Mồi
|
Trình tự
|
Sản phẩm
|
10F
|
5’-CCG-CTA-ATT-TCA-AAA-ACT-ACG-3’
|
135 bp
|
144R
|
5’-AAG-GTG-TTA-TGT-CGA-GGA-AGT-3’
|
Hoặc
Mồi
Trình tự
Sản phẩm
273F
5’-CAA-GAT-CTC-ACG-GCA-ACT-CA-3’
273 bp
273R
5’-CCG-ACG-AGA-GTG-TTA-GGA-GG-3’
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khi
sử dụng cặp mồi 273F/R, thành phần hóa chất cho phản ứng PCR cũng như điều kiện
khuếch đại PCR xem Phụ lục B.
5.2 Thuốc
thử tách chiết RNA
5.2.1 Dung dịch đệm
ly giải/đệm liên kết mô
Dung dịch chứa
guanidin-HCl 4,5 M, natri phosphat 100 mM, có pH 6,6. Bảo quản ở 25 0C.
5.2.2 DNaza I
Chuẩn bị dung dịch
DNaza I gồm enzym DNaza 5 U/µl và dung dịch đệm rửa giải (5.2.6). Trộn kỹ, bảo
quản ở –15 oC đến –25 oC.
5.2.3 Dung dịch đệm ủ
DNaza
Dung dịch chứa
NaCl 1 M, Tris-HCl 20 mM, MnCl2 10 mM, có pH 7,0. Bảo quản ở 25 oC.
5.2.4 Dung dịch đệm
rửa I
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.5 Dung dịch đệm
rửa II
Chuẩn bị dung dịch
chứa NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, có pH 7,5. Thêm vào 40 ml etanol
tinh khiết Bảo quản ở 25 oC.
5.2.6 Dung
dịch đệm rửa giải: nước cất hai lần.
CHÚ
THÍCH Có nhiều quy trình khác nhau để tách chiết RNA từ mô động vật. Tuy nhiên
để đạt được kết quả mong muốn có thể sử dụng một số bộ chế phẩm tách chiết RNA
thương mại có bán sẵn.
Nên
sử dụng thuốc thử và các sản phẩm dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng
hợp thành bộ chế phẩm đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp
như trên.
5.3 Pha chế
dung dịch đệm TE (dùng để pha loãng cặn RNA)
Hòa tan Tris
10 mM với EDTA 1 mM, chỉnh pH về giá trị 7,6 bằng dung dịch HCl.
5.4 Hỗn hợp
phản ứng khuếch đại PCR (Master mix)
Có thể sử
dụng hỗn hợp phản ứng PCR được cung cấp sẵn trên thị trường.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sử
dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 135 bp hoặc 273 bp.
Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 135 bp hoặc 273 bp đã biết
trước.
5.6 Pha chế
một số hoá chất điện di
5.6.1
Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA đậm đặc 10
lần)
Hòa
tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước. Sau đó, thêm 40 ml EDTA
0,5 M và thêm nước cho đủ 1 l. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min.
Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng mới pha loãng với nước cất vô trùng
thành dung dịch đậm đặc 0,5 lần.
5.6.2
EDTA (etylen
diamin tetra axetic) 0,5 M
Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước rồi chỉnh cho dung
dịch có pH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4 M. Sau đó, thêm nước cất cho đủ
500 ml. Tiến hành hấp vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
5.6.3
Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần
Hoà
tan các thành phần: Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen
xyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM.
5.6.4 Dung
dịch diethypyrocarbonat (DEPC)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.6.5 Tạo
bảng thạch 1,5 % (Gel agaroza 1,5 %)
5.6.5.1 Tạo
bảng thạch 1,5 %
Đun tan hoàn
toàn 1,5 g agaroza trong 100 ml dung dịch đệm TBE đậm đặc 0,5 lần. Để nguội ở
nhiệt độ phòng khoảng 10 min (đạt 55 °C đến 60 °C).
5.6.5.2 Dung dịch etidi bromua nồng độ 10 mg/ml
5.6.5.3 Nhuộm
trong
Chuyển agaroza vừa đun vào một chai chuyên
dùng để pha etidi bromua, sau đó cho vào 4ml etidi bromua 10 mg/ml
(cho 4 ml etidi bromua 10 mg/ml
vào 100 ml dung dịch agaroza), trộn đều (tránh tạo bọt khí). Chuẩn bị khuôn, cân bằng mặt khuôn bằng giọt
nước, gắn lược vào khuôn, sau đó đổ agaroza vào khuôn đạt độ dày khoảng 3 mm đến 5 mm. Để đông tự nhiên ở nhiệt độ
phòng. Gỡ lược, đặt bảng thạch vào
trong máng điện di, các giếng của bảng thạch phải ở phía gần điện cực âm. Đổ
dung dịch TBE đậm đặc 0,5 lần cho đến khi ngập bảng thạch trước khi cho mẫu vào
để điện di.
5.6.5.4 Nhuộm
ngoài
Sau
khi điện di, ngâm bảng thạch vào dung dịch
etidi bromua 10 mg/ml (5 µl hoà tan trong 100ml nước cất). Dung dịch này phải bao phủ toàn bộ bảng
thạch. Lắc nhẹ trong khoảng 20 min. Sau đó, vớt bảng thạch ra khỏi dung dịch
nhuộm, rửa với nước cất trong 10 min để loại bỏ dung dịch nhuộm còn dư trên bề
mặt bảng thạch.
6.
Thiết bị và dụng cụ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.1
Bộ nghiền mẫu vô trùng.
6.2 Máy ly
tâm, có
thể hoạt động với tốc độ tối đa trên 12 000 r/min.
6.3 Máy luân nhiệt.
6.4 Bộ điện
di, gồm
nguồn và buồng điện di.
6.5 Bàn đọc
kết quả, với
tia UV bước sóng 302 nm, hoặc bộ phận chụp ảnh để lưu kết quả.
6.6 Micropipet,
dung
tích 10 µl; 20 µl; 100 µl; 1000 µl.
6.7 Ống
nghiệm đáy côn (ống Eppendorf), dung tích 1,5 ml và 0,2 ml.
6.8 Ðầu típ
các loại,
có đầu lọc với thể tích không lớn hơn 10 µl.
6.9 Khuôn,
khay, lược
dùng để tạo bảng thạch.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.11 Ống góp,
dùng bọc ngoài ống lọc tinh.
7. Cách tiến hành
7.1
Chuẩn bị mẫu
7.1.1 Đối với
mẫu tôm hậu ấu trùng
Lượng mẫu
dùng cho mỗi phản ứng từ 10 cá thể đến 30 cá thể. Đối với tôm hậu ấu trùng 11
ngày tuổi trở lên loại bỏ đầu.
7.1.2 Đối với
mẫu tôm bố mẹ
Lượng mẫu
dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg cuống mắt hoặc một phần chân bơi.
7.1.3 Đối với
mẫu tôm thương phẩm
Lượng mẫu
dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg phiến mang tôm, chân bơi, chân bò,
cơ hoặc khoảng 100 µl dịch bạch huyết của tôm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu tôm còn
sống và bảo quản trong cồn 95 % ngay sau khi lấy. Thể tích cồn sử dụng để bảo
quản không nên nhỏ hơn 3 lần thể tích mẫu cần phân tích. Sau khi cố định, mẫu
được lưu giữ ở nhiệt độ từ 25 0C đến 30 0C trong 1 tuần.
Khi cần bảo quản mẫu lâu hơn nữa phải thay cồn mới.
7.2
Tách chiết RNA
7.2.1 Cho khoảng
100 mg đến 200 mg mẫu tôm (7.1) vào ống nghiệm có đáy côn có thể tích 1,5 ml
(Eppendorf), thêm 400 µl dung dịch tách chiết RNA (5.2.1).
7.2.2 Nghiền mẫu
bằng chày nghiền vô trùng, ly tâm lạnh với tốc độ 13 000
r/min trong 2 min, sử dụng phần dịch nổi phía trên.
7.2.3 Bổ sung
200 µl etanol tinh khiết vào dịch nổi thu được, trộn đều.
7.2.4 Chuyển
toàn bộ phần dịch nổi thu được (thể tích tối đa 700 µl) sang các ống lọc tinh
có gắn ống góp.
7.2.5 Ly tâm lạnh
với tốc độ 13 000 r/min trong 30 s.
7.2.6 Bỏ ống góp
chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.
7.2.7 Thêm 90 µl dung dịch đệm
ủ DNaza (5.2.3) và 10 µl DNaza I (5.2.2) vào các ống lọc tinh, ủ 15 min
ở nhiệt độ phòng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.2.9 Bổ sung 500 µl dung dịch
đệm rửa II (5.2.5) vào các ống lọc tinh, ly tâm các ống với tốc độ 8 000 r/min trong 15 s,
bỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.
7.2.10 Thêm 300 µl dung dịch đệm rửa II
(5.2.5) vào các ống lọc tinh, ly tâm các ống với tốc độ 13 000 r/min trong 2 min,
bỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.
7.2.11 Gắn
các ống lọc tinh vào một ống nghiệm có đáy côn 1,5 ml khác.
7.2.12 Bổ sung 100 µl dung dịch đệm rửa
(5.2.6) vào các ống lọc tinh, ly tâm các ống với tốc độ 8 000 r/min trong
1 min. Loại bỏ các ống lọc tinh, sản phẩm RNA được chứa trong các ống nghiệm có
đáy côn 1,5 ml.
Sử dụng
phần dịch RNA thu được để chạy RT-PCR hoặc giữ lạnh ở –20 oC chờ
thực hiện bước kế tiếp.
7.3
Khuếch đại RNA bằng kỹ thuật RT-PCR
Để đảm bảo
kết quả phân tích có độ tin cậy cao nên quá trình khuếch đại RNA cần chuẩn bị
đầy đủ các yếu tố sau:
a) RNA của
mẫu đã biết trước không có virut YHV;
b) RNA của
mẫu đã biết trước dương tính YHV (bao gồm mẫu mô, máu hoặc plasmid); RNA mẫu
trắng (nước cất hai lần).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.3.1 Phiên mã ngược RNA thành cDNA
Cho 2 µl
RNA ly trích từ mẫu vào 20 µl dung dịch đệm PCR (Tris/HCl 10 mM, có pH 8,3, KCl
50 mM) chứa 2,5 U enzym phiên mã ngược M-MLV (Moloney murine leukaemia virus),
1,0 U chất ức chế ribonucleaza, mồi ngược 0,75 μM (144R),
dATP 1 mM, dTTP 1 mM, dCTP 1 mM, dGTP 1 mM và MgCl2
5 mM. Sau đó đem ủ ở 42 0C trong 15 min để tổng hợp thành
cDNA. Tiếp tục ủ hỗn hợp ở 100 0C trong 5 min để làm bất hoạt
enzym phiên mã ngược. Sau đó có thể làm lạnh về 5 0C để chờ phân
tích các bước tiếp theo.
7.3.1.1 Mẫu
thử
2 µl dịch
chiết RNA cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.4).
7.3.1.2 Mẫu
kiểm chứng dương tính
2 µl mẫu
kiểm chứng dương tính cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.4).
7.3.1.3 Mẫu
kiểm chứng âm tính
2 µl mẫu
kiểm chứng âm tính cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.4).
7.3.2 Khuếch
đại cDNA
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.3.3 Khuếch
đại phản ứng PCR
Sau
khi cho dịch tách chiết mẫu, mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính
vào ống chứa hỗn hợp phản ứng PCR đã được đánh dấu, đậy nắp ống thật chặt, ly
tâm nhẹ để dung dịch tụ hết xuống đáy ống không còn dính trên thành ống. Đặt
các ống phản ứng PCR vào máy luân nhiệt thực hiện phản ứng theo chương trình
sau:
Số chu kỳ
Nhiệt độ, oC
Thời gian
40
94
30 s
58
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
72
30 s
1
72
10 min
Giữ ở 4 oC
cho đến khi phân tích.
7.4 Điện di
7.4.1
Cho từ 5 µl đến 7 µl dung dịch đệm tải mẫu (5.6.3) vào các ống sản phẩm khuếch
đại (7.3.3), trộn đều.
7.4.2 Hút khoảng 5 ml đến 7 ml từ các ống (7.4.1): mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu kiểm
chứng dương tính, thang DNA chuẩn, các mẫu vào mỗi giếng trên bảng thạch. Trình
tự hút mẫu cho vào giếng: mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu thử, mẫu kiểm chứng dương
tính, thang DNA chuẩn.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
CHÚ THÍCH Dung dịch
đệm tải mẫu gồm hai thành phần màu: màu xanh đậm là chỉ thị bromphenol blue;
màu xanh nhạt là chỉ thị xylene cyanol. Khi quan sát thấy màu xanh đậm của
thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng gel agaroza, dừng quá trình
điện di.
Để
đảm bảo kết quả phân tích có độ tin cậy cao, cần tiến hành điện di mẫu kiểm
chứng âm tính, mẫu kiểm chứng dương tính, thang DNA chuẩn, mẫu phân tích.
7.4.4 Nhuộm etidi
bromua bảng thạch (chỉ
áp dụng cho nhuộm ngoài)
Xem 5.6.5.4.
7.5 Đọc kết quả
7.5.1 Đọc kết quả
7.5.1.1 Đọc kết quả
bằng mắt thường
Đặt bảng gel vào máy
đọc UV đã được lắp kính chắn. Bật đèn UV. Dưới ánh sáng của tia UV, các đoạn
DNA có etidi bromua chèn giữa 2 mạch sẽ phát quang tạo thành vạch sáng.
7.5.1.2 Đọc kết quả bằng
thiết bị chuyên dùng (Gel-Doc)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.5.2 Đối chiếu các vạch
sáng của mẫu với các vạch sáng từ chuẩn đối mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm
chứng âm tính và thang DNA để đưa ra kết luận.
7.5.3 Cách đọc kết
quả
Đọc
kết quả điện di theo trình tự như sau:
Kết quả điện di
Giếng
Vạch 135 bp
Kết quả
Thang DNA
Phân vạch rõ ràng,
sáng, theo kích thước của thang
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu kiểm chứng dương tính [+]
Có
Hỗn hợp phản ứng
PCR tốt
Không
Mẫu kiểm chứng
dương tính hỏng, enzym hỏng
Mẫu kiểm chứng âm tính [-]
Không
Không ngoại nhiễm
Có
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu thử
Có
Có YHV
Không
Không có YHV
8. Diễn giải kết quả
Theo
phần diễn giải các kết quả, ghi lại phát hiện hoặc không phát hiện virut YHV
trong phần mẫu thử.
8.1
Kết
quả âm
tính
Kết
quả được coi là âm tính khi:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
–
không phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;
–
thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.
–
mẫu phân tích không có vạch DNA đích.
8.2
Kết
quả dương
tính
Kết
quả được coi là dương tính:
–
phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;
–
không phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;
–
thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.
–
mẫu phân tích xuất hiện vạch DNA đích.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khi
thử nghiệm cho kết quả nghi ngờ (không phát hiện vạch sáng ở mẫu kiểm chứng
dương tính, phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính hoặc thang DNA không
phân vạch rõ ràng...), thì phải tiến hành phân tích lại.
9. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm
phải ghi rõ:
– thông tin cần thiết
để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
– phương pháp lấy mẫu
đã sử dụng (nếu có);
– phương pháp thử sử
dụng;
– chi tiết thao tác
không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết
bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả (nếu có);
– kết quả thử nghiệm
thu được;
–
báo cáo kết quả cũng phải nêu rõ nếu các phép thử tiếp theo được thực hiện bởi
phòng thử nghiệm chuẩn, hoặc nếu đã thực hiện thì nêu kết quả thu được.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phụ
lục B
(Tham
khảo)
Thành
phần cho phản ứng RT-PCR và điều kiện khuếch đại PCR khi sử dụng cặp mồi 273F/R
B.1 Thành phần
cho phản ứng PCR
B.1.1 Thành phần
Thuốc thử
25 ml /phản ứng
Nồng độ cuối cùng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6,5 ml
Dung dịch đệm EZ
đậm đặc 5 lần
5,0 ml
Đậm đặc 1 lần
Hỗn hợp dNTP (10 mM
cho mỗi loại)
3,0 ml
300 mM cho mỗi loại
Mồi 273F
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,62 mM
Mồi 273R
1,0 ml
0,62 mM
Mn(OA)2
2,5 ml
2,5 mM
Enzyme rTth
1,0 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu thử
5,0 ml
nhỏ hơn 50 ng
B.1.2 Mẫu
5 µl dịch chiết RNA
cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (B.1.1).
B.1.3 Mẫu kiểm chứng
dương tính
5 µl mẫu kiểm chứng
dương tính cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (B.1.1).
B.1.4 Mẫu kiểm chứng
âm tính
5 µl mẫu kiểm chứng
âm tính cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (B.1.1).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sau khi cho
dịch tách chiết mẫu, mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính vào ống
chứa hỗn hợp phản ứng PCR đã được đánh dấu, đậy nắp ống thật chặt, ly tâm nhẹ
để dung dịch tụ hết xuống đáy ống không còn dính trên thành ống. Đặt các ống phản ứng PCR
vào máy luân nhiệt thực hiện phản ứng theo chương trình sau:
Số chu kỳ
Nhiệt độ, oC
Thời gian
1
60
30 min
1
95
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
39
95
45 s
60
45 s
72
45 s
1
60
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giữ ở 4 oC cho đến khi phân
tích.