TCVN-8710-30-2026-Benh-thuy-san-Quy-trinh-chan-doan-Phan-30

• Số hiệu: TCVN8710-30:2026
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2026

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-30:2026

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN -

PHẦN 30: BỆNH NHIỄM TRÙNG XUẤT HUYẾT DO VI RÚT VIRAL HAEMORRHAGIC SEPTICAEMIA Ở CÁ

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure -

Part 30: Viral haemorrhagic septicaemia disease in fish

Lời nói đầu

TCVN 8710-30:2026 do Trung tâm Chẩn đoán và Xét nghiệm thú y Trung ương I, Cục Chăn nuôi và Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:

...

...

...

- TCVN 8710-2:2019, Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển;

- TCVN 8710-3:2019, Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm;

- TCVN 8710-4:2019, Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm;

- TCVN 8710-5:2023, Phần 5: Hội chứng taura ở tôm;

- TCVN 8710-6:2019, Phần 6: Bệnh do Koi herpes vi rút ở cá chép;

- TCVN 8710-7:2019, Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép;

- TCVN 8710-8:2023, Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

- TCVN 8710-9:2012, Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm;

- TCVN 8710-10:2015, Phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

...

...

...

- TCVN 8710-12:2019, Phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm;

- TCVN 8710-13:2015, Phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm;

- TCVN 8710-14:2015, Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;

- TCVN 8710-15:2015, Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila ở cá;

- TCVN 8710-16:2016, Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

- TCVN 8710-17:2016, Phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

- TCVN 8710-19:2019, Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

- TCVN 8710-20:2019, Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

- TCVN 8710-21:2019, Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá;

...

...

...

- TCVN 8710-23:2022, Phần 23: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do IHNV ở cá hồi;

- TCVN 8710-24:2022, Phần 24: Bệnh do sán lá Dollfustrema sp. ở cá da trơn;

- TCVN 8710-25:2022, Phần 25: Bệnh do ký sinh trùng Bonamia ostreae và Bonamia exitiosa ở hàu;

- TCVN 8710-26:2023, Phần 26: Bệnh hoại tử cơ quan tạo màu do EHNV ở cá;

- TCVN 8710-27:2023, Phần 27: Bệnh do vi rút Tilapia lake (TiLV) ở cá rô phi:

- TCVN 8710-28:2023, Phần 28: Bệnh do RSIV ở cá biển;

- TCVN 8710-29:2026, Phần 29: Bệnh do vi rút Herpes ở bào ngư;

- TCVN 8710-30:2026, Phần 30: Bệnh nhiễm trùng xuất huyết do vi rút Viral haemorrhagic septicaemia ở cá;

- TCVN 8710-31:2026, phần 31: Bệnh tuyến tụy do vi rút Salmonid alphavirus ở cá hồi;

...

...

...

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN -

PHẦN 30: BỆNH NHIỄM TRÙNG XUẤT HUYẾT DO VI RÚT VIRAL HAEMORRHAGIC SEPTICAEMIA Ở CÁ

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure -

Part 30: Viral haemorrhagic septicaemia disease in fish

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh nhiễm trùng xuất huyết do vi rút Viral haemorrhagic septicaemia (VHS) ở cá.

2  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

...

...

...

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1.1

Bệnh nhiễm trùng xuất huyết do vi rút Viral haemorrhagic septicaemia (VHS) trên cá (Viral haemorrhagic septicaemia disease in fish)

Bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút VHS (Viral haemorrhagic septicaemia) gây ra, ảnh hưởng đến nhiều loài cá nước ngọt và nước mặn, đặc biệt là các loài thuộc họ Cá hồi (Salmonidae) và họ Cá vược (Moronidae).

2.1.2

Vi rút gây bệnh nhiễm trùng xuất huyết trên cá (Viral haemorrhagic septicaemia)

Vi rút Viral haemorrhagic septicaemia (VHS) thuộc chi Novirhabdovirus, họ Rhabdoviridae, Vi rút VHS hình que một đầu tròn (hình viên đạn), có đường kính khoảng 70 nm và dài 180 nm, chứa một bộ gen ARN chuỗi đơn, với khoảng 11.000 nucleotide và có vỏ bọc glycoprotein đóng vai trò là kháng nguyên bề mặt trung hòa. Các bộ gen mã hóa sáu protein: 1 nucleoprotein N; 1 phosphoprotein P (trước đây được gọi là M1); 1 matrix protein M (trước đây được gọi là M2); 1 glycoprotein G; 1 protein phi virion NV và 1 polymerase L (Walker và cs, 2000). Trình tự nucleotide của gen G đã được sử dụng để phân loại các chủng VHSV thành 4 kiều gen chính (I, II, III và IV) và 9 phân nhóm (la-le và IVa-IVd) với sự phân bố địa lý gần như khác biệt [2],[3].

2.2  Các từ viết tắt

- ADN (Deoxyribonucleic acid): Axit deoxyribonucleic;

...

...

...

- Ct (Cycle threshold): Chu kỳ ngưỡng;

- FAM: 6-Carboxyfluorescein (một chất phát huỳnh quang dùng trong đoạn dò TaqMan);

- MAP (Magnetic Affinity Particles): Các hạt từ sử dụng trong bộ kít InviMAG® Virus DNA/RNA để gắn chọn lọc acid nucleic trong quá trình tách chiết tự động.

- PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phosphat;

- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi Polymerase;

- Real-time RT-PCR (Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực;

- TAE (Tris-acetate-EDTA): Tris-axetat-axit etylendiamintetraaxetic;

- TBE (Tris-borate-EDTA): Tris-borat-axit etylendiamintetraaxetic;

- TE (Tris-EDTA); Tris-axit etylendiamintetraaxetic;

...

...

...

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Mồi và đoạn dò (primers/probe) real-time RT-PCR, gồm mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò

3.2  Mồi RT-PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.3  Kít nhân gen RT- PCR

3.4  Kít nhân gen real-time RT- PCR

3.5  Kít tách chiết ARN

3.6  Thạch agarose

3.7  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE (Cách chuẩn bị xem A.1 của Phụ lục A)

...

...

...

3.9  Chất đệm tải mẫu (loading dye 6X)

3.10  Thang chuẩn ADN (ladder/Marker)

3.11 Dung dịch đệm TE

3.12  Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.13  Ethanol, 70 %, 90 % đến ethanol tuyệt đối

3.14  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (Cách chuẩn bị xem A.2 của Phụ lục A).

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị

...

...

...

4.1.2  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ âm 20 °C tới âm 80 °C

4.1.3  Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2

4.1.4  Máy nhận gen PCR

4.1.5   Máy real-time PCR

4.1.6  Máy tách chiết ARN/ADN

4.1.7  Máy ly tâm, có thể hoạt động với gia tốc 2 000 g đến 4 000 g và gia tốc 12 000 g

4.1.8  Máy nghiền mẫu

4.1.9  Máy ủ nhiệt, từ 0°C đến 100 °C

4.1.10  Máy lắc trộn Vortex

...

...

...

4.1.12 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

4.1.13 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg

4.1.14  Cối, chày nghiền mẫu.

4.2  Dụng cụ

4.2.1  Pipet đơn kênh các loại

4.2.2  Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml

4.2.3  Dụng cụ chứa mẫu, kín, có nắp đậy, không rò rỉ, vô trùng

4.2.4  Panh, kéo, vô trùng

4.2.5 Khay đựng đá lạnh

...

...

...

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Đặc điểm dịch tễ

Các loài mẫn cảm với VHS là cá hồi (Oncorhynchus spp.), cá hồi nâu (Salmo trutta), cá hồi xám Châu Âu (Thymallus thymallus), cá hồi trắng (Coregonus spp.), cá chó (Esox lucius), cá bơn Đại Tây Dương (Scophthalmus maximus), cá tuyết Thái Bình Dương (Gadus macrocephalus), cá trích Thái Bình Dương (Clupea pallasi), cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua), cá vược Châu Âu (Dicentrarchus labrax), cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus), cá tuyết đá (Rhinonemus cimbrius), cá trích cơm (Sprattus sprattus), cá trích Đại Tây Dương (Clupea harengus) và một số loài cá khác.

Cá hồi vân cỡ nhỏ (0,3 g đến 3 g) dễ bị nhiễm nhất với vi rút VHS có kiểu gen lạ, tỷ lệ chết gần 100%. Đối với kiểu gen VHSV Ib, II và III, các loài sống hoang dã như cá trích Đại Tây Dương và cá trích châu Âu có khả năng là vật chủ tự nhiên, không có dấu hiệu lâm sàng của bệnh và có nồng độ vi rút thấp. Kiểu gen IVa cá trích Thái Bình Dương là vật chủ tự nhiên, kiểu gen IVa gây bệnh cho cá hồi, cá bơn và cá bơn ô liu (turbot và bastard halibut). Kiểu gen VHSV III gây ra bệnh ở cá bơn (turbot) và cá mú nuôi.

Vi rút VHS có thể gây bệnh và gây chết ở tất cả các giai đoạn sống của cá mẫn cảm. Nhiệt độ nước là yếu tố môi trường quan trọng, bệnh xuất hiện khi nhiệt độ nước từ 4 °C đến 14 °C. Tỷ lệ chết cao nhất ở nhiệt độ nước khoáng từ 9 °C đến 12 °C

Bệnh do vi rút VHS xuất hiện ở tất các mùa nhưng thường xuất hiện mùa xuân khi nhiệt độ nước thích hợp.

Bệnh chủ yếu lây truyền theo chiều ngang qua nước, với sự bài tiết vi rút qua nước tiểu và da cá. Ngoài ra, bệnh lây truyền qua miệng động vật săn mồi và vật chủ trung gian bị nhiễm bệnh như các loài chim ăn cá mang vi rút trên mò và chân hoặc thông qua việc nôn ra cá bị nhiễm bệnh. Hiện chưa có bằng chứng nào về sự lây truyền của vi rút VHS theo chiều dọc từ bố mẹ sang con.

Một số cá thể sống sót sau dịch bệnh sẽ trở thành vật mang vi rút lâu dài, có thể truyền bệnh cho cá thể sống chung môi trường.

Các cơ quan đích là trước thận, tim và lá lách, vì đây là những vị trí vi rút xâm nhập nhiều nhất, ở giai đoạn mạn tính, nồng độ vi rút có thể tăng cao trong não.

...

...

...

- Ở cá có dấu hiệu lâm sàng, vi rút có nhiều ở tất cả các mô bao gồm mang, da và cơ.

- Cá bị nhiễm vi rút VHS có biểu hiện xuất huyết ban, xuất huyết toàn thân ở da, mô cơ (đặc biệt ở cơ lưng) và các cơ quan nội tạng. Thận có màu đỏ sẫm ở giai đoạn cấp tính và có thể biểu hiện hoại tử nghiêm trọng ở cá sắp chết, lách sưng, gan thường nhợt nhạt và lốm đốm, đường tiêu hóa, ruột sau nhợt nhạt và không có thức ăn.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu.

Thu mẫu có dấu hiệu bệnh lý, còn sống hoặc mới chết. Mẫu phải được để riêng biệt trong lọ dụng cụ chứa mẫu vô trùng (4.2.3).

- Cá hương, cá bột, cá con có khối lượng nhỏ hơn 1 g: Lấy mẫu nguyên con, mỗi mẫu từ 1 g/mẫu đến 3 g/mẫu.

- Cá giống và cá thương phẩm có khối lượng từ 1 g đến 50 g: Lấy nguyên con, từ 5 con/mẫu đến 15 con/mẫu.

- Cá thương phẩm có khối lượng lớn hơn 50 g: Lấy nguyên con, từ 3 con đến 5 con hoặc lấy mang, da, cơ, tim, thận, lách của từ 3 con/mẫu đến 5 con/mẫu.

- Cá bố, mẹ: Lấy nguyên con, mỗi mẫu 1 con hoặc lấy mang, da, cơ, tim, thận, lách, tinh dịch và dịch buồng trứng của 1 con.

...

...

...

Nên lấy thận trước, lá lách và tim (không nên lấy gan). Cá bố lấy tinh dịch và cá mẹ lấy dịch buồng trứng.

6.2  Bảo quản mẫu

a) Bảo quản vận chuyển

Bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 48 h khi vận chuyển về phòng thí nghiệm hoặc bảo quản trong ethanol 70 % đến ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ mẫu : ethanol bằng 1:10.

b) Bảo quản tại phòng thí nghiệm

Mẫu xét nghiệm bằng phương pháp PCR được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C chuyển đến phòng thí nghiệm chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc được bảo quản trong dung dịch PBS (3.15) theo tỷ lệ mẫu: PBS bằng 1:10 ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc bảo quản trong ethanol từ 70% đến ethanol tuyệt đối.

6.3  Chuẩn bị mẫu

Dùng panh, kéo (4.2.4) vô trùng để thực hiện các thao tác: tách, cắt lấy mẫu (mang, da, cơ, tim, thận, lách).

Cho mẫu vào dung dịch PBS (3.15) theo tỷ lệ mẫu : PBS bằng 1:10, đồng nhất mẫu bằng máy nghiền mẫu (4.1.8) hoặc bằng cối, chày nghiền mẫu (4.1.14) để tạo thành huyễn dịch 10 %. Chuyển huyễn dịch vào 2 ống vô trùng, một ống mẫu để xét nghiệm và một ống lưu mẫu.

...

...

...

6.4  Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.5) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít tách chiết ARN: InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 (xem Phụ lục B.1) hoặc sử dụng kit tách chiết TACO RNA/DNA extraction Kit (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests (xem Phụ lục B.2) hoặc PureLinK Viral RNA/DNA mini kit (50) (Cat No: 12280-050) (xem Phụ lục B.3) [1]

6.5  Phương pháp real-time RT-PCR

6.5.1  Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy real-time PCR (4.1.5) theo phương pháp real-time RT-PCR để khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút gây bệnh nhiễm trùng xuất huyết trên cá, phản ứng sử dụng cặp mồi VHSV-ArhusF / VHSV-ArhusR, đoạn dò VHSV-Arhus-TAMRA probe hoặc cặp mồi mồi xuôi/ mồi ngược, đoạn dò gắn nhãn FAM-labelled (3.1). Trình tự cặp mồi được nêu trong bảng trình tự cặp mồi, dò.

Bảng 1 - Trình tự cặp mồi, dò

TT

Cặp mồi

...

...

...

1

VHSV-ArhusF

5’- AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC -3’

2

VHSV-ArhusR

5’- TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA -3’

3

Đoạn dò VHSV- Arhus-TAMRA

5’- 6FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTGATC-TTC-TG-TAMRA -3’

...

...

...

Mồi xuôi

5'-ATG-AGG-CAG-GTG-TCG-GAG-G-3’

5

Mồi ngược

5’-TGT-AGT-AGG-ACT-CTC-CCA-GCA-TCC-3'

6

Đoạn dò FAM- labelled

5’-6FAM-TAC-GCC-ATC-ATG-ATG-AGT-MGBNFQ-3’

Mồi và đoạn dò được chuẩn bị như sau:

...

...

...

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 25 μM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.12) (25 μl mồi gốc và 75 μl nước tinh khiết không có nuclease).

- Đoạn dò sử dụng nồng độ 10 μM: pha loãng đoạn dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.12) (10 μl mồi gốc và 90 μl nước tinh khiết không có nuclease).

6.5.2  Tiến hành phản ứng real-time RT-PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy real-time PCR.(4.1.5) theo phương pháp real-time RT- PCR sử dụng cặp mồi VHSV-ArhusF / VHSV-ArhusR, đoạn dò VHSV-Arhus-TAMRA hoặc cặp mồi xuôi/ mồi ngược, đoạn dò FAM-labelled, sử dụng kít nhân gen real-time RT-PCR (3.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.5.3  Đọc kết quả

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct).

- Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct = ± 2

Với điều kiện phản ứng như trên:

...

...

...

- Mẫu không có giá trị Ct là âm tính

- Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.

CHÚ THÍCH:

- Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

- Phản ứng real-time RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng real-time RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.6  Phương pháp RT-PCR

6.6.1  Chuẩn bị mồl

Phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu mồi xuôi 3F / mồi ngược 2R (3.2) để phát hiện vi rút gây bệnh nhiễm trùng xuất huyết ở cá.

...

...

...

Cặp mồi

Trình tự mồi từ đầu 5' tới 3'

Sản phẩm (bp)

mồi xuôi 3F

5’-GGG-ACA-GGA-ATG-ACC-ATG-AT-3’

319 bp

Mồi ngược 2R

5'-TCT-GTC-ACC-TTG-ATC-CCC-TCC-AG-3’

Mồi được chuẩn bị như sau:

...

...

...

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 μM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.12) (20 μl mồi gốc và 80 μl nước tinh khiết không có nuclease).

6.6.2  Tiến hành phản ứng RT-PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen PCR (4.1.4) theo phương, pháp RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút gây bệnh nhiễm trùng xuất huyết ở cá sử dụng cặp mồi mồi xuôi 3F/ reverse primer 2R (3.2) và sử dụng kít nhân gen RT-PCR (3.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem Phụ lục D)

6.6.3  Điện di

6.6.3.1  Chuẩn bị bản thạch

Pha thạch agarose (3.6) ở nồng độ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.7) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 μl chất nhuộm màu (3.8) vảo mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ đễ tránh tạo bọt và giúp chất nhuộm màu phân tán đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bàn thạch.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất).

6.6.3.2  Chạy điện di

Hút 2 μl chất đệm tải mẫu (3.10) vào 8 μl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch. Thực hiện điện di trong bộ điện di, chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.10) để so sánh kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 μl thang chuẩn ADN (3.10) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

6.6.4  Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc sản phẩm PCR (4.1.11).

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Đối chứng dương có vạch sáng kích thước 319 bp;

...

...

...

Với điều kiện phản ứng trên:

- Mẫu xét nghiệm âm tính khi tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Mẫu xét nghiệm dương tính khi tại giếng của mẫu thử xuất hiện vạch sáng kích thước 319 bp.

7  Kết luận

Mẫu cá được xác định mắc nhiễm trùng xuất huyết do vi rút Viral haemorrhagic septicaemia (VHS) ở cá khi có những đặc điểm dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích của bệnh và:

- Có kết quả dương tính với VHS bằng phương, pháp RT-PCR (xem 6.6.4) hoặc

- Có kết quả dương tính với VHS bằng phương pháp real-time RT- PCR (xem 6.5.3).

Phụ lục A

...

...

...

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch đệm TAE 1X hoặc TBE 1X

A.1.1  Thành phần

Dung dịch TAE(TBE)10X:

100 ml

Nước khử ion:

900 ml

Tổng:

1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

...

...

...

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) pH 7,4 ± 0,2

A.2.1  Thành phần

Natri chloride (NaCl)

8g

Kali chloride (KCl)

0,2 g

...

...

...

1,15g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

0,2 g

Nước cất

1 000 ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong 1 000 ml nước cất. Lắc đều cho tới khi tan hoàn toàn.

Chỉnh pH trong khoảng 7,4 ± 0,2. Hấp ở 121 °C trong 15 phút, bảo quản ở 4 °C đến 8 °C. Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

B.1  Quy trình tách chiết ARN bằng bộ kít InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96

B.1.1  Thuốc thử và vật liệu

B1.1.1  Dung dịch đệm RV

B1.1.2  Dung dịch rửa 1

B1.1.3  Dung dịch rửa 2

...

...

...

B1.1.5  Dung dịch thu hồi ADN/ARN (EB)

B.1.2  Thiết bị, dụng cụ

B.1.2.1  Máy chiết tách tự động (Ví dụ Thermo Scientific^TM KingFisher^TM Flex)

B.1.2.2  Máy lắc trộn vortex

B.1.2.3  Máy ly tâm lạnh

B.1.2.4  Máy lắc, ủ nhiệt

B.1.2.5  Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml

B.1.3  Cách tiến hành

- Chuẩn bị đĩa chứa dung dịch chiết tách theo hệ thống của máy như sau:

...

...

...

+ Đĩa rửa 2 và Đĩa rửa 3: 800μl dung dịch wash 2/giếng;

+ Đĩa thu hồi ADN/ARN: 100μl dung dịch EB/giếng

- Huyễn dịch 10% của mẫu bệnh phẩm được rã đông, trộn đều bằng máy vortex. Ly tâm mẫu trong máy ly tâm lạnh với lực ly tâm 2500 g/15 min.

- Hút 200 μl dịch trong bên trên sau khi ly tâm vào ống eppendorf 1,5ml vô trùng có chứa sẵn 200 μl dung dịch đệm lysis. Trộn đều mẫu bằng máy vortex và spin để kéo các phần bám trên nắp ống xuống.

- Chuyển toàn bộ dung dịch trong ống eppendorf vào đĩa chứa mẫu 96 giếng (mỗi giếng tương ứng với một mẫu trên đĩa). Dùng giấy dán đĩa chuyên dụng dán kín mặt đĩa.

- Đặt đĩa lên máy lắc, ủ nhiệt (HLC-MHR23). Lắc đĩa với gia tốc 750 rpm/15 min, nhiệt độ 65 °C.

- Lấy đĩa ra khỏi máy lắc, để nguội trong 5 min, tháo bỏ giấy dán đĩa. Bổ sung 420 μl dung dịch Bead Mix (gồm có 400 μl Binding solution và 20 μl MAP) vào mỗi giếng.

- Chuyển tất cả các đĩa bao gồm: đĩa Tip Combs, đĩa elution buffer, đĩa washing wash 3, đĩa washing wash 2, đĩa washing wash 1 và đĩa chứa mẫu vào từng khay của máy chiết tách tự động theo hướng dẫn của máy.

- Chọn chương trình chiết tách RNA đã được cài đặt trước đó theo hướng dẫn của hãng sản xuất kít InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96.

...

...

...

- Bảo quản mẫu ARN ở 4 °C trong vài giờ và âm 20 °C đến âm 80 °C trong thời gian lâu hơn.

B.2  Quy trình tách chiết ARN bằng bộ kit Taco RNA/DNA

B.2.1  Thuốc thử và vật liệu thử

B.2.1.1  Dung dịch đệm rửa A

B.2.1.2  Dung dịch đệm rửa B

B.2.1.3  Nước đệm

B.2.1.4  Ethanol tuyệt đối (100%).

B.2.1.5  Hạt từ.

B.2.2  Thiết bị, dụng cụ

...

...

...

B.2.2.2  Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml

B.2.3  Chuẩn bị thuốc thử

- Pha dung dịch đệm rửa A (washing buffer A) với 135 ml ethanol tuyệt đối.

- Pha dung dịch đệm rửa B (washing buffer B) với 230 ml ethanol tuyệt đối.

- Tiến hành theo sơ đồ nêu trong Bảng B.1.

Bảng B.1 - Sơ đồ chuẩn bị

Thuốc thử

Lượng (μl)

Vật liệu thử

...

...

...

Cột

H

G

F

E

D

C

B

A

...

...

...

250

-

-

►1

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

Hạt từ

50

►2

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

-

-

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

...

...

...

-

-

►4

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

-

►5

...

...

...

Nước đệm

100

-

-

►6

...

...

...

Ethanol tuyệt đối

250

...

...

...

-

►7

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

Hạt từ

50

►8

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

-

-

►9

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

...

...

...

►10

...

...

...

750

-

-

►11

...

...

...

Nước đệm

100

-

-

►12

...

...

...

B.2.4  Chuẩn bị mẫu thử

- Cho 450 μl mẫu dung dịch đệm vào các ống eppendorf.

- Cho 100 μl mẫu vào ống eppendorf chứa dung đệm.

- Lắc bằng máy votex (4.1.10) trong 15 s.

...

...

...

- Cho 550 μl (mẫu và dung dịch đệm) vào các giếng ở cột 1 hoặc 7.

B.2.5  Đưa mẫu vào máy TACO

- Đặt đĩa vào máy TACO

- Bặt lược vào máy TACO.

- Sử dụng máy TACO theo hướng dẫn sử dụng: Máy TACO tự động chiết tách trong khoảng 50 min.

- Thu 100 μl ADN từ các giếng trong cột 6 hoặc 12 sang các ống eppendorf mới.

CHÚ THÍCH: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện.

B.3.  Tách chiết ARN bằng bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit

B.3.1.  Thuốc thử và vật liệu thử

...

...

...

B.3.1.2  Dung dịch đệm lysis Buffer

B.3.1.3  Dung dịch carrier RNA

B.3.1.4  Dung dịch dung dịch đệm rửa (W5)

B.3.1.5  Nước RNase-free (E3)

B.3.2  Thiết bị, dụng cụ

B.3.2.1  Máy ly tâm

B.3.2.2  Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml

B.3.2.  Tiến hành

- Pha hỗn hợp dung dịch carrier và lysis buffer

...

...

...

A mL x 28 μL/mL = B μL

Trong đó: N là số mẫu cần tách chiết

A là tổng số mL lysis buffer cần cho N mẫu;

B là tổng số μL carrier RNA cần cho N mẫu.

1. Cho 25 μL proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml;

2. Cho 200 μL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K;

CHÚ THÍCH: nếu thể tỉch mẫu <200 μL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 μL bằng dung dịch PBS hoặc dung dịch natri chloride 0,9 %.

3. Cho hỗn hợp dung dịch lysis buffer và carrier RNA vào ống chứa mẫu; đóng nắp ống và vortex 15s;

4. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;

...

...

...

6. Để ở nhiệt độ phòng 5 min;

Chú thích: mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên.

7. Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc;

8. Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 2 min đến 3 min; chuyển cột lọc sang ống thu mới;

9. Cho 500 μL dung dịch đệm rửa (W5) vào cột lọc; ly tâm 12.000 vòng trong 2 min đến 3 min; Chuyển cột lọc sang ống thu mới;

10. Lặp lại bước 9 với 500 μL nước rửa dung dịch đệm rửa (W5) một lần nữa;

11. Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới;

12. Ly tâm khô 12000 vòng trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5;

13. Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 μL;

...

...

...

15. Để ở nhiệt độ phòng 1 min; Ly tâm cột lọc ở 12000 vòng trong 1 min đến 2 min.

16. Lấy sản phẩm dưới cột lọc; Bảo quản mẫu ARN ở 4 °C trong vài giờ và âm 20 °C đến âm 80 °C trong thời gian lâu hơn.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phương pháp real-time RT-PCR phát hiện vi rút VHS

Thực hiện phản ứng real-time RT-PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng một trong 02 cặp mồi VHSV-ArhusF / VHSV-ArhusR, đoạn dò VHSV-Arhus-TAMRA probe (Jonstrup và cs, 2013) hoặc cặp mồi mồi xuôi/ mồi ngược, đoạn dò FAM- labelled probe [4] đã được chuẩn bị (3.1) và kít nhân gen real-time RT-PCR (3.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: theo Kit nhân gen qScript XLT One-Step RT-qPCRToughMix, Code: 95132.500[5] , Đóng gói: 500 mẫu/Kit. Quantabio. Mỹ hoặc kít tương đương theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

Bảng C.1 - Thành phần phản ứng real-time RT - PCR

STT

Thành phần

Nồng độ (μM)

Thể tích cho 1 phản ứng (μl)

1

Nước không có RNAase /ADNase

6

...

...

...

Dung dịch 2X reaction mix

12,5

3

Mồi xuôi

25

0,5

4

Mồi ngược

...

...

...

0,5

5

Đoạn dò

10

0,5

Tổng

20

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng VHS chuẫn.

...

...

...

Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành Phản ứng real-time RT-PCR bằng máy real-time PCR (4.1.5) đã cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong bảng C.2.

Bảng C.2 - Chu trình nhiệt của phản ứng real-time RT - PCR

Nhiệt độ, °C

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

50

10 min

01

...

...

...

01 min

01

95

10s

45

60(*)

30 s

CHÚ THÍCH:

+ Phản ứng real-time RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen) và mẫu đối chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen);

...

...

...

+ Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp Phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử dụng.

Phụ lục D

(Quy định)

Phương pháp RT-PCR phát hiện vi rút VHS

Thực hiện phản ứng RT-PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi mồi xuôi 3F/ reverse primer 2R đã được chuẩn bị (3.2) và kít nhân gen (3.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

VÍ DỤ: Chuẩn bị MasterMix cho phản ứng RT-PCR theo kít Superscript^® III One-Step RT-PCR with Platinum^®Taq. Cat: 12574-02636[3] hoặc kít tương đương theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho mỗi phản ứng nhân gen được nêu trong bảng D.1.

...

...

...

Thành phần

Nồng độ (μM)

Thể tích cho 1 phản ứng (μl)

Nước không có ARNase/ADNase

6

Dung dịch 2x Reaction Mix

12,5

...

...

...

20

0,5

Mồi ngược 2R

20

0,5

Enzyme

0.5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

...

...

...

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng chuần.

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng RT-PCR bằng máy nhân gen (4.1.4) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng D.2).

Bảng D.2 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

...

...

...

30 min

1

94

02 min

1

94

15 s

40

60

...

...

...

68

60s

68

5 min

1

Giữ ở 4 °C đến khi tắt máy

+ Phản ứng RT- PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen) và mẫu đối chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen);

+ Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng;

+ Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử dụng.

...

...

...

Phụ lục E

(Tham khảo)

Sơ đồ xét nghiệm vi rút VHS

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Einer-Jensen, K., Ahrens, P., Forsberg, R., & Lorenzen, N. (2004). Evolution of the fish rhabdovirus viral haemorrhagic septicaemia virus. Journal of General Virology, 85(5), 1167-1179

[2] Elsayed, E., Faisal, M., Thomas, M., Whelan, G., Batts, W., & Winton, J. (2006). Isolation and characterization of Viral Hemorrhagic Septicemia Virus from muskellunge (Esox masquinongy) in Lake St. Clair, Michigan. Journal of Aquatic Animal Health, 18(1), 26-35

[3] Garver KA, Hawley LM, McClure CA, Schroeder T, Aldous s, Doig F, et al. Development and validation of a reverse transcription quantitative PCR for universal detection of viral hemorrhagic septicemia virus. Disease of Aquatic Organisms. 2011 ;95:97-112.

...

...

...

[5] Jonstrup SP, Kahns S, Skall HF, Boutrup TS, Olesen NJ. Development and validation of a novel TaqMan-based real-time RT-PCR assay suitable for demonstrating freedom from viral haemorrhagic septicaemia virus. Journal of Fish Diseases. 2013;36:9-23

[6] Parry L, Dixon PF. stability of nine viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) isolates in seawater. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists. 1997;17:31-6

(7] Walker PJ, Benmansour A, Dietzgen R, et al. Family Rhabdoviridae. In: Van Regenmortel MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, et al., editors. Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses. 7th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: Academic Press; 2000. p. 563-83.

[8] OIE/WOAH, Manual of diagnostic test for aquatic animals, 2021, Chapter 2.3.10 Manual of diagnostic test for Infection with viral haemorrhagic septicaemia virus.

[1] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương

[5] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[3] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương