Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8377:2010 về tôm và sản phẩm tôm – Phát hiện virut gây bệnh đốm trắng

• Số hiệu: TCVN8377:2010
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2010

Mồi	Trình tự	Sản phẩm
WSE/1 (146F1)	5'-ACT-ACT-AAC-TTC-AGC-CTA-TCTAG-3'	1447 bp
WSE/2 (146R1)	5'-TAA-TGC-GGG-TGT-AAT-GTT-CTT-ACG-A-3'
WSI/3 (146F2)	5'-GTA-ACT-GCC-CCT-TCC-ATC-TCC-A-3'	941 bp
WSI/4 (146R2)	5'-TAC-GGC-AGC-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3'

5.1.2 Dung dịch mồi

Dùng dung dịch đệm TE (5.1.3) để pha loãng mồi đến nồng độ 25 mM.

5.1.3 Dung dịch đệm TE

Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6.

5.2 Thuốc thử tách chiết DNA dùng dung dịch đệm

5.2.1 Thành phần

Tris 50 mM

Tris (hydroxymetyl)-aminometan (6,06 g trong 1 l)

EDTA 1 mM

...

...

...

NaCl 500 mM

Natri clorua (29,22 g trong 1 l)

SDS 1 %

Natri dodecyl sulfat (10 g trong 1 l)

Proteinaza K 10 µg/ml

Chỉ thêm vào trước khi thực hiện tách chiết

5.2.2 Pha chế dung dịch đệm

Hòa tan Tris, EDTA và NaCl với lượng nước cất vô trùng ít hơn thể tích cuối cùng. Giữ cho dung dịch luôn được khuấy đảo đều, chỉnh pH về giá trị 8,0 bằng HCl. Khi pH thấp, EDTA sẽ tan dễ dàng. Cuối cùng thêm lượng SDS cần thiết vào dung dịch và thêm nước cho đủ thể tích cuối cùng. Hấp khử trùng ở 121 ^oC trong 15 min. Dung dịch dung dịch đệm sau khi pha được bảo quản ở 4 ^oC.

CHÚ THÍCH Trước khi sử dụng dung dịch đệm ly trích, thì bổ sung thêm proteinaza K với nồng độ như trên (5.2.1). Ví dụ: thêm 50 µl dung dịch proteinaza K nồng độ gốc 20 mg/ml vào mỗi 10 ml dung dịch đệm ly trích.

...

...

...

5.3 Thuốc thử tách chiết DNA dùng hệ thống cột ly tâm

5.3.1 Dung dịch đệm mô

Chuẩn bị 20 ml dung dịch gồm urê 4 M, Tris 200 mM, NaCl 20 mM, EDTA 200 mM, có pH 7,4. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.3.2 Dung dịch đệm giải

Chuẩn bị 20 ml dung dịch gồm guaninidin-HCl 6M, urê 10 mM, Tris-HCl 10 mM, Triton X-100 20 %, có pH 4,4. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.3.3 Proteinaze K, là chất lyophilizat dùng để bất hoạt enzym nucleaza.

5.3.4 Dung dịch đệm để loại bỏ chất ức chế

Chuẩn bị 33 ml dung dịch gồm guanidin-HCl 5 M, Tris-HCl 20 mM, có pH 6,6. Thêm 20 ml etanol tinh khiết. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.3.5 Dung dịch đệm rửa

...

...

...

5.3.6 Dung dịch đệm rửa giải

Chuẩn bị 40 ml dung dịch Tris-HCl 10 mM, có pH 8,5. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.4 Hỗn hợp phản ứng PCR từng thành phần

5.4.1 Hỗn hợp phản ứng PCR - bước 1 (100 µl/ống phản ứng)

Nước thêm vào                                                             72,6 µl

Dung dịch đệm (không chứa Mg^2+)                                 10,0 µl

MgCl₂ 50 mM                                                                 3,0 µl

dNTP 10 mM                                                                 2,0 µl

Mồi WSE/1 20 µM                                                          5,0 µl

...

...

...

 DNA polymeraza 5U/µl                                                  0,4 µl

DNA đích                                                                      2 µl

5.4.2 Hỗn hợp phản ứng PCR - bước 2 (100 µl/ống phản ứng)

Nước thêm vào                                                             64,6 µl

Dung dịch đệm (không chứa Mg^2+)                                 10,0 µl

MgCl₂ 50 mM                                                                3,0 µl

dNTP 10 mM                                                                 2,0 µl

Mồi WSI/3 20 µM                                                           5,0 µl

Mồi WSI/4 20 µM                                                           5,0 µl

...

...

...

Dung dịch phản ứng PCR của bước 1:                          2 µl

CHÚ THÍCH Nếu dung dịch đệm PCR đã có sẵn MgCl₂ thì sẽ không cần bổ sung thêm. Để bảo quản hỗn hợp PCR trong tủ đông thì không bổ sung emzym và mồi; khi sử dụng sẽ bổ sung. Thể tích của một hỗn hợp phản ứng PCR cần pha bằng thể tích phản ứng trừ thể tích mẫu (DNA đích thêm vào). Có thể sử dụng thuốc thử và các sản phẩm dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành kit đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới đây (5.5).

5.5 Hỗn hợp phản ứng PCR – dạng chuẩn bị sẵn để dùng cho PCR hạt

5.5.1 Thành phần

Thành phần của hỗn hợp phản ứng PCR gồm: mỗi dNTP có nồng độ 200 µM trong Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM và MgCl₂ 1,5 mM, 2,5 đơn vị Taq DNA polymeraza tinh khiết, có pH 9,0. Trước khi sử dụng hạt phải được hoàn nguyên đến thể tích cuối 25 µl.

5.5.2 Hỗn hợp phản ứng PCR hạt bước 1

PCR hạt                                    01 hạt

Nước thêm vào                         23,0 µl

Mồi WSE/1                              0,5 µl (0,31 µM)

...

...

...

DNA đích                                  1 µl

5.5.3 Hỗn hợp phản ứng PCR hạt bước 2

PCR hạt                                    01 hạt

Nước thêm vào                         23,5 µl

Mồi WSI/3                                 0,5 µl (0,31 µM)

Mồi WSI/4                                 0,5 µl (0,31 µM)

Dung dịch phản ứng PCR của bước 1:   0,5 µl

5.6 Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X)

Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước. Thêm 40 ml EDTA 0,5 M (5.7), và thêm nước cho đủ 1 l. Hấp vô trùng ở 121 ^oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng pha loãng với nước thành dung dịch 1X.

...

...

...

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Hấp vô trùng ở 121 ^oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

5.8 Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần

Chuẩn bị dung dịch gồm Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen xyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM [sử dụng dung dịch EDTA (5.7)]. Bảo quản ở nhiệt độ –20 °C.

5.9 Dung dịch DEPC

Dung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % (thể tích), lắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ –20 °C.

5.10 Thạch agaroza 1,5 %

Cân 1,5 g agaroza trong 100 ml dung dịch đệm TBE 1X, đun nóng làm tan hoàn toàn agaroza. Để nguội từ 55 °C đến 60 °C, lắc đều, tránh tạo bọt khí.

5.11 Bảng thạch agaroza

Chuẩn bị khuôn, cân bằng mặt khuôn bằng giọt nước, gắn lược vào khuôn, đổ thạch agaroza (5.10) vào khuôn với bề dày khoảng 3 mm đến 5 mm. Để nguội và đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Gỡ lược, đặt thạch agaroza vào trong máng điện di, các giếng của bảng thạch phải ở phía gần điện cực âm. Đổ dung dịch TBE 1X cho ngập mặt thạch agaroza trước khi cho sản phẩm khuếch đại vào để điện di.

...

...

...

Hút 5 µl dung dịch etidi bromua (10 mg/ml) hoà tan trong 100 ml nước. Bảo quản ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng –20 °C.

5.13 Thang DNA

Sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 341 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 341 bp đã biết trước.

6. Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:

6.1 Máy chu trình nhiệt, có thể thực hiện chính xác và lặp lại chu trình thời gian và nhiệt độ được quy định trong 7.4.5.

6.2 Máy lắc vortex.

6.3 Máy ly tâm lạnh, có thể hoạt động với tốc độ tối đa trên 13 000 r/min.

6.4 Hệ thống phát hiện các sản phẩm PCR, bao gồm:

...

...

...

b) khuôn, khay, lược dùng để tạo bảng thạch agaroza

c) bàn đọc kết quả, với tia UV bước sóng 302 nm

d) bộ phận chụp ảnh để lưu kết quả, ví dụ: máy đọc Gel- Doc (nếu có).

6.5 Tủ đông, có thể hoạt động ở nhiệt độ không lớn hơn –20 ^oC.

6.6 Tủ lạnh, có thể hoạt động ở nhiệt độ từ 2 ^oC đến 8 ^oC.

6.7 Tủ thao tác vô trùng.

6.8 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,001 g.

6.9 Micropipet, dung tích 10 µl, 20 µl, 100 µl và 1 000 µl; có đầu típ (với dung tích nhỏ hơn hoặc bằng 10 µl phải sử dụng đầu típ có lọc).

6.10 Ống phản ứng, chuyên dùng cho PCR, dung tích 1,5 ml và 0,2 ml.

...

...

...

6.12 Ống góp, dùng bọc ngoài ống lọc tinh.

7. Cách tiến hành

7.1 Chuẩn bị mẫu

7.1.1 Đối với mẫu tôm hậu ấu trùng (postlarvae)

Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ 10 cá thể đến 15 cá thể; lấy phần đuôi, không lấy gan tuỵ.

7.1.2 Đối với mẫu tôm bố mẹ

Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ 10 cá thể đến 15 cá thể; lấy phần đuôi, không lấy gan tuỵ.

7.1.3 Đối với mẫu tôm thương phẩm

Lượng mẫu cần dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg, lấy ở phiến mang tôm, hoặc chân bơi, chân bò hoặc phần cơ hoặc 100 µl dịch bạch huyết của tôm.

...

...

...

Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg: lấy mang, cuống mắt, phần cơ hoặc 100 µl dịch bạch huyết.

7.2 Tách chiết RNA

Sử dụng một trong hai quy trình tách chiết DNA theo thuốc thử mục (5.2) hoặc (5.3) để tách chiết DNA. Theo quy trình tách chiết DNA (7.2.2) dịch DNA được lọc tinh khiết hơn so với quy trình (7.2.1).

7.2.1 Tách chiết DNA dùng dung dịch đệm

Cho khoảng 100 mg đến 200 mg mẫu (7.1) vào ống phản ứng dung tích 1,5 ml, bổ sung 600 µl dung dịch đệm (5.2.2). Nghiền nhuyễn mẫu.

Ủ mẫu đã nghiền ở 95 ^0C trong 10 min. Sau đó ly tâm với tốc độ 12 000 r/min trong 10 min. Chuyển 200 µl dịch nổi phía trên vào ống phản ứng sạch dung tích 1,5 ml. Thêm 400 µl etanol 95 %.

Lắc mẫu bằng máy lắc Vortex rồi ly tâm với tốc độ 12 000 r/min trong 5 min. Gạn bỏ dung dịch etanol, giữ lại cặn. Làm khô cặn DNA.

Hoà tan phần cặn trên với dung dịch DEPC (5.9) hoặc dung dịch đệm TE (5.1.3).

CHÚ THÍCH Do nguồn mẫu khác nhau, chứa lượng DNA khác nhau, vì vậy cần điều chỉnh nồng độ DNA bằng cách hoà tan DNA vào các thể tích dung dịch DEPC hoặc dung dịch TE phù hợp theo lượng cặn DNA thu hồi được. Xác định hàm lượng DNA thu được bằng cách đo giá trị mật độ quang (OD) của dịch pha loãng theo tỉ lệ 1: 5 (10 µl dịch DNA thu được 40 µl nước) ở bước sóng 260 nm (OD₂₆₀) hoặc bằng cách tiến hành điện di 10 µl dịch DNA thu được ở nồng độ thạch agaroza 1,5 %.

...

...

...

7.2.2 Tách chiết DNA dùng hệ thống cột ly tâm

Cho khoảng 100 mg đến 200 mg mẫu (7.1) vào ống phản ứng dung tích 1,5 ml, thêm 200 µl dung dịch đệm mô (5.3.1), nghiền mẫu bằng chày nghiền vô trùng.

Tiếp tục thêm 50 µl proteinaza K (5.3.3), trộn đều dung dịch, ủ ống này ở 55 ^oC trong 1 h.

Thêm 200 µl dung dịch đệm giải (5.3.2), trộn đều ngay và đem ủ ở 70 ^oC trong 10 min.

Làm ấm lọ dung dịch đệm rửa giải (5.3.6) ở 70 ^oC.

Ly tâm các ống phản ứng dung tích 1,5 ml ở tốc độ 13 000 r/m trong 30 s nhằm loại bỏ mô chưa thuỷ phân.

Chuyển 200 µl phần dịch nổi sang các ống phản ứng 1,5 ml mới chứa sẵn 100 µl isopropanol. Trộn đều và chuyển toàn bộ dung dịch sang các ống lọc tinh có gắn ống góp.

Ly tâm các ống với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Bỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.

Thêm 500 µl dung dịch đệm loại bỏ chất ức chế (5.3.4) vào các ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Bỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.

...

...

...

Ly tâm các ống góp chứa ống lọc tinh ở tốc độ 13 000 r/min trong 20 s để loại bỏ hoàn toàn dung dịch đệm rửa từ các ống lọc tinh này.

Chuyển các ống lọc tinh sang ống phản ứng mới, dung tích 1,5 ml. Thêm 100 µl dung dịch đệm rửa giải đã được làm ấm ở 70 ^oC, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min.

Loại bỏ các ống lọc tinh, thu được dung dịch DNA ở trong ống phản ứng. Dịch tách chiết DNA sử dụng ngay cho phản ứng khuếch đại hoặc bảo quản ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng –20 ^oC.

7.3 Chuẩn bị các mẫu kiểm chứng cho phản ứng PCR

7.3.1 Mẫu kiểm soát

Dung dịch nước cất hai lần hoặc dung dịch DEPC.

7.3.2 Mẫu kiểm chứng âm tính

Mẫu tôm không bị bệnh đã biết trước hoặc có thể sử dụng mồi đặc hiệu cho nhóm giáp xác mười chân thay cho việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu ở trên (5.1.1): mồi xuôi: 143F 5'-TGC-CTT-ATC-AGCTNT-CGA-TG-TAG-3' và mồi ngược: 145R 5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3'; sản phẩm thu được sau khi khuếch đại là 848 bp.

7.3.3 Mẫu kiểm chứng dương tính

...

...

...

7.4 Khuếch đại DNA bước 1

7.4.1 Mẫu thử

Hút 2 µl dịch DNA của mẫu vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR bước 1 (5.4.1). Hoặc hút 1 µl dịch DNA của mẫu vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR-hạt bước 1 (5.5.1).

7.4.2 Mẫu kiểm soát

Hút 2 µl (7.3.1) vào ống hỗn hợp phản ứng PCR bước 1 (5.4.1). Hoặc hút 1 µl dịch DNA của mẫu vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR-hạt bước 1 (5.5.1).

7.4.3 Mẫu kiểm chứng âm tính

Hút 2 µl (7.3.2) vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR bước 1 (5.4.1). Hoặc hút 1 µl (7.3.3) vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR-hạt bước 1 (5.5.1).

7.4.4 Mẫu kiểm chứng dương tính

Hút 2 µl (7.3.3) vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR bước 1 (5.4.1). Hoặc hút 1 µl (7.3.2) vào các ống hỗn hợp phản ứng PCR-hạt bước 1 (5.5.1).

...

...

...

7.4.5 Đặt các ống vào máy chu trình nhiệt để thực hiện phản ứng chuỗi trùng hợp theo chu kỳ luân nhiệt như sau:

Số chu kỳ

Nhiệt độ, ^oC

Thời gian

Bước

1

94

2 min

Biến tính ban đầu

...

...

...

94

30 s

Biến tính

55

30 s

Lai/ bắt cặp

72

30 s

Kéo dài mạch

...

...

...

72

5 min

Kéo dài mạch

4

Giữ ổn định

7.5 Khuếch đại DNA bước 2

7.5.1 Sau khi có sản phẩm khuếch đại DNA bước 1, chuyển 10 µl sản phẩm PCR khuếch đại này vào mỗi ống hỗn hợp PCR bước 2 (5.4.2). Hoặc chuyển 0,5 µl sản phẩm PCR khuếch đại DNA bước 1 vào mỗi ống hỗn hợp PCR-hạt bước 2 (5.5.2).

...

...

...

Mẫu kiểm soát: sản phẩm khuếch đại DNA từ bước 1 của mẫu kiểm soát cho vào một ống phản ứng PCR bước 2.

Mẫu kiểm chứng âm tính: sản phẩm khuếch đại DNA từ bước 1 của mẫu kiểm chứng âm tính cho vào một ống phản ứng PCR bước 2.

Mẫu kiểm chứng dương tính: sản phẩm khuếch đại DNA từ bước 1 của mẫu kiểm chứng dương tính cho vào một ống phản ứng PCR bước 2.

Đánh số cho các ống và đậy chặt nắp ống. Ly tâm nhẹ để dung dịch tụ xuống đáy ống trước khi cho các ống vào máy chu trình nhiệt.

7.5.2 Đặt các ống vào máy chu trình nhiệt để thực hiện phản ứng chuỗi trùng hợp theo chu kỳ luân nhiệt (7.4.5).

7.5.3 Giữ các sản phẩm khuếch đại bước 2 ở 4,0 ^0C cho đến khi điện di.

7.6 Điện di

7.6.1 Cho từ 5 µl đến 7 µl dung dịch đệm tải mẫu (5.8) vào các ống sản phẩm khuếch đại (7.5.3), trộn đều.

7.6.2 Hút từ 5 µl đến 7 µl dịch tương ứng từ các ống (7.6.1), theo thứ tự: thang DNA, mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính và các mẫu, nhỏ vào từng giếng trên bảng thạch (5.11).

...

...

...

CHÚ THÍCH Dung dịch đệm tải mẫu gồm hai thành phần màu: màu xanh đậm của bromophenol blue; màu xanh nhạt của xylen xyanol. Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di. Sau đó, lấy thạch agaroza từ buồng điện di ra để nhuộm với etidi bromua.

7.6.4 Nhuộm etidi bromua: Đặt bảng thạch agaroza vừa điện di vào khay nhựa sạch, đổ dung dịch etidi bromua (5.12) ngập bảng thạch.

7.6.5 Lắc nhẹ trong khoảng 20 min. Vớt bảng thạch ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa với nước cất trong 10 min để loại bỏ dung dịch nhuộm còn dư trên bề mặt bảng thạch.

7.6.6 Đặt bảng thạch trên bàn đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm hoặc chụp hình ảnh bằng máy Gel- Doc (nếu có).

7.7 Đọc kết quả

7.7.1 Dưới ánh sáng của tia UV, các đoạn cDNA có gắn etidi bromua phát quang tạo thành vạch sáng.

7.7.2 Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa ra kết luận.

7.7.3 Cách đọc kết quả:

Kết quả điện di

...

...

...

Vạch 1447 bp

Vạch 941 bp

Kết quả

Thang DNA

Phân vạch rõ ràng và sáng theo kích thước sử dụng

Điện di tốt

Mẫu kiểm chứng dương tính

Có

Có

...

...

...

Không

Có

Đạt yêu cầu

Không

Không

Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng, enzym hỏng

Có

Không

Không đạt yêu cầu

...

...

...

Không

Không

Không ngoại nhiễm

Có

Có

Bị ngoại nhiễm

Có

Không

Không

...

...

...

Mẫu

Có

Có

Không phát hiện WSSV

Không

Có

Âm tính với WSSV

Không

Không

...

...

...

Có

Không

Không chấp nhận kết quả. Phân tích lại mẫu

8. Diễn giải kết quả

8.1 Kết quả âm tính với WSSV

Kết quả được coi là âm tính khi:

a) mẫu thử không có vạch sáng kích thước 941 bp và không có vạch sáng kích thước 1447 bp, hoặc vạch sáng kích thước khác với mẫu kiểm chứng dương tính;

b) có vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

c) không có vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;

...

...

...

8.2 Kết quả dương tính với WSSV

Kết quả được coi là dương tính khi:

a) mẫu thử có vạch sáng kích thước 941 bp, có thể có hoặc không có vạch sáng kích thước 1447 bp;

b) có vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

c) không có vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;

d) thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

...

...

...

– phương pháp thử sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

– mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều kiện được coi là tự chọn và bất kỳ chi tiết nào có thể ảnh hưởng tới kết quả (nếu có);

– kết quả thử nghiệm thu được.