813). Ngoài các thiết bị thông thường của phòng thử nghiệm, cần có các thiết bị sau.

6.1  Máy chu trình nhiệt real-time

Thiết bị khuếch đại ADN in vitro và thực hiện các chu trình nhiệt độ-thời gian cần thiết cho PCR. Ngoài ra, thiết bị phải có khả năng kích thích các phân tử huỳnh quang ở các bước sóng quy định và phát hiện đủ ánh sáng huỳnh quang phát xạ của chất đánh dấu huỳnh quang được dùng để thực hiện các phân tích định dạng TaqMan.

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị phần mẫu thử/mẫu thử

Mẫu thử được sử dụng để chiết ADN phải đại diện cho mẫu phòng thử nghiệm và đồng nhất, ví dụ bằng cách nghiền hoặc đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm thành hỗn hợp mịn. Chuẩn bị phần mẫu thử/mẫu thử cần tuân theo các yêu cầu chung và phương pháp cụ thể được nêu trong TCVN 7606 (ISO 21571) và TCVN 13841 (ISO 20813).

7.2  Chuẩn bị chất chiết ADN

...

...

...

7.3  Thiết lập PCR

7.3.1  Hỗn hợp phản ứng

Phương pháp này sử dụng tổng thể tích hỗn hợp phản ứng là 25 μL  cho mỗi phản ứng PCR. Thiết lập thành phần phản ứng như trong Bảng 2. Thuốc thử phải được rã đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng. Mỗi loại thuốc thử phải được trộn cẩn thận và ly tâm trong thời gian ngắn ngay trước khi lấy bằng pipet. Hỗn hợp thuốc thử PCR được chuẩn bị có chứa tất cả các thành phần trừ ADN mẫu thử. Tổng lượng hỗn hợp thuốc thử PCR cần được chuẩn bị phụ thuộc vào số phản ứng cần thực hiện, bao gồm ít nhất một lượng được lấy bằng pipet để dự phòng cho phản ứng bổ sung. Số lượng mẫu thử và các kiểm chứng lặp lại theo TCVN 13841 (ISO 20813). Thiết lập các phép thử PCR như sau:

a) trộn hỗn hợp thuốc thử PCR, ly tâm trong thời gian ngắn và dùng pipet lấy 20 μL cho vào mỗi lọ phản ứng;

b) thêm 5 μL từng ADN mẫu thử (từ 20 ng/μL đến 200 ng/μL) hoặc kiểm chứng dương ADN đích hoặc kiểm chứng chiết mẫu trắng hoặc nước vào các lọ phản ứng tương ứng;

c) trộn và ly tâm trong thời gian ngắn.

Bảng 2 - Thành phần phản ứng khuếch đại

Tổng thể tích phản ứng

25 μL

...

...

...

5 μL

2 x PCR master mix^a

12,5 μL

Mồi Chicken-77bp-F, c = 10 μmol/L và Chicken-77bp-R, c = 10 μmol/L

1,0 μL cho từng mồi

Đoạn dò Chicken-77bp-P, c = 10 μmol/L

0,5 μL

Nước

Đến 25 μL

...

...

...

7.3.2  Các kiểm chứng PCR

7.3.2.1  Yêu cầu chung

Các kiểm chứng PCR được nêu trong TCVN 7608 (ISO 24276) và TCVN 13841 (ISO 20813).

7.3.2.2  Kiểm chứng chất ức chế (phân tích gen tham chiếu)

Phải thực hiện phép phân tích PCR gen kiểm chứng tham chiếu (ví dụ: gen 18S rARN đối với sinh vật nhân thực, gen myostatin đối với động vật có vú và gia cầm) sử dụng các ADN mẫu thử để kiểm tra khả năng khuếch đại axit nucleic và đưa ra kiểm chứng để loại các kết quả âm tính giả.

7.3.3  Cài đặt máy chu trình nhiệt real-time PCR

Chuyển các lọ phản ứng đã chuẩn bị vào máy chu trình nhiệt. Các lọ phải được sắp xếp để tránh mọi thay đổi nhiệt độ có thể xảy ra ở thành lọ liên quan đến máy chu trình nhiệt real-time cụ thể. Bật chương trình nhiệt độ-thời gian.

7.4  Chương trình nhiệt-độ thời gian

Chương trình nhiệt độ-thời gian nêu trong Bảng 3 đã được sử dụng trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng. Việc sử dụng các điều kiện phản ứng và chu trình real-time PCR khác nhau cần được kiểm tra xác nhận. Thời gian biến tính ban đầu phụ thuộc vào master mix được sử dụng.

...

...

...

Bước

Thông số

Nhiệt độ

Thời gian

Đo huỳnh quang

Số chu trình

1

Biến tính ban đầu

95 °C

...

...

...

Không

1

2

Khuếch đại

Biến tính

95 °C

15 s

Không

45

...

...

...

60 °C

60 s

Có

8  Tiêu chí chấp nhận/từ chối

8.1  Yêu cầu chung

Cần sử dụng chương trình phân tích dữ liệu cụ thể đối với thiết bị real-time PCR tương ứng để xác định các sản phẩm PCR. Các kết quả khuếch đại có thể được biểu thị khác nhau, tùy thuộc vào thiết bị được sử dụng. Trong trường hợp không có sản phẩm PCR có thể phát hiện được (ví dụ: các kiểm chứng âm), kết quả phải được biểu thị là “không xác định”, “không khuếch đại” hoặc số chu kỳ phản ứng tối đa được thực hiện. Nếu xảy ra sự khuếch đại của trình tự đích ADN trong một mẫu thử (ví dụ: các kiểm chứng dương) thì có thể quan sát thấy đường cong khuếch đại hình chữ S (sigmoid-shaped).

Số chu kỳ được tính tại điểm giao nhau của đường cong khuếch đại và ngưỡng huỳnh quang [chu kỳ ngưỡng (C_t) hoặc chu kỳ định lượng (C_q)].

Nếu dữ liệu đo huỳnh quang không điển hình thì việc diễn giải tự động không cho kết quả có nghĩa, có thể cần thiết lập thủ công đường nền và ngưỡng trước khi diễn giải dữ liệu. Trong trường hợp này, áp dụng các hướng dẫn cho thiết bị cụ thể được cung cấp cùng với phần mềm diễn giải.

8.2  Xác định

...

...

...

- các mồi đặc hiệu của gà Chicken-77bp-F, Chicken-77bp-R và đoạn dò Chicken-77bp-P tạo thành đường cong khuếch đại hình chữ S và có thể tính được giá trị C_t hoặc giá trị C_q;

- các phản ứng kiểm chứng PCR không bổ sung ADN (kiểm chứng thuốc thử PCR, kiểm chứng chiết mẫu trắng) không tạo ra sự khuếch đại;

- các kiểm chứng khuếch đại (kiểm chứng dương ADN đích, kiểm chứng chất ức chế PCR) tạo ra sự khuếch đại và giá trị C_t (hoặc giá trị C_q) dự kiến.

Các phát hiện vết được xác định bằng PCR có giá trị C_t trễ hơn giá trị C_t xác định được tại LOD_{95 %} đích. Trong trường hợp phát hiện vết hoặc thu được các kết quả dương tính/âm tính trái ngược nhau từ các chất chiết khác nhau của cùng một mẫu thử, mẫu đó phải được thử lại. Cần chuẩn bị ít nhất hai chất chiết mới từ mẫu phòng thử nghiệm đã được đồng nhất. Tiến hành phân tích PCR ít nhất 20 lần lặp lại trên các chất chiết mới (ví dụ: phân tích PCR mười lần lặp lại đối với hai ADN chiết được, phân tích PCR bảy lần lặp lại đối với ba ADN chiết được). Trình tự đích được xem là “phát hiện được” nếu ≥ 95 % các kết quả PCR của chất chiết mới cho thấy phát hiện dương tính. Trình tự đích được xem là “không phát hiện được” nếu < 95 % các kết quả PCR của chất chiết mới cho thấy phát hiện dương tính.

9  Tình trạng xác nhận giá trị sử dụng và tiêu chí hiệu năng

9.1  Yêu cầu chung

Xác nhận giá trị sử dụng theo một quy trình gồm hai phần:

a) xác nhận giá trị sử dụng nội bộ;

b) xác nhận giá trị sử dụng bằng thử nghiệm cộng tác.

...

...

...

Độ vững (robustness) của phương pháp đã được khẳng định trong thử nghiệm cộng tác bằng cách thay đổi các điều kiện phản ứng đối với các yếu tố sau:

a) thiết bị real-time PCR (ví dụ: ABI 7500, BioRad CFX96, ABI 7900 HT Fast, Eppendorf Realplex 41));

b) thể tích phản ứng: 19 μL hoặc 21 μL hỗn hợp thuốc thử PCR cộng với 5 μL ADN mẫu thử (nồng độ từ 20 ng/μL đến 200 ng/μL);

c) nhiệt độ gắn mồi: 59 °C và 61 °C;

d) nồng độ mồi hoặc đoạn dò: đều giảm 30 %.

Đối với mỗi yếu tố được thử nghiệm, các phản ứng PCR được phân tích ba lần, mỗi lần 20 bản sao của trình tự đích và 100 bản sao của trình tự không phải đích là các kiểm chứng âm. Hiệu năng của phương pháp vẫn đạt yêu cầu đối với cả các mẫu thử và các kiểm chứng âm trong các điều kiện thay đổi đối với từng yếu tố thay đổi.

9.3  Độ tái lập

Độ tái lập của phương pháp được kiểm tra xác nhận trong thử nghiệm cộng tác có 13 phòng thử nghiệm tham gia, do Trung tâm Kỹ thuật Kiểm dịch Động vật, Thực vật và Thực phẩm, Hải quan Thượng Hải^[2^] tổ chức, phù hợp với nguyên tắc IUPAC^[3] và các hướng dẫn BVL^[4]. Các phòng thử nghiệm tham gia nhận được 12 mẫu ADN để đánh giá tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả. Tất cả các mẫu được dán nhãn với số mã hóa ngẫu nhiên và bao gồm sáu mẫu lặp lại. 12 mẫu ADN là:

- sáu lọ dung dịch ADN của gà, 10 bản sao/μL;

...

...

...

Sử dụng phương pháp real-time PCR nêu trong tiêu chuẩn này và dãy các dịch pha loãng plasmid ADN có chứa trình tự đích để xác định số bản sao. Nồng độ của plasmid-ADN (bản sao/μL) được đo bằng máy PCR kỹ thuật số.

Các phòng thử nghiệm tham gia nhận được PCR master mix và các oligonucleotid (các mồi và đoạn dò) từ đơn vị tổ chức thử nghiệm cộng tác để tiến hành các thử nghiệm PCR.

ADN bộ gen của gà và ngựa được chiết lần lượt từ thịt gà và thịt ngựa, sau đó được chỉnh bằng đệm 0,2 x TE đến nồng độ danh nghĩa tương ứng là 10 bản sao/μL đối với ADN của gà và 20 bản sao/μL đối với ADN của ngựa.

Thử nghiệm cộng tác được thiết kế để xác định tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả. Mỗi mẫu ADN được thử bởi các phòng thử nghiệm tham gia trong một thử nghiệm PCR duy nhất với 5 μL dung dịch ADN tương ứng, sử dụng quy trình và các điều kiện nêu trong Bảng 2 và Bảng 3. Kết quả của thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng 4.

Bảng 4 - Kết quả phép thử cộng tác

Số phòng thử nghiệm tham gia

13

Số phòng thử nghiệm đưa ra kết quả

13

...

...

...

12

Số kết quả được chấp nhận

156

Số mẫu thử được chấp nhận có chứa nguyên liệu từ gà

78

Số mẫu thử được chấp nhận không chứa nguyên liệu từ gà

78

Kết quả dương tính giả

0

...

...

...

0

Kết quả âm tính giả

0

Kết quả âm tính giả (tính bằng %)

0

9.4  Độ nhạy

Giới hạn phát hiện tuyệt đối (LOD_{95 %}) đối với phương pháp này là năm bản sao ADN. Thử nghiệm cộng tác phương pháp phát hiện ADN của gà được thực hiện đồng thời với các thử nghiệm cộng tác phương pháp phát hiện ADN của bò, lợn và cừu. Trình tự ADN đích của bò, cừu, lợn và gà được tổng hợp và tạo dòng trong vectơ pUC57 [chiều dài 2 710 bp, mã số truy cập trong Ngân hàng gen/Cơ sở dữ liệu của Châu Âu về trình tự nucleotid (EMBL) là Y14837]. Plasmid PUC57-bopc đã tạo thành này (chiều dài 3 127 bp) được giải trình tự để đảm bảo rằng chỉ một bản sao của trình tự ADN đích của bò, cừu, lợn và gà được chèn vào (xem Hình 1). Không thấy có đột biến bị xóa hoặc chèn trong các trình tự được chèn (xem Hình 2). Trình tự đích của các phương pháp PCR tương ứng được đưa ra.

Chú dẫn:

...

...

...

2  nt 63~150 = amplicon cừu (88 bp)

3  nt 244~340 = amplicon lợn (97 bp)

4  nt 341~417 = amplicon gà (77 bp)

5  Promoter ngược M13

6  Vị trí khởi đầu sao chép ColE1

7  Gen β-lactamase (gen kháng ampicillin)

8  Gen promoter kháng ampicillin

9  Promoter xuôi M13

Hình 1 - Sơ đồ plasmid ADN đa đích

...

...

...

Chú dẫn:

Đường một gạch liền đậm

nt 1~62 = amplicon bò (62 bp)

Đường hai gạch liền

nt 63~150 = amplicon cừu (88 bp)

Đường gạch ngang

nt 244~340 = amplicon lợn (97 bp)

Đường gạch chấm

nt 341~417 = amplicon gà (77 bp)

...

...

...

Mỗi phòng thử nghiệm tham gia vào thử nghiệm cộng tác nhận được một dung dịch chứa ADN plasmid pUC57 được chỉnh đến 1 000 bản sao/μL của trình tự đích (xem Tài liệu tham khảo [2], Hình 1 và Hình 2) trong ADN tinh trùng cá hồi nồng độ 20 ng/μL được phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm. Nồng độ được đo trước khi phân phối bằng thiết bị PCR kỹ thuật số (Hệ thống PCR Digital Droplet QX1002)). Dãy các dung dịch pha loãng thu được từ 13 phòng thử nghiệm nằm trong dải từ 0,02 bản sao/μL đến 4 bản sao/μL sử dụng đệm 0,2 x TE có chứa ADN tinh trùng cá hồi nồng độ 20 ng/μL được phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm. Mỗi phòng thử nghiệm tham gia đo sáu lần lặp lại cho mỗi mức nồng độ. Kết quả dương tính đạt được đối với 5 bản sao trên mỗi PCR bằng 78 trong số 78 lần thử nghiệm (xem Bảng 5).

Xác suất phát hiện (POD) mô tả xác suất mà quá trình khuếch đại PCR sẽ diễn ra tại một số bản sao đã cho của trình tự đích. Dữ liệu định tính thu được từ tất cả các phòng thử nghiệm và các mức pha loãng (xem Bảng 5) sử dụng để xác định POD = 0,95 của phương pháp phát hiện (xem Bảng 6) được nêu trong Tài liệu tham khảo [4]. Độ lệch chuẩn xác định được là 0,30 và LOD_{95 %} là 3,3 bản sao; cả hai thông số đều thấp hơn mức tối đa yêu cầu lần lượt là 1 bản sao và 20 bản sao^[^2^]^[5].

Bảng 5 - Kết quả thử nghiệm cộng tác đối với giới hạn phát hiện (LOD_95%)

Số bản sao gen TGF-β3 của gà trên mỗi phản ứng PCR (danh nghĩa)

Số kết quả dương tính (C_t < 45) trong 78 kết quả

20

78

10

78

...

...

...

78

2

69

1

42

0,5

25

0,1

6

...

...

...

Thông số

Gen TGF-β3 của gà

Số phòng thử nghiệm tham gia

13

Số lần lặp lại phân tích PCR trên mỗi mức pha loãng

6

Đường cong POD

Xác suất phát hiện trung bình giữa các phòng thử nghiệm (LPOD)

0,74

...

...

...

1,18

Độ lệch chuẩn phòng thử nghiệm, σ_L

0,30

LOD_95% (tính bằng các bản sao)

Trung vị của phòng thử nghiệm theo lý thuyết

3,3

9.5  Độ đặc hiệu

Trình tự đại diện từ gen TGF-β3 của gà (mã số truy cập của trình tự trong Ngân hàng gen là AY685072.1) được chọn làm đích PCR^[1]. Mồi và đoạn dò được thiết kế và tối ưu hóa bằng cách sử dụng phần mềm tối ưu hóa và lựa chọn đoạn dò-mồi.

Độ đặc hiệu loại trừ lý thuyết của mồi và đoạn dò gen TGF-β3 của gà được phân tích để xác định tính tương đồng với các loài khác sử dụng chương trình BLASTN^[6]. Sử dụng trình tự 77- bp làm trình tự truy vấn là một phần của trình tự có mã số truy cập trong NCBI là AY685072.1 (vị trí các nucieotid: 313-389). Các kết quả nghiên cứu về sự tương đồng được nêu trong Phụ lục A. Không có sự tương đồng với các gen khác và các loài khác.

...

...

...

Độ đặc hiệu mục tiêu được thử nghiệm với 10 giống gà (Gallus gallus) bao gồm gà Roman Hens (Đức, lấy trứng], gà Leghorns trắng (Ý, lấy trứng), gà Plymouth rock trắng (Mỹ, lấy thịt), gà Ross (Anh, lấy trứng), gà Langshan (Trung Quốc, lấy thịt và trứng), gà Luyuan (Trung Quốc, lấy thịt và trứng), gà Xiaoshan (Trung Quốc, lấy thịt và trứng), gà Yangshan (Trung Quốc, lấy thịt), gà Recessive Rocks trắng (Pháp, lấy thịt) và gà rừng lông đỏ (Gallus gallus) Jabouillei (Trung Quốc, lấy thịt). Với khoảng 100 bản sao của ADN đích, tất cả các mẫu giống gà đều được phát hiện với các tín hiệu dương tính và đường cong khuếch đại dự kiến. Độ chọn lọc mục tiêu của trình tự đích 77 base cũng được đánh giá bằng chương trình BLASTN dựa trên dữ liệu toàn bộ gen động vật của Ngân hàng gen. Các kết quả cho thấy trình tự đích 77 base là duy nhất đối với gà được nêu trong Phụ lục A.

Bảng 7 - Độ đặc hiệu của phương pháp phát hiện gen TGF-β3 của gà

Loài động vật thử nghiệm

Dự kiến về mặt lý thuyết

Khẳng định bằng thử nghiệm

Động vật

Bò bison (Bison bison)

N

N

...

...

...

N

N

Cá chép (Cyprinus carpio)

N

N

Mèo (Felis catus)

N

N

Bò nhà (Bos taurus)

...

...

...

N

Gà nhà (Gallus gallus domesticus)

Pos

Pos

Chó nhà (Canis familiaris)

N

N

Lừa (Equus asinus)

N

...

...

...

Vịt cổ xanh (Anas platyrhynchos)

N

N

Nai sừng xám (Cervus canadensis)

N

N

Dê (Capra hircus)

N

N

...

...

...

N

N

Ngỗng xám (Anser anser)

N

N

Ngựa (Equus caballus)

N

N

Bò Zebu (Bos indicus)

...

...

...

N

Gà rừng lỏng đỏ (Gallus gallus)

Pos

Pos

Chuột nhắt (Mus musculus)

N

N

Khỉ vàng (Macaca mulatta)

N

...

...

...

Đà điểu châu Phi (Struthio camelus)

N

N

Chim trĩ đỏ (Phasianus colchicus)

N

N

Lợn nhà (Sus scrota domesticus)

N

N

...

...

...

N

N

Chim cút thường (Coturnix coturnix)

N

N

Thỏ châu Âu (Oryctolagus cuniculus)

N

N

Chuọt cống (Rattus norvegicus)

...

...

...

N

Cừu (Ovis aries)

N

N

Cá hồi vân (Onchorhynchus mykiss)

N

N

Gà tây (Meleagris gallopavo)

N

...

...

...

Trâu (Bubalus bubalis)

N

N

Bò hoang Tây Tạng (Bos mutus)

N

N

Người

Người (Homo sapiens)

N

...

...

...

Thực vật

Cỏ linh lăng (Medicago sativa)

N

N

Ngô (Zea mays)

N

N

Cải dầu (Brassica rapa)

N

...

...

...

Lúa (Oryza sativa)

N

N

Cao lương (Sorghum bicolor)

N

N

Đậu tương (Glycine max)

N

N

...

...

...

N

N

Chú dẫn

Pos: dương tính; N: âm tính

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải được lập theo quy định trong TCVN 13841 (ISO 20813) và các tiêu chuẩn có thể áp dụng khác [ví dụ: TCVN 7608 (ISO 24276)].

Phụ lục A

(Tham khảo)

...

...

...

A.1  Trình tự truy vấn

A.1.1  ID trình tự truy vấn: AY685072.1 (bp 313-389).

A.1.2  Mô tả: gen intron 4 có yếu tố tăng trường chuyển dạng beta 3 (TGF-β3) của gà rừng lông đỏ (Gallus gallus).

A.1.3  Loại phân tử: axit nucleic.

A.1.4  Chiều dài trình tự truy vấn: 77.

A.2  Sự phân phối 2 Blast hit trên 2 trình tự tham chiếu trong cơ sở dữ liệu của Ngân hàng gen

Xem Hình A.1.

Chú dẫn:

...

...

...

Hình A.1 - Chú dẫn đối với các điểm bắt cặp

A.3  Mô tả

Bảng A.1 - Mô tả

Mô tả

Điểm tối đa

Điểm tổng số

Tỷ lệ bao phủ

%

Giá trị E

...

...

...

%

Mã số truy cập

Phân lập nhiễm sắc thể 5 của gà RJF#256 giống gà rừng lông đỏ loài gà rừng lông đỏ (Gallus gallus), GRCg6a

143

143

100

2e-30

100

NC_006092.5

...

...

...

106

106

97

2e-19

93,75

NC_015015.2

A.4  Bắt cặp

Phân lập nhiễm sắc thể 5 của gà RJF#256 loài gà rừng lông đỏ (Gallus gallus) giống gà rừng lông đỏ, GRCg6a, ID trình tự: NC_006092.5 Chức năng: tiền proprotein có yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta-3

Chiều dài: 59809098

...

...

...

Dải 1: từ 38672925 đến 38673001

Điểm

Kỳ vọng

Độ tương đồng

Khoảng trống

Mạch

143 bit (55)

2e-30()

77/77 (100 %)

...

...

...

Dương/Âm

Phân lập nhiễm sắc thể 5 của NT-WF06-2002-E0010 nhãn hiệu Nicholas giống Avigen loài gà tây hoang (Meleagris gallopavo), Turkey_5.0, ID trình tự: NC_015015.2

Chiều dài: 59006440

Số điểm khớp: 1

Dải 1: từ 37540933 đến 37541007

Điểm

Kỳ vọng

Độ tương đồng

...

...

...

Mạch

106 bit (57)

2e-19()

69/75 (92 %)

0/75 (0 %)

Dương/Dương

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...

[2] WANG Q., CAI Y.C., HE Y.P., YANG L.T., PAN L.W. Collaborative ring trial of two real-time PCR assays for the detection of porcine-and chicken-derived material in meat products. Plos ONE. 2018, 13(10), pp. e0206609

[3] HORWITZ W. Protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies. Pure and Appl. Chem. 1995, 67, pp. 331-343

[4] Guidelines for the validation of qualitative real-time PCR methods by means of a collaborative study. Federal Office of Consumer Protection and Food Safety. Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL)

[5] UHLIG S., FROST K., COLSON B., SIMON K., MÄDE D., REITING R., GOWIK P., GROHMANN L. Validation of qualitative PCR methods on the basis of mathematical-statistical modelling of the probability of detection. Accred Qual Assur. 2015, 20, pp. 75-83

[6] National Center for Biotechnology Information (NCBI], Available at (accessed 2019-07-28]: https://blast.ncbi.nlm,nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE TYPE=BlastSearch&LINK LOC=blasthome

1) Đây là các ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.

2) Đây là các ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo sự thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương đương.