Tiêu chuẩn TCVN 13841:2023 Phương pháp phát hiện và xác định nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm và sản phẩm thực phẩm (dựa trên axit nucleic)

• Số hiệu: TCVN13841:2023
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2023

7.5  Phân tích dữ liệu

7.5.1  Kiểm chứng

Mỗi kiểm chứng phải có một giá trị hợp lệ và nếu kết quả quan sát được đối với mọi kiểm chứng bất kỳ khác với giá trị hợp lệ thì cần lặp lại phép phân tích. Các kiểm chứng môi trường có kết quả dương tính phải luôn bắt đầu bằng các biện pháp loại bỏ và ngăn ngừa ô nhiễm môi trường phòng thử nghiệm. Nếu thu được nhiều lần kết quả không hợp lệ đối với mọi biện pháp kiểm soát bất kỳ khác thì cần thực hiện các biện pháp xác định vị trí và loại bỏ/thay thế các nguồn gây lỗi và tiến hành lặp lại phân tích. Các kết quả phân tích chỉ được báo cáo khi tất cả các kiểm chứng cho các giá trị hợp lệ và các giá trị hợp lệ đối với các kiểm chứng là như sau:

- kiểm chứng chiết mẫu trắng phải luôn âm tính;

- kiểm chứng chiết dương phải luôn dương tính;

- các kết quả âm tính phải luôn âm tính (kết quả mẫu âm tính là hợp lệ, ngay cả khi kiểm chứng ADN đích âm tính là không hợp lệ, nếu tất cả các kiểm chứng khác đều hợp lệ).

- kiểm chứng dương ADN đích phải luôn dương tính;

- kiểm chứng âm ADN đích phải luôn âm tính;

- kiểm chứng thuốc thử phản ứng PCR phải luôn âm tính;

...

...

...

Các kiểm chứng trên phải được sử dụng để diễn giải /báo cáo kết quả mẫu thử.

7.5.2  Phản ứng PCR truyền thống

Các amplicon được tạo ra bằng phản ứng PCR truyền thống phải có độ dài dự kiến (ví dụ: biểu hiện trên gel). Để tránh các kết quả dương tính giả, có thể thực hiện việc kiểm tra xác nhận amplicon thu được bằng cách lai, giải trình tự, phân tích enzym giới hạn hoặc thực hiện phương pháp đặc hiệu kiểm tra xác nhận trình tự thích hợp khác ngoài phép khẳng định độ dài.

CHÚ THÍCH: Phép phân tích nhiệt độ nóng chảy đôi khi được sử dụng để kiểm tra xác nhận amplicon nhưng không đặc hiệu đối với trình tự.

7.5.3  Đường khuếch đại real-time PCR

Các đường khuếch đại real-time PCR cần được kiểm tra trực quan về hình dạng chữ S để loại trừ các hình dạng ảo/kết quả dương tính giả.

CHÚ THÍCH: Phép phân tích nhiệt độ nóng chảy đôi khi được sử dụng để kiểm tra xác nhận amplicon nhưng không đặc hiệu đối với trình tự.

7.6  Biểu thị kết quả

7.6.1  Biểu thị các kết quả dương tính

...

...

...

VÍ DỤ: Đối với chất phân tích đích X, phát hiện sự có mặt của ADN có nguồn gốc từ (trình tự đích đặc hiệu và nhóm các loài hoặc nhóm phân loại động vật).

CHÚ THÍCH: Phạm vi của phép phân tích này chỉ cho thấy sự có mặt/không có mặt ADN của các loài động vật được định danh, không cho thấy sự có mặt hay không có mặt của mô các loài động vật đó (ví dụ: ADN có nguồn gốc từ trứng, gelatin).

Các kết quả đối với tất cả các phần mẫu thử của một mẫu trong một lần phân tích phải nhất quán. Khi ít nhất một phần mẫu thử cho kết quả dương tính và ít nhất một phần mẫu thử cho kết quả âm tính thì phải lặp lại phép phân tích PCR.

Nếu các kết quả PCR của lần phân tích thứ hai đối với tất cả các phần mẫu thử không giống nhau thì cần lặp lại quá trình chiết ADN và phân tích PCR.

Nếu ít nhất hai lần lặp lại quy trình (bắt đầu từ quá trình chiết ADN) cho kết quả không rõ ràng là kết quả dương tính và âm tính, thì báo cáo phải nêu rõ mẫu thử là âm tính ở giới hạn phát hiện.

Kết quả phải đưa ra độ đặc hiệu (nhóm các loài hoặc nhóm hoặc các nhóm phân loại) và đích (nhân, ty thể hoặc loại khác) của phương pháp cho phép diễn giải rõ ràng và có thể so sánh được các kết quả.

7.6.2  Biểu thị các kết quả âm tính

Các kết quả âm tính được mô tả cho thấy không phát hiện được ADN có nguồn gốc từ đích.

VÍ DỤ: Đối với chất phân tích đích X, không phát hiện được ADN có nguồn gốc từ loài động vật cụ thể.

...

...

...

Kết quả của các phương pháp định lượng phải có đơn vị đo.

Xem ví dụ trong Phụ lục B.

Kết quả phải đưa ra độ không đảm bảo đo cũng như các cách hiệu chuẩn và phương pháp tính được sử dụng, nếu thích hợp.

Giải thích khả năng áp dụng của kết quả đo liên quan đến phần trăm khối lượng của các loài đích trong mẫu.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm tham khảo TCVN ISO/IEC 17025 (ISO/IEC 17025) và ít nhất bao gồm các nội dung sau:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử;

- viện dẫn đến tiêu chuẩn này và các phụ lục tương ứng kèm theo;

- ngày và loại quy trình lấy mẫu được sử dụng (nếu biết);

...

...

...

- ngày bắt đầu/kết thúc phân tích, nếu có;

- tổ chức chịu trách nhiệm phân tích;

- đơn vị đo và phương pháp đo, nếu có;

- phần mẫu thử được sử dụng để phân tích;

- kết quả theo yêu cầu của phương pháp đặc hiệu và theo quy định trong Điều 6;

- các phương pháp và hệ thống được sử dụng;

- LOD của phương pháp phân tích như LOD_rel và/hoặc LOD_abs đối với các kết quả định tính;

- LOQ thực tế đối với các kết quả định lượng;

- bất kỳ sự quan sát bất thường nào trong thử nghiệm;

...

...

...

Thông tin phải được đưa ra cùng với đơn vị đo.

Theo yêu cầu, độ không đảm bảo đo và mức độ tin cậy của phép đo tính bằng cùng đơn vị đo phải được cung cấp cho người sử dụng kết quả (ví dụ %).

Phụ lục A

(Tham khảo)

Danh sách các loài điển hình được sử dụng để thử nghiệm độ chọn lọc mục tiêu và độ chọn lọc loại trừ

Các loài điển hình được sử dụng để thử nghiệm độ chọn lọc mục tiêu và độ chọn lọc loại trừ được liệt kê trong Bảng A.1 đến Bảng A.8.

Bảng A.1 - Ví dụ về các loài động vật có vú liên quan

Số thứ tự

...

...

...

Tên Latinh

1

Linh dương nhảy

Antidorcas marsupialis

2

Cá voi Minke

Balaenoptera acutorostrata

3

Cá voi Minke Nam cực

...

...

...

4

Cá voi Sei

Balaenoptera borealis

5

Cá voi Bryde

Balaenoptera edeni

6

Cá voi vây (cá voi lưng xám)

Balaenoptera physalus

...

...

...

Cá voi mõm khoằm Arnoux

Barardius arnuxii

8

Cá voi mõm khoằm Baird

Barardius bairdii

9

Bò bison

Bison bison

10

...

...

...

Bos mutus

11

Bò nhà

Bos taurus

12

Trâu

Bubalus bubalis

13

Lạc đà hai bướu

...

...

...

14

Lạc đà một bướu

Camelus dromedarus

15

Chó nhà

Canis lupus familiaris

16

Dê

Capra hircus

...

...

...

Hoẵng châu Âu

Capreolus capreolus

18

Hươu đỏ

Cervus elaphus

19

Hươu sao

Cervus nippon

20

...

...

...

Connochaetes spp.

21

Hươu hoang

Dama dama

22

Lừa

Equus asinus

23

Ngựa

...

...

...

24

Mèo

Felis catus

25

Cá voi hoa tiêu vây ngắn

Globicephala macrorhynchus

26

Người

Homo sapiens

...

...

...

Chuột lang nước

Hydrochoerus hydrochaeris

28

Thỏ rừng châu Âu

Lepus europaeus

29

Chuột túi đỏ

Macropus rufus

30

...

...

...

Oryctolagus cuniculus

31

Linh dương Gemsbok

Oryx gazelle

32

Cừu

Ovis aries

33

Cá nhà táng

...

...

...

34

Cá heo Dall

Phocoenoides dalli

35

Chuột nâu

Rattus norvegicus

36

Sơn dương Chamois

Rupicapra rupicapra

...

...

...

Cá heo sọc

Stenella coeruleoalba

38

Lợn nhà

Sus scrota domesticus

39

Lợn rừng

Sus scrota scrota

40

...

...

...

Tragelaphus strepsiceros

41

Cá heo mũi chai

Tursiops truncatus

Bảng A.2 - Ví dụ về các loài chim có liên quan

Số thứ tự

Tên tiếng Việt

Tên Latinh

1

...

...

...

Anas platyrhynchos

2

Ngỗng xám

Anser anser

3

Ngan bướu mũi

Cairina moschsta

4

Bồ câu núi

...

...

...

5

Chim cút thường

Coturnix coturnix

6

Gà rừng lông đỏ

Gallus gallus

7

Gà tây

Meleagris gallopavo

...

...

...

Gà sao

Numida meleagris

9

Đà điểu châu Phi

Struthio camelus

Bảng A.3 - Ví dụ về các loài bò sát có liên quan

Số thứ tự

Tên tiếng Việt

Tên Latinh

...

...

...

Cá sấu sông Nile

Crocodylus niloticus

2

Cá sấu hoa cà (cá sấu nước mặn)

Crocodyius porosus

Bảng A.4 - Ví dụ về các loài lưỡng cư có liên quan

Số thứ tự

Tên tiếng Việt

Tên Latinh

...

...

...

Cóc bò

Leptodactylus pentadactylus

2

Ếch ương beo

Rana catesbeiana

3

Ếch xanh

Pelophylax esculentus

4

...

...

...

Hoplobatrachus tigerinus

Bảng A.5 - Ví dụ về các loài cá có liên quan

Số thứ tự

Tên tiếng Việt

Tên Latinh

1

Cá chình châu Âu

Anguilla anguilla

2

...

...

...

Anguilla japonica

3

Cá hồng

Beryx splendens

4

Cá trích Đại Tây Dương

Clupea harengus

5

Cá trích Thái Bình Dương

...

...

...

6

Cá thu đao

Cololabis saira

7

Cá cơm Argentina

Engraulis anchoita

8

Cá cơm châu Âu

Engraulis encrasicolus

...

...

...

Cá cơm Nhật Bản

Engraulls japonicus

10

Cá cơm California

Engraulis mordax

11

Cá cơm Peru

Engraulis ringens

12

...

...

...

Gadus chalcogrammus

13

Cá tuyết Thái Bình Dương

Gadus macrocephalus

14

Cá tuyết Đại Tây Dương

Gadus morhua

15

Cá tuyết Greenland

...

...

...

16

Cá bơn lưỡi ngựa Đại Tây Dương

Hippoglossus hippoglossus

17

Cá bơn lưỡi ngựa Thái Bình Dương

Hippoglossus stenolepis

18

Cá cờ sọc

Kajikia audax

...

...

...

Cá ngừ vằn

Katsuwonus pelamls

20

Cá vược Nhật Bản

Lateolabrex japonicus

21

Cá chày vàng

Lophius litulon

22

...

...

...

Oncorhunchus gorbuscha

23

Cá hồi Coho (cá hồi bạc)

Oncorhunchus kisutch

24

Cá hồi Chinook (cá hồi vua)

Oncorhunchus tschawytscha

25

Cá hồi Chum (cá hồi chó)

...

...

...

26

Cá hồi Masu

Oncorhynchus masou masou

27

Cá hồi vân

Oncorhynchus mykiss

28

Cá hồi đỏ

Oncorhynchus nerka

...

...

...

Cá tráp đỏ Nhật Bản

Pagrus major

30

Cá bơn olive (cá bơn vỉ)

Paralichthys olivaceus

31

Cá bơn vàng

Pseudopleuronectes herzensteini

32

...

...

...

Reinhardtius hippoglossoides

33

Cá hồi Đại Tây Dương

Salmo salar

34

Cá mòi Nhật Bản

Sardinops melanostictus

35

Cá mòi Thái Bình Dương

...

...

...

36

Cá thu lam (cá nục hoa)

Scomber australasicus

37

Cá sa ba

Scomber japonicus

38

Cá thu Đại Tây Dương

Scomber scombrus

...

...

...

Cá hổ

Sebastiscus marmoratus

40

Cá cam sọc

Serbia dumerili

41

Cá cam sọc vàng

Serbia lalandi

42

...

...

...

Serbia quinqueradiata

43

Cá trứng Nhật Bản

Spirinchus lanceolatus

44

Cá nóc hổ

Takifugu rubripes

45

Cá ngừ vây dài

...

...

...

46

Cá ngừ vây vàng

Thunnus albacares

47

Cá ngừ vây xanh phương Nam

Thunnus maccoyii

48

Cá ngừ mắt to

Thunnus obesus

...

...

...

Cá ngừ vây xanh Thái Bình Dương

Thunnus orientalis

50

Cá ngừ Đại Tây Dương

Thunnus thymus

51

Cá sòng Nhật Bản

Trachurus japonicus

52

...

...

...

Trachurus trachurus

53

Cá tuyết lưng nâu

Trisopterus luscus

54

Cá kiếm

Xiphias gladius

Bảng A.6 - Ví dụ về động vật thân mềm có liên quan

Số thứ tự

...

...

...

Tên Latinh

1

-

Amphioctopus fangsiao

2

Bạch tuộc khổng lồ Thái Bình Dương

Enteroctopus dofleini

3

Mực ống

...

...

...

4

Bạch tuộc thông thường

Octopus vulgaris

5

Mực lá

Sepioteuthis lessoniana

6

Mực ống Nhật bản

Todarodes pacificus

...

...

...

Mực đom đóm

Watasenia scintillans

Bảng A.7 - Ví dụ về các loài giáp xác có liên quan

Số thứ tự

Tên tiếng Việt

Tên Latinh

1

Cua Tanner

Chionoecetes bairdi

...

...

...

Cua tuyết đỏ

Chionoecetes japonicus

3

Cua tuyết

Chionoecetes opilio

4

Tôm Shiba

Metapenaeus joyneri

5

...

...

...

Pandalus eous

6

Tôm rồng Nhật Bản

Pamlirus japonicus

7

Cua Alaska

Paralithodes camtschatica

8

Cua hoàng đế xanh

...

...

...

9

Tôm sú

Penaeus mondon

Bảng A.8 - Ví dụ về côn trùng có liên quan

Số thứ tự

Tên tiếng Việt

Tên Latinh

1

Họ Rệp bướu thông

...

...

...

2

Họ Rệp muội

Aphididae

3

Họ Ngài đèn

Arctiidae

4

Họ Gián

Blattellinae

...

...

...

Họ Gián thường

Blattidae

6

Họ Ruồi xanh (họ Nhặng)

Calliphoridae

7

Họ Chân chạy

Carabidae

8

...

...

...

Ceratopogonidae

9

Họ Muỗi chỉ hồng

Chironomidae

10

Họ Ánh kim (họ Cánh cứng ăn lá)

Chrysomelidae

11

Họ Bọ cánh gân

...

...

...

12

Họ Ve sầu

Cicadidae

13

Họ Bọ cánh cứng phẳng

Cucujidae

14

Họ Muỗi

Culicidae

...

...

...

Họ Bọ vòi voi

Curculionidae

16

-

Dermestidae

17

Họ Ruồi giấm

Drosophilidae

18

...

...

...

Elateridae

19

Họ Cánh da đuôi kìm

Forficulidae

20

Họ Kiến

Formicidae

21

Họ Dế mèn

...

...

...

22

-

Latridiidae

23

Họ Chuồn chuồn ngô

Libellulidae

24

-

Monotomidae

...

...

...

Họ Ruồi nhà

Muscidae

26

Họ Ruồi ăn nấm

Mycetophilidae

27

Họ Bọ có đuôi

Nitidulidae

28

...

...

...

Noctuidae

29

Họ Ngài thiên xã

Notodontidae

30

Họ Bọ xít năm đốt râu

Pentatomidae

31

Họ Ruồi lưng gù

...

...

...

32

Họ Rệp bướu nho

Phylloxeridae

33

Họ Ruồi nhỏ

Piophilidae

34

Bộ Rệp sáp (bộ Mọt)

Psocoptera

...

...

...

Họ Ruồi cống (họ Ruồi cánh bướm)

Psychodidae

36

Họ Ngài sáng

Pyralidae

37

Họ Ruồi xám

Sarcophagidae

38

...

...

...

Stratiomyidae

39

Họ Ruồi ăn rệp

Syrphidae

40

Họ Chân bò

Tenebrionidae

41

Họ Ruồi đục quả

...

...

...

42

Họ Ruồi sếu mùa đông

Trichoceridae

43

Họ Ong

Vespinae

44

Họ Ngài sủi

Zygaenidae

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Ví dụ về các phương pháp chuyển đổi đơn vị từ số bản sao ADN sang tỷ lệ khối lượng

B.1  Yêu cầu chung

Phụ lục này đưa ra các ví dụ về các phương pháp chuyển đổi đơn vị từ số bản sao ADN sang tỷ lệ khối lượng,

Các ví dụ sau được coi là các phương pháp đã chuẩn hóa, tuy nhiên, việc ước lượng có nhiều khả năng chứa độ không đảm bảo đo do hàm lượng ADN khác nhau trên mỗi khối lượng tương đương trong các mô và mức độ xử lý khác nhau.

B.2  Ví dụ về việc chuyển đổi kết quả đo được biểu thị bằng tỷ lệ số bản sao ADN sang tỷ lệ khối lượng sử dụng mẫu chuẩn

Xem Tài liệu tham khảo [6].

Tỷ lệ số bản sao ADN thu được trong thử nghiệm định lượng có thể được chuyển đổi sang tỷ lệ khối lượng bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn (RM).

...

...

...

Có thể sử dụng RM không có số bản sao ADN hoặc giá trị khối lượng ADN đối với thịt được quy định làm nền mẫu.

Tính phần khối lượng của hệ số chuyển đổi (CF) bằng Công thức (B.1):

(B.1)

Trong đó:

F_c  là giá trị của hệ số chuyển đổi;

C_rt  là số bản sao của các loài động vật đích hoặc nhóm phân loại trong mẫu chuẩn;

M_rt  là khối lượng mẫu chuẩn của các loài động vật đích hoặc nhóm phân loại.

Vì cơ sở để đo số bản sao đích trong cùng một nền mẫu được sử dụng để tính CF, do đó, ví dụ về công thức tính % đích (phần khối lượng) nêu trong Công thức B.2:

...

...

...

(B.2)

Trong đó:

T  là phần trăm khối lượng của các loài đích trong nền mẫu;

C_s  là số bản sao của các loài động vật đích được đo theo các yêu cầu, bao gồm các loài được mô tả trong 4.8;

M_s  là khối lượng của toàn bộ mẫu để phân tích.

Độ không đảm bảo của hệ số chuyển đổi được sử dụng kết hợp với độ không đảm bảo đo. Số lượng ADN thay đổi tùy thuộc vào loại thịt và các phần thịt, điều quan trọng là phải ước tính độ không đảm bảo bằng cách xem xét.

B.3  Ví dụ về phép định lượng tương đối hàm lượng nguyên liệu có nguồn gốc từ các loài động vật trong các sản phẩm thịt

B.3.1  Kết quả phân tích được báo cáo theo phần khối lượng

Việc biểu thị kết quả phân tích định lượng theo phần khối lượng là một cách tiếp cận phổ biến trong nhiều lĩnh vực (GMO, các chất gây dị ứng, v.v...) sử dụng công nghệ dựa trên ADN, nếu không kết quả không được hầu hết các nhà chuyên môn/chuyên gia đánh giá/cơ quan quản lý thực phẩm chấp nhận/sử dụng. Thực tế, không có mối quan hệ định lượng nhất quán giữa số bản sao ADN và hàm lượng thịt của một mẫu, do đó, ví dụ về việc chuyển đổi được nêu trong EUR 28536 EN^[^11^]. Tiêu chuẩn này tóm tắt các nội dung chính về cách so sánh và thiết lập các kết quả có thể truy nguyên trong hệ thống đo lường từ các phép đo phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (real-time PCR), nếu dữ liệu được gắn với giá trị đã được chứng nhận của mẫu chuẩn.

...

...

...

B.3.2  Chuyển đổi kết quả đo được biểu thị bằng số bản sao trên mỗi bộ gen đơn bội tương đương (cp/HGE) sang phần khối lượng

B.3.2.1  Yêu cầu chung

Cần chuyển đổi kết quả đo thu được bằng real-time PCR sử dụng chất hiệu chuẩn, được biểu thị bằng số bản sao trên mỗi bộ gen đơn bội tương đương (cp/HGE) sang phần khối lượng. Tổng quan về các khả năng thay đổi để đo hàm lượng động vật có trong mẫu được thể hiện trong Hình B.1.

CHÚ THÍCH 1: Trong tùy chọn 1, hàm lượng động vật được xác định bằng real-time PCR sử dụng CRM hoặc nguyên liệu tương đương (ví dụ: mẫu mô phỏng) được chỉnh theo phần khối lượng dùng làm chất hiệu chuẩn. Các kết quả được biểu thị bằng phần khối lượng (g/kg) hoặc % khối lượng.

CHÚ THÍCH 2: Trong tùy chọn 2, hàm lượng động vật được xác định bằng real-time PCR sử dụng nguyên liệu hiệu chuẩn để xác định số bản sao. Các kết quả thu được (tính bằng cp/HGE) được chuyển đổi thành phần khối lượng (g/kg), sử dụng CF.

CHÚ THÍCH 3: Được điều chỉnh theo Tài liệu tham khảo [11] có sửa đổi.

Hình B.1 - Tổng quan về các khả năng thay đổi để đo hàm lượng nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật có trong một mẫu

Sử dụng phương pháp định lượng tương đối, phân tích ADN phân lập bằng ít nhất hai hệ thống real-time PCR đối với các gen đích đơn lẻ: phân tích real-time PCR đặc hiệu đối với các loài để xác định hàm lượng ADN của động vật cần phân tích và phân tích real-time PCR chuẩn để xác định lượng ADN động vật tổng số (ví dụ: gen myostatin, sự kết hợp của các hệ thống đơn mồi để tổng hợp lượng ADN tổng số của động vật có vú và gia cầm). Cả hai phép phân tích real-time PCR đều được hiệu chuẩn. Các đường cong hiệu chuẩn thu được bằng cách dựng đồ thị logarit của nồng độ ADN so với giá trị chu kỳ định lượng (Cq) tương ứng. Sau khi thiết lập các đường chuẩn cho cả hai phép phân tích PCR, sử dụng đường hồi quy tuyến tính, lượng ADN tổng số của động vật có vú và gia cầm trong mẫu được xác định và tính tỷ lệ phần trăm của động vật cụ thể.

...

...

...

Để đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp định lượng, cần phân tích và tính độ thu hồi của các kiểm chứng định lượng dương tính với thành phần đã biết. Nền mẫu và thành phần của các kiểm chứng định lượng dương tính được xem xét tương tự như mẫu.

VÍ DỤ: Pha loãng ADN trong phân tích PCR gen tham chiếu đích (ví dụ: myostatin) trong dung dịch đệm hoặc nước không chứa nuclease (ví dụ: các dung dịch pha loãng có nồng độ từ 150 ng ADN/PCR đến 1 ng ADN/PCR được sử dụng để dựng đường chuẩn cho gen tham chiếu). Để dựng đường chuẩn cho ADN đích của động vật, sử dụng 150 ng ADN/PCR chiết được từ nguyên liệu mô phỏng có chứa lượng giảm dần của động vật đích (ví dụ: sử dụng từ 50 g/kg đến 1 g/kg). Lượng ADN đích trong phép phân tích được chiết từ nguyên liệu mô phỏng có chứa 50 g/kg động vật đích (tương ứng với phần khối lượng là 5 %) cũng được coi là 5 % số bản sao ADN đích (nghĩa là 7,5 ng ADN đích trên mỗi phản ứng PCR tốt cho phản ứng chứa 150 ng ADN). Tỷ lệ gần đúng tương tự cũng thu được đối với mẫu chuẩn khác có chứa phần khối lượng nhỏ hơn của gen đích động vật hoặc gen tham chiếu. Lượng (hoặc nồng độ tính bằng %) ADN đích của động vật và ADN gen tham chiếu trong dung dịch ADN chiết được từ mẫu chưa xác định sau đó được tính bằng cách chuyển đổi các giá trị Cq đo được thành các giá trị khối lượng sử dụng hai đường chuẩn và phân chia chúng. Phần khối lượng động vật (động vật đích so với gen tham chiếu đích) cuối cùng được nhân với 100 để biểu thị kết quả dưới dạng phần trăm.

Các phương pháp đã được công bố để định lượng tương đối hàm lượng các loài động vật trong các sản phẩm thịt được nêu trong Bảng B.1.

Bảng B.1 - Phương án định lượng dựa trên real-time PCR

Phương án định lượng dựa trên real-time PCR

Hiệu chuẩn

Biểu thị kết quả bằng

Tài liệu

Chất hiệu chuẩn

...

...

...

Phương pháp đường chuẩn sử dụng gen tham chiếu

Hỗn hợp ADN (tính số bản sao)

cp/μl

% ADN (tỷ lệ số bản sao)

Lau be et al. (2007)^[22]

Iwobi et al. (2015)^[^18]

Hỗn hợp ADN

ng/μl

...

...

...

Druml et al. (2015)^[^15^]

Kaltenbrunner et al. (2018)^[19^]

Kaltenbrunner et al. (2018)^[2^0]

Chất chiết thịt (hỗn hợp lysate)

ng/μl

%ADN (phần khối lượng)

Hỗn hợp thịt

ng/μl

...

...

...

Druml et al. (2016)^[16]

Nền mẫu mô phỏng

ng/μl

% ADN (phần khối lượng)

Phương pháp đường chuẩn sử dụng phương pháp đã chuẩn hóa

Hỗn hợp ADN

ng/μl

% ADN (phần khối lượng)

...

...

...

BVL L 08.00-61^[^13^]

BVL L 08.00-62^[^14^]

Nền mẫu mô phỏng

ng/μl

% ADN (phần khối lượng)

Eugster et al. (2009)^[^17^]

B.3.2.2  Ví dụ: Định lượng tương đối dựa trên gen tham chiếu (phương pháp đường chuẩn)

...

...

...

Cách tiến hành:

- ADN của bộ gen được chiết từ các mẫu mô cơ của các loài (mẫu đối chứng) và đo nồng độ ADN (tính bằng ng/μl) (bằng máy Nanodrop, PicoGreen, v.v...) hoặc sử dụng ADN plasmid làm chuẩn hiệu chuẩn;

- chạy PCR đơn mồi đối với các loài đích và động vật đích phổ cập cùng các ADN hiệu chuẩn (ít nhất bốn chuẩn với các dung dịch pha loãng ADN và bộ gen tương đương cho mỗi phản ứng với số lượng xác định, ví dụ: 156 250, 31 250, 6 250,1 250, 250, 50) và ADN mẫu;

- sử dụng giá trị Cq của các chuẩn cho đường chuẩn, giá trị Cq của mẫu để tính nồng độ đặc hiệu của loài (số bản sao/μl);

- số bản sao được tạo thành đối với mỗi loài được ngoại suy dựa vào số bản sao tính được đối với gen tham chiếu của động vật phổ cập, để đưa ra tỷ lệ loài x hoặc loài y, v.v...

Công thức (cho từng loài đích PCR):

Trong đó:

...

...

...

P_y  là phần trăm của loài đích Y;

C_sx  là số bản sao của loài đích X, tính bằng (cp/μl);

C_sy  là số bản sao của loài đích Y, tính bằng (cp/μl);

C_r là số bản sao của gen tham chiếu phổ cập (cp/μl).

Ví dụ về kích thước bộ gen của một số loài được liệt kê trong Bảng B.2.

Bảng B.2 - Kích thước bộ gen để tính số bản sao bộ gen

Loài

Cặp base

Kích thước bộ gen

...

...

...

Bò

3,65 x 10^9

4,00

Lợn

3,11 x 10^9

3,41

Cừu

3,25 x 10^9

3,56

...

...

...

3,20 x 10^9

3,51

Gà

1,25 x 10^9

1,37

Gà tây

1,68 x 10^9

1,84

Vịt

...

...

...

1,69

Để biết thêm thông tin, xem Tài liệu tham khảo [18] và [22],

B.3.2.2.2  Khuếch đại PCR đa mồi hoặc đơn mồi trình tự đích đặc hiệu của loài và trình tự đích nội sinh của loài động vật phổ cập (gen tham chiếu, trong PCR đơn mồi) dựa vào ADN được khuếch đại (ng/μl).

Cách tiến hành:

- hiệu chuẩn:

- hỗn hợp ADN: chiết ADN của bộ gen từ các mẫu mô cơ của loài (mẫu đối chứng) và đo nồng độ ADN (tính bằng ng/μl) (bằng máy Nanodrop, PicoGreen, v.v...) hoặc sử dụng ADN plasmid với các đích đặc hiệu đối với các loài khác nhau; ADN bộ gen hoặc ADN plasmid được pha loãng đến cùng nồng độ và được trộn theo tỷ lệ thích hợp;

- hỗn hợp lysat (hiệu chuẩn chất chuẩn đáp ứng với mẫu);

- phân giải (đệm CTAB + proteinase K) của các mẫu mô cơ (mẫu thịt chuẩn nguyên chất, ví dụ 1 g);

- sau khi phân giải, lysat được trộn theo tỷ lệ thích hợp (phần thể tích), chiết ADN (quy trình chiết nguyên liệu hiệu chuẩn và mẫu là giống nhau); bằng cách mô phỏng thành phần của mẫu đã thử nghiệm loại bỏ các ảnh hưởng của PCR đặc hiệu của loài;

...

...

...

- hỗn hợp thịt: thịt được cân và trộn theo các tỷ lệ thích hợp (phần khối lượng) trước khi phân giải và chiết ADN; đo nồng độ của ADN thu được (ng/μl);

- hỗn hợp hiệu chuẩn được pha loãng thành từng dãy trong nước (ít nhất bốn chuẩn với dãy dung dịch pha loãng ADN và nồng độ ADN xác định được tính bằng ng/μl, ví dụ: bắt đầu với 20 ng/μl và phân tích với tỷ lệ 1:4, 1:16, 1:64, 1: 256, 1:1 024 và 1:4 096) và được sử dụng để hiệu chuẩn cả hai hệ thống PCR, phân tích PCR đặc hiệu của loài và phân tích PCR chuẩn;

- mẫu: ADN của nguyên liệu mẫu được chiết theo quy trình tương tự như hỗn hợp hiệu chuẩn, nồng độ ADN (tính bằng ng/μl) được xác định (bằng Nanodrop, PicoGreen, v.v.); mẫu được phân tích bằng cả hai hệ thống PCR, phân tích PCR đặc hiệu của loài và phân tích PCR chuẩn;

- dựng đồ thị các giá trị Cq thu được trong hệ thống PCR đặc hiệu của loài và hệ thống PCR chuẩn dựa trên logarit của nồng độ ADN; các đường chuẩn đối với phép phân tích PCR đặc hiệu của loài và phép phân tích PCR chuẩn thu được bằng phương pháp hồi quy tuyến tính;

- sử dụng các giá trị Cq thu được trong phân tích PCR đối với các loài cụ thể và phân tích PCR chuẩn cho một mẫu để tính nồng độ ADN đặc hiệu của loài (ng/μl) và nồng độ ADN tổng số (ng/μl); tính phần trăm của động vật cần phân tích.

Công thức:

Trong đó:

C_DS  là nồng độ của ADN đặc hiệu, tính bằng nanogam trên microlit (ng/μl);

...

...

...

Cq_spec  là giá trị Cq nhận được sử dụng đặc hiệu của loài;

Cq_ref  là giá trị Cq nhận được sử dụng phép phân tích;

d_spec  là điểm giao nhau các đường chuẩn của phép phân tích PCR đặc hiệu của loài;

d_ref  là điểm giao nhau các đường chuẩn của phép phân tích real-time PCR chuẩn;

S_spec  là độ dốc các đường chuẩn của phân tích phép PCR đặc hiệu của loài;

S_ref  là độ dốc các đường chuẩn của phân tích real-time PCR chuẩn;

C  là phần trăm hàm lượng của các loài đặc hiệu.

Để biết thêm thông tin, xem Tài liệu tham khảo [15], [16], [19] và [20].

B.3.2.3  Ví dụ: Định lượng tương đối % ADN được khuếch đại (ng/μl) sử dụng phương pháp chuẩn hóa

...

...

...

Cách tiến hành:

- chiết ADN từ các mẫu mô cơ của các loài (mẫu đối chứng) và đo nồng độ ADN (tính bằng ng/μl) (bằng máy Nanodrop, PicoGreen, v.v...);

- chuẩn bị các hỗn hợp ADN (ng/μl) với khối lượng ADN tương đối khác nhau để sử dụng làm các chuẩn hiệu chuẩn;

- chạy PCR đa mồi với các ADN hiệu chuẩn (ít nhất bốn chuẩn, mỗi chuẩn của các loài có nồng độ nằm trong khoảng từ 20 ng/μl đến 0,02 ng/μl) và ADN mẫu;

- các giá trị Cq của các chuẩn dùng cho đường chuẩn, một giá trị dùng cho mỗi loài động vật có trong hỗn hợp ADN hiệu chuẩn;

- các giá trị Cq của mẫu được sử dụng để tính nồng độ ADN đặc hiệu của loài (ng/μl); tổng ADN của tất cả các loài được xác định bằng cách tính tổng lượng thu được đối với mỗi loài đích bằng phân tích PCR đa mồi;

- tính phần trăm của động vật cần phân tích.

Công thức (cho từng loài đích PCR):

...

...

...

P  là tỷ số giữa ADN của các loài đích và tổng ADN của tất cả các loài, tính bằng phần trăm (%);

M_s  là khối lượng ADN của các loài đích, tính bằng nanogam trên microlit (ng/μl);

M_t  là tổng số ADN của tất cả các loài, tính bằng nanogam trên microlit (ng/μl).

Ví dụ về việc chuẩn bị các chuẩn hiệu chuẩn được nêu trong Bảng B.3.

Bảng B.3 - Chuẩn bị các chuẩn hiệu chuẩn

Số

Bò

Lợn

...

...

...

Cừu

Tổng số các loài động vật

ADN tinh trùng cá trích

Mẫu 1

Thể tích (μl)

1

32

3,2

32

...

...

...

31,8

Nồng độ của dung dịch gốc (ng/μl)

2

2

2

20

712,4

20

...

...

...

ng ADN

2

64

6,4

640

7,124

638

Nồng độ cuối cùng (ng/μl)

...

...

...

0,64

0,064

6,4

6,38

% các loài động vật

0,28

8,98

...

...

...

89,84

Mẫu 2

Thể tích (μl)

32

10

1

10

...

...

...

47

Nồng độ của dung dịch gốc (ng/μl)

20

2

2

20

862

20

...

...

...

ng ADN

640

20

2

200

8,62

940

Nồng độ cuối cùng (ng/μl)

...

...

...

0,2

0,02

2

9,4

% các loài động vật

74,25

2,32

...

...

...

23,2

Mẫu 3

Thể tích (μl)

10

3,2

32

3,2

...

...

...

51,6

Nồng độ của dung dịch gốc (ng/μl)

20

2

20

20

910,4

20

...

...

...

ng ADN

200

6,4

640

64

910,4

1032

Nồng độ cuối cùng (ng/μl)

...

...

...

0,064

6,4

0,64

10,32

% các loài động vật

21,97

0,7

...

...

...

7,03

Mẫu 4

Thể tích (μl)

32

1

10

10

...

...

...

47

Nồng độ của dung dịch gốc (ng/μl)

2

2

20

2

286

20

...

...

...

ng ADN

64

2

200

20

2,86

940

Nồng độ cuối cùng (ng/μl)

...

...

...

0,02

2

0,2

9,4

% các loài động vật

22,38

0,70

...

...

...

6,99

Mẫu 5

Thể tích (μl)

10

32

3,2

3,2

...

...

...

51,6

Nồng độ của dung dịch gốc (ng/μl)

2

20

20

2

730,4

20

...

...

...

ng ADN

20

640

64

6,4

7,034

1 032

Nồng độ cuối cùng (ng/μl)

...

...

...

6,4

0,64

0,064

10,32

% các loài động vật

2,74

87,62

...

...

...

0,88

Mẫu 6

Thể tích (μl)

3,2

10

10

1

...

...

...

75,8

Nồng độ của dung dịch gốc (ng/μl)

2

20

2

2

228,4

20

...

...

...

ng ADN

6,4

200

20

2

2,284

1 516

Nồng độ cuối cùng (ng/μl)

...

...

...

2

0,2

0,02

15,16

% các loài động vật

2,8

87,57

...

...

...

0,88

Để biết thêm thông tin, xem Tài liệu tham khảo [13], [14] và [21].

B.4  Ví dụ về phép tính số bản sao của gen đơn lẻ

Có thể tính tỷ lệ khối lượng cùng với tỷ lệ số bản sao của các gen trong loài đích và trong nền mẫu, khi một gen nội sinh đơn lẻ hoặc gen chuyển đổi đơn lẻ được quy định và trình tự nucleotid của các gen này là phổ biến giữa các loài động vật dự kiến có trong nền mẫu.

CHÚ THÍCH: Gen chuyển đổi đơn lẻ là gen có số lượng bản sao trong bộ gen đã biết và nhất quán về số lượng giữa các loài động vật.

Ví dụ về công thức tính:

P = M_s x C_st / C_sc

...

...

...

P  là tỷ lệ khối lượng của các loài đích, tính bằng phần trăm (%);

M_s  là khối lượng của toàn bộ mẫu để phân tích;

C_st  là số bản sao của gen nội sinh đơn lẻ hoặc gen chuyển đổi đơn lẻ đặc hiệu của động vật đích;

C_sc  là số bản sao của gen nội sinh đơn lẻ hoặc gen chuyển đổi đơn lẻ phổ biến trong nền mẫu.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] UNTERGASSER A., CUTCUTACHE I., KORESSAAR T., YE J., FAIRCLOTH B.C., REMM M., ROZEN S.G., Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 2012, 40(15), e115

[2] ALTSCHUL S.F., GISH W., MILLER W., MYERS E.W., LIPMAN D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 1990, 215(3), pp. 403-410

[3] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung

...

...

...

[5] THOMPSON M., ELLISON S.L.R., WOOD R. Harmonized Guidelines for Single-laboratory Validation of Methods of Analysis. Pure Appl. Chem. 2002, 74(5), pp. 835-855

[6] European Network of GMO Laboratories (ENGL). Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories. European Commission, Joint Research Centre, institute for Health and Consumer Protection, Ispra, 2015

[7] Codex Alimentarius Commission. CAC/GL 74-2010, Guidelines on performance criteria and validation of methods for detection, identification and quantification of specific DNA sequences and specific proteins in foods, 2010

[8] Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL). Guidelines for the validation of qualitative real-time PCR methods by means of a collaborative study. Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL), Bundesallee 50, 38116 Braunschweig, 2016

[9] TCVN ISO/IEC 17025 (ISO/IEC 17025), Yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn

[10] BUSTIN et al. The Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (MIQE) guidelines for PCR. Clin. Chem. 2009, 55(4), pp. 611-622

[11] CORBISIER P., BARBANTEA., BERBEN G., BROOTHAERTS W., DE LOOSE M., EMONS H., GEORGIEVA TZ, LIEVENS A., MAZZARA M., PAPAZOVA N., PERRI E., SOWA S., STEBIH D., TERZI V., TRAPMANN S. Recommendation for the unit of measurement and the measuring system to report traceable and comparable results expressing GM content in accordance with EU legislation. EUR28536 EN. doi 10.2760/177516

[12] TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Tách chiết axit nucleic

[13] BVL L 08.00-61 (2016), Untersuchung von Lebensmitteln - Nachweis der Tierarten Rind Schwein, Pute und Huhn in Wurstwaren durch Multiplex-real-time PCR

...

...

...

[15] DRUML et al. Development and validation of a TaqMan real-time PCR assay for the identification and quantification of roe deer (Capreolus capreolus) in food to detect food adulteration. Food Chemistry. 2015, 178, pp. 319-326

[16] DRUML et al. A novel reference real-time PCR assay for the relative quantification of (game) meat species in raw and heat-processed food. Food Control. 2016, 70, pp. 392-400

[17] EUGSTER et al. Quantification of beef, pork, chicken and turkey proportions in sausages: use of matrix-adapted standards and comparison of single versus multiplex PCR in an interlaboratory trial. Eur Food Res Technol. 2009, 230 pp. 55-61

[18] IWOBI et al. A multiplex real-time PCR method for the quantification of beef and pork fractions in minced meat. Food Chem. 2015, 169, pp. 305-313

[19] KALTENBRUNNER et al. Development and validation of a fallow deer (Dama dama)-specific TaqMan real-time PCR assay for the detection of food adulteration. Food Chemistry. 2018, 243, pp. 82-90, doi: 10.1016/j.foodchem.2017.09.087

[20] KALTENBRUNNER et al. Red deer (Cervus elaphus)-specific real-time PCR assay for the detection of food adulteration. Food Control. 2018, doi: 10.1016/j.foodcont.2018.01.021

[21] KÖPPEL et al. Quantification of Meat Proportions by Measuring DNA Contents in Raw and Boiled Sausages Using Matrix-Adapted Calibrators and Multiplex Real-Time PCR. J AOAC. 2012, 95, pp. 494-499

[22] LAUBE et al. Quantitative determination of commercially relevant species in foods by real-time PCR. Int J Food Sci Technol. 2007, 42, pp. 336-341

[23] AOAC International. Appendix D: Guidelines for Collaborative Study Procedures To Validate Characteristics of a Method of Analysis. AOAC OFFICIAL METHODS OF ANALYSIS, 2002

...

...

...

[25] TCVN ISO 17034 (ISO 17034), Yêu cầu chung về năng lực của nhà sản xuất mẫu đối chứng

[26] TCVN 7605 (ISO 21569), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định tính axit nucleic