Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11940:2017 về Thực phẩm bổ sung và nguyên liệu thực vật - Xác định axit aristolochic-1

• Số hiệu: TCVN11940:2017
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2017

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11940:2017

THỰC PHẨM BỔ SUNG VÀ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH AXIT ARISTOLOCHIC-1 - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG VỚI DETECTOR UV (LC-UV) VÀ KHẲNG ĐỊNH BẰNG SẮC KÝ LỎNG PHỔ KHỐI LƯỢNG

Foodstuffs dietary supplements and raw botanical materials - Determination of aristolochic acid I - Liquid chromatographic method with UV detection (LC-UV) and confirmation by LC/MS

Lời nói đầu

TCVN 11940:2017 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2007.05 Aristolochic acid I in botanicals and dietary supplements potentially contaminated with aristolochic acid I - LC-UV with confirmation by LC/MS;

TCVN 11940:2017 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F6 Dinh dưỡng và thức ăn kiêng biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

...

...

...

Foodstuffs dietary supplements and raw botanical materials - Determination of aristolochic acid I - Liquid chromatographic method with UV detection (LC-UV) and confirmation by LC/MS

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định axit aristolochic-1 trong thực phẩm bổ sung và nguyên liệu thực vật bằng sắc ký lỏng với detector UV (LC-UV) và khẳng định bằng sắc kí lỏng-phổ khối lượng.

2  Nguyên tắc

Axit aristolochic-1 được chiết bằng axetonitril ra khỏi các nền mẫu khác nhau. Lượng axit aristolochic-1 được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng (LC) sử dụng detector độ hấp thụ UV và khẳng định bằng sắc kí lỏng-phổ khối lượng (LC/MS).

3  Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước đã khử ion hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Axetonitril, loại dùng cho HPLC.

CẢNH BÁO: Axetonitril là dung môi dễ cháy; cần tránh xa nguồn nhiệt hoặc ngọn lửa và có thông gió phù hợp.

...

...

...

CẢNH BÁO: Axit trifluoroacetic là chất ăn mòn, chất kích thích dạng lỏng, có thể gây bỏng nặng.

3.3  Etanol, 100 % (thể tích), loại dùng cho đo phổ/HPLC.

3.4  Metanol, loại dùng cho HPLC.

3.5  Axit formic, 88 %.

3.6  Amoni axetat, loại dùng cho HPLC.

CHÚ THÍCH  Các thuốc thử chất lượng tương đương có thể được sử dụng.

3.7  Chất chuẩn axit aristolochic-1, cũng được gọi là axit aristolochic A, có độ tinh khiết ≥ 94 %.

CẢNH BÁO: Axit aristolochic-1 là chất độc, chất kích thích dạng rắn.

3.8  Thuốc thử dùng cho sắc ký

...

...

...

3.8.2  Pha động B đối với HPLC-UV, 0,1 % dung dịch axit trifluoroaxetic (thể tích) trong axetonitril.

3.8.3  Dung môi chiết, hỗn hợp của axetonitril - nước (thể tích 50 + 50).

3.8.4  Pha động A cho sắc ký lỏng khối phổ đầu dò 3 tứ cực, hỗn hợp của metanol 5 %, axit formic 0,1 % và amoni axetat 10 mM trong nước.

3.8.5  Pha động B cho sắc ký lỏng khối phổ đầu dò 3 tứ cực, hỗn hợp của axetonitril-metanol (1 + 1) chứa axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 10 mM trong nước.

3.8.6  Pha động A cho sắc ký lỏng khối phổ bẫy ion, hỗn hợp của axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 0,1 % (khối lượng/thể tích) trong nước đã khử ion.

3.8.7  Pha động B cho sắc ký lỏng khối phổ bẫy ion, hỗn hợp của axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 0,1 % (khối lượng/thể tích) trong metanol.

3.9  Chuẩn bị dung dịch chuẩn

3.9.1  Dung dịch chuẩn gốc, khoảng 200 µg/ml

Dùng cân (4.1) cân khoảng 0,002 g axit arstolochic-1 (3.7), chính xác đến 0,00001 g và chuyển vào bình định mức dung tích 10 ml (4.12). Hòa tan axit aristolochic-1 (3.7) và pha loãng bằng axetonitril (3.1) đến vạch. Nồng độ dung dịch chuẩn gốc, C₀, biểu thị bằng microgam trên mililit (µg/ml), tính bằng Công thức (1):

...

...

...

Trong đó:

m là khối lượng của axit aristolochic-1, tính bằng gam (g);

v₀ là dung tích bình định mức, tính bằng mililit (ở đây v₀ = 10 ml);

P là độ tinh khiết của axit aristolochic-1;

10^6 là hệ số chuyển đổi từ gam sang microgam.

Để khẳng định lại nồng độ chuẩn, tiêm dung dịch chuẩn gốc đã chuẩn bị vào hệ thống HPLC (4.8) để thu được phần tinh khiết, sau đó lấy 1 ml pha loãng bằng etanol (3.3) đến 5 ml và đọc độ hấp thụ trên máy quang phổ (4.7) ở bước sóng 390 nm. Nồng độ đúng của chất chuẩn, biểu thị bằng microgam trên mililit (µg/ml), được tính bằng Công thức (2):

                                                                         (2)

Trong đó:

A₁ là độ hấp thụ đo được ở bước sóng 390 nm;

...

...

...

341,29 là khối lượng mol của axit aristolochic-1, tính bằng gam trên mol (g/mol);

f là độ tinh khiết của dung dịch chuẩn gốc sau khi qua hệ thống HPLC;

5 là độ pha loãng (từ 1 ml thành 5 ml).

Dung dịch ổn định trong vòng 30 ngày khi được bảo quản tránh ánh sáng và trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C.

LƯU Ý: Nồng độ được khẳng định lại trước khi pha các chuẩn làm việc.

3.9.2  Dung dịch chuẩn làm việc

Pha loãng các dung dịch chuẩn ở 6 mức nồng độ từ khoảng 0,040 µg/ml đến 0,64 µg/ml trong hỗn hợp axetonitril - nước (50 + 50) theo Bảng 1. Các dung dịch này bền trong 14 ngày khi bảo quản tránh ánh sáng và trong tủ lạnh duy trì ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C.

Bảng 1 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc

Chuẩn

...

...

...

Thể tích dung dịch gốc sử dụng
ml

Thể tích cuối cùng
ml

Nồng độ
µg/ml

Dung dịch chuẩn gốc làm việc

200

0,800

10

16,0

1

...

...

...

0,0625

25

0,0400

2

16,0

0,190

25

0,122

3

...

...

...

0,250

25

0,160

4

16,0

0,500

25

0,320

5

...

...

...

0,750

25

0,480

6

16,0

1,00

25

0,640

3.9.3  Đánh giá sự phù hợp của hệ thống

...

...

...

Các điều kiện HPLC có thể cần được thay đổi để có được hệ thống phù hợp mong muốn.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,00001 g.

4.2  Máy nghiền loại nhỏ, loại dùng để nghiền cafe hoặc gia vị.

4.3  Máy lắc.

4.4  Cột sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

4.4.1  Với đầu dò UV, ví dụ Zorbax SB-C18, 5 µm, kích thước 25 cm x đường kính trong 3,0 mm.

4.4.2  Với đầu dò sắc kí lỏng khối phổ bẫy ion, ví dụ Zorbax SB-C18, 5 µm, kích thước 15 cm x đường kính trong 3,0 mm.

...

...

...

4.5  Sàng, cỡ lỗ 400 µm.

4.6  Hệ thống sắc kí lỏng khối phổ, bẫy ion hoặc ba tứ cực

4.7  Máy quang phổ tử ngoại-khả kiến (UV-VIS), đo độ hấp thụ ở bước sóng 390 nm.

4.8  Hệ thống HPLC, có trang bị detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS).

4.9  Bộ lọc xyranh, 13 mm với màng lọc PTFE cỡ lỗ 0,45 µm.

4.10  Hệ thống dữ liệu cho HPLC.

4.11  Hệ thống dữ liệu cho sắc ký lỏng phổ khối lượng.

4.12  Bình định mức, dung tích 10 ml.

CHÚ THÍCH  Các thiết bị tương đương có thể được sử dụng. Tất cả các dụng cụ thủy tinh phải phù hợp loại A^[1].

...

...

...

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể nào liên quan đến sản phẩm cần phân tích thì các bên tự thảo thuận về vấn đề này.

6  Cách tiến hành

Cho vật liệu nghiền qua sàng cỡ lỗ 400 µm (4.5), nếu cần và trộn kỹ. Cân khoảng 2 g mẫu thử cho vào bình có nắp đậy. Thêm 100 ml dung môi chiết (3.1). Lắc tối thiểu 30 min trên máy lắc (4.3) đặt ở chế độ lắc cố định. Pha loãng dung dịch thử với dung môi chiết cho thích hợp với đường chuẩn, nếu cần. Dung dịch thử có thể được bảo quản lạnh không quá 2 ngày. Lọc dung dịch thử bằng bộ lọc xyranh có màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm (4.9) rồi tiến hành phân tích HPLC và định lượng. Sử dụng các thông số nêu trong Bảng 2. Tiêm từng dung dịch chuẩn làm việc (3.9.2), một bộ ở thời điểm bắt đầu và một bộ ở thời điểm kết thúc chạy. Tiêm dung dịch chuẩn sau mỗi 4 dung dịch thử, bắt đầu ở mức thấp nhất, tiếp đến 4 dung dịch thử tiếp theo, sau đó là dung dịch chuẩn cao nhất v.v... Sử dụng tất cả các giá trị đo được của dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn.

Bảng 2 - Thông số HPLC-UV

Cột HPLC

Zorbax SB-C18, 5 µm, đường kính 3,0 mm x 25 cm, Agilent

Pha động A

0,1% (thể tích) axit trifluoroacetic - nước

...

...

...

0,1% (thể tích) axit trifluoroacetic - axetonitril

Chương trình tiêm

Thời gian, min

% A

% B

Đường gradient

0

80

20

...

...

...

25

30

70

1^b

30

0

100

1

31

...

...

...

20

1

40

80

20

Không áp dụng

Detector

detector hấp thụ UV (bước sóng 390 nm)

...

...

...

40

Tốc độ dòng

Khoảng 0.5 ml/min; tốc độ dòng phải điều chỉnh được sao cho có thể thu được thời gian lưu mong muốn

Thể tích tiêm, µl

25

Thời gian tiêm, min

...

...

...

^b đường gradient cho thấy sự chuyển đổi tuyến tính.

7  Khẳng định bằng sắc kí lỏng khối phổ

Khi xác định bằng LC-UV, axit aristolochic-1 xác định được ở nồng độ > 2 µg/g, được khẳng định bằng LC/MS/MS. Phổ của chất chuẩn được sử dụng để khẳng định sự có mặt của axit aristolochic-1 so với phổ của mẫu ở thời gian lưu tương tự. Mỗi diện tích pic được phát hiện của chuẩn hoặc mẫu với các ion con được chia bằng diện tích pic của một ion con với diện tích pic lớn nhất. Nếu nhiều mẫu và chuẩn được tiêm vào thì tính trung bình tất cả các tỷ lệ tương ứng. Để khẳng định, tỷ lệ mẫu nên bằng ± 10 % tỷ lệ chuẩn trung bình (chênh lệch số học). Ví dụ, tỷ lệ trung bình của chuẩn là 50 %, thì tỷ lệ mẫu là từ 40 % đến 60 %.

Các điều kiện sắc kí và ion hóa được kiểm soát đối với ba tứ cực nêu trong Bảng 3 và đối với bẫy ion nêu trong Bảng 4.

Bảng 3 - Các điều kiện sắc ký đối với sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực

Cột HPLC

Zorbax SB-C18, 5 µm, đường kính 2,1 mm x 50 mm, Agilent

Pha động A

...

...

...

Pha động B

Axetonitril-metanol (1+1) chứa axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 10 mM trong nước đã khử ion

Chương trình tiêm

Thời gian, min

A %

B %

Gradient

0

70

...

...

...

Không áp dụng

13

30

70

1^b

15

0

100

1

...

...

...

70

30

1

20

70

30

Không áp dụng

Nhiệt độ cột, °C

40

...

...

...

Tốc độ dòng, ml/min

0.2

Thể tích tiêm, µl

25

Đưa mẫu

Phun điện tử dương (ES+)

...

...

...

Dải khối lượng

Quét các ion con đặc trưng,

dwell = 0,25 s

Nhiệt độ nguồn, °C

150

Nhiệt độ hóa hơi, °C

350

...

...

...

Tốc độ khí hóa hơi, l/h

600

Lưu lượng khí cone, l/h

60

Các ion được kiểm soát trong phép khẳng định khối phổ LC/MS

Hợp chất

Ion mẹ (m/z)

...

...

...

Cone, V

Năng lượng bắn phá, eV

[axit aristolochic-1 + NH₄]^+

359,1

265, 281, 296

18

40, 40, 30

Bảng 4 - Các điều kiện sắc ký đối với sắc ký lỏng khối phổ bẫy ion

Cột HPLC

...

...

...

Pha động A

axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 0,1 % (khối lượng/thể tích) trong nước đã khử ion

Pha động B

axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 0,1 % (khối lượng/thể tích) trong metanol

Chương trình tiêm

Thời gian, min

% A

% B

gradient

...

...

...

80

20

Không áp dụng

20

0

100

1^b

21

80

...

...

...

1

25

80

20

Không áp dụng

Nhiệt độ cột, °C

40

...

...

...

0.5

Thể tích tiêm, µL

30

Đưa mẫu

Bẫy ion

...

...

...

Chế độ

Scan dải nồng độ

m/z 80 to 370

Dòng phóng điện, µA

5

...

...

...

Nhiệt độ mao quản đã gia nhiệt, °C

150

Nhiệt độ hóa hơi, °C

450

Cài đặt khí bay hơi

...

...

...

Cài đặt khí bổ trợ

20

Các ion được kiểm soát trong phép khẳng định khối phổ bẫy ion

Hợp chất

Ion mẹ (m/z)

...

...

...

Độ rộng phân tách (m/z)

Năng lượng va chạm tương đối, %

Axit aristolochic-1

359

298

2

30

Axit aristolochic-1

298,0 (từ ion con ở trên)

...

...

...

2

35

8  Tính kết quả

Đường chuẩn thu được từ hồi quy tuyến tính của tất cả diện tích pic và nồng độ của chuẩn làm việc. Hệ số tương đối (r) phải ≥ 0,99500. Xác định nồng độ axit aristolochic-1 của mẫu đã tiêm từ phân tích hồi quy.

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử, X, được tính bằng microgam trên gam (µg/g), theo Công thức (3):

                                                                                                   (3)

Trong đó:

C là nồng độ chất phân tích từ đường hồi quy, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);

V là thể tích dung môi chiết, tính bằng mililit (ml);

...

...

...

W là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau:

- mọi thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu;

- phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

- phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

...

...

...

(tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với axit aristolochic-1

Bảng A.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với axit aristolochic-1

Tên mẫu

Trung bình, µg/g

S_r^a

RSD_r^b, %

S_r^c

RSD_r^d, %

...

...

...

Chỉ số HorRat

Số PTN sử dụng

Aristolochia manschuriensis, thân

2610

44,9

1,72

222

8,51

2

...

...

...

8

Clematis armandii, thân

6,94

0,654

9,42

0,850

12,3

1

1,0

...

...

...

Viên nén bổ sung liều cao, rễ Aristolochia spp. 20 µg/g

12,8

2,08

16,3

2,53

19,8

0

1,8

10

...

...

...

1290

23,8

1,85

69,7

5,42

0

1,0

10

Clematis armandii, thân, bổ sung liều thấp Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ

...

...

...

0,754

7,31

0,875

8,48

0

0,8

10

Stephania tetrandra, rễ, bổ sung liều thấp Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ

10,0

...

...

...

11,8

1,82

18,2

0

1,6

10

Akebia trifoliata, thân, bổ sung ít Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ

7,83

0,518

...

...

...

0,807

10,3

0

0,9

10

Viên nén bổ sung liều thấp Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ

6,58

0,875

13,3

...

...

...

13,3

2

1,1

8

Stephania tetrandra, rễ, bổ sung liều cao Aristolochia spp. 20 µg/g, rễ

16,7

0,844

5,04

1,16

...

...

...

3

0,7

7

Akebia trifoliata, thân, bổ sung liều cao Aristolochia spp. 20 µg/g, rễ

15,0

0,790

5,25

2,05

13,7

...

...

...

1,3

10

Clematis armandii, thân, bổ sung liều cao Aristolochia spp. 20 µg/g, rễ

20,5

0,849

4,14

1,68

8,18

0

...

...

...

10

Akebia trifoliata, thân

< 2,00

NA^e

NA

NA

NA

1

NA

...

...

...

Stephania tetrandra, rễ

< 2,00

NA

NA

NA

NA

0

NA

10

...

...

...

^b RSD_r là độ lệch chuẩn tương đối lặp lại.

^c S_R là độ lệch chuẩn tái lập.

^d RSD_R độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

^e NA là không áp dụng.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức.