Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12697:2019 về Thức ăn chăn nuôi - Phương pháp sắc ký lỏng

• Số hiệu: TCVN12697:2019
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2019

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12697:2019

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT CLENBUTEROL, SALBUTAMOL, RACTOPAMINE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ HAI LẦN

Animal feed- Determination of content of clenbuterol, salbutamol, ractopamine - Liquid chromatography tandem mass spectrometry method

Lời nói đầu

TCVN 12697:2019 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT CLENBUTEROL, SALBUTAMOL, RACTOPAMINE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ HAI LẦN

Animal feed- Determination of content of clenbuterol, salbutamol, ractopamine - Liquid chromatography tandem mass spectrometry method

...

...

...

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng - khối phổ hai lần để xác định hàm lượng các chất clenbuterol, salbutamol, ractopamine trong thức ăn chăn nuôi. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là 0,5 μg/kg.

Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng để xác định các chất clenbuterol, salbutamol, ractopamine trong nước tiểu động vật (tham khảo Phụ lục A). Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là 0,5 μg/l.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6952 (ISO 9498), Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.

3  Nguyên tắc

Mẫu thử được chiết bằng dung dịch đệm phosphat pH = 6. Dịch chiết được ly tâm, lọc và làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi cation. Các chất phân tích được định lượng bằng sắc ký lỏng-khối phổ hai lần.

4  Thuốc thử

...

...

...

4.1  Metanol (CH₃OH), loại dùng cho LC-MS.

4.2  Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho LC-MS.

4.3  Axit axetic băng (CH₃COOH).

4.4  Dung dịch axit axetic 1 %, lấy 1 ml dung dịch axit axetic (4.3) vào bình định mức 100 ml chứa 50 ml đến 70 ml nước, định mức bằng nước cất đến vạch, lắc đều.

4.5  Axit formic (HCOOH), độ tinh khiết ≥ 98 %.

4.6  Dung dịch axit formic 0,1 %, lấy 1 ml axit formic (4.5) vào bình định mức 1000 ml chứa khoảng 500 ml nước, định mức bằng nước cất đến vạch, lắc đều.

4.7  Amoni hydroxit (NH₄OH), nồng độ 25 %.

4.8  Dung dịch NH₄OH 5 % trong metanol, lấy 20 ml dung dịch NH₄OH 25 % (4.7) cho vào bình định mức 100 ml, thêm metanol (4.1) đến vạch, lắc đều.

4.9  Natri hydroxit (NaOH).

...

...

...

4.11  Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄), độ tinh khiết ≥ 98 %.

4.12  Dung dịch đệm phosphat, pH = 6, cân 13,6 g KH₂PO₄ (4.11) vào bình định mức 1000 ml, hòa tan bằng 950 ml nước cất, chỉnh pH đến 6 ± 0,1 bằng dung dịch NaOH 10 % (4.10), định mức đến vạch bằng nước cất, lắc đều.

4.13  Axit phosphoric (H₃PO₄) đặc.

4.14  Dung dịch H₃PO₄ 10 %, lấy 1 ml H₃PO₄ (4.13), pha loãng bằng nước từ từ đến 10 ml.

4.15  Khí nitơ, độ tinh khiết ≥ 99,99 %.

4.16  Chất chuẩn, salbutamol, clenbuterol và ractopamine (độ tinh khiết ≥ 95 %).

4.17  Dung dịch chuẩn gốc 1000 pg/ml, cân 50 mg mỗi loại chuẩn (4.16) vào các bình định mức 50 ml riêng biệt. Hoà tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.1). Khi được bảo quản lạnh ở -18°C, dung dịch này có thể bền trong 12 tháng.

4.18  Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 2 μg/ml, lấy 100 μl của từng dung dịch chuẩn gốc 1000 μg/ml (4.17) vào bình định mức 50 ml, thêm metanol (4.1) đến vạch. Khi được bảo quản ở 2÷8°C, dung dịch này có thể bền trong 6 tháng.

4.19  Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 100 ng/ml, lấy 500 μl chuẩn trung gian hỗn hợp 2 μg/ml (4.18) vào bình định mức 10 ml, thêm dung dịch axit axetic 1 % (4.4) đến vạch. Khi được bảo quản ở 2÷8°C, dung dịch này có thể bền trong 3 tháng.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Nồng độ của các dung dịch chuẩn được hiệu chỉnh dựa vào độ tinh khiết và lượng cân thực tế.

4.21  Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 μg/ml, cân 10 mg mỗi loại nội chuẩn clen-d9, sal-d3, rac-d6 (4.20) vào bình định mức 10 ml riêng biệt. Hòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.1). Khi được bảo quản lạnh ở -18 °C, dung dịch này có thể bền trong 12 tháng.

4.22  Dung dịch nội chuẩn trung gian hỗn hợp 2 ng/ml, lấy 100 μl của từng dung dịch nội chuẩn gốc 1000 μg/ml (4.21) vào bình định mức 50 ml, thêm metanol (4.1) đến vạch. Khi được bảo quản ở 2÷8°C, dung dịch này có thể bền trong 6 tháng.

4.23  Dung dịch nội chuẩn trung gian hỗn hợp 200 ng/ml, lấy 1000 μl nội chuẩn trung gian hỗn hợp 2 μg/ml (4.22) vào bình định mức 10 ml, thêm dung dịch axit axetic 1 % (4.4) đến vạch. Khi được bảo quản ở 2÷8°C, dung dịch này có thể bền trong 3 tháng.

4.24  Các dung dịch chuẩn làm việc, được chuẩn bị theo Bảng 1 và được pha ngay trước khi sử dụng.

Bảng 1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc

Dung dịch chuẩn

Nồng độ từng chất chuẩn trong dịch cuối cùng (ng/ml)

Nồng độ từng nội chuẩn trong dịch cuối cùng (ng/ml)

...

...

...

Thể tích nội chuẩn trung gian hỗn hợp 200 ng/ml (μl)

Thể tích dung dịch axit axetic 1 % (μl)

S1

1,0

10

10

50

940

S2

...

...

...

10

25

50

925

S3

5

10

50

50

...

...

...

S4

10

10

100

50

850

S5

25

10

...

...

...

50

700

S6

50

10

500

50

450

CHÚ THÍCH: Có thể xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng bằng cách thay thế dung dịch axit axetic 1 % bằng dịch chiết của mẫu trắng (7.3).

...

...

...

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Máy lắc xoáy, tốc độ quay đến 400 rpm (ví dụ VWR DS-500E hoặc tương đương).

5.2  Máy ly tâm, Allegra X-22R (ví dụ VWR International hoặc tương đương). Có thể ly tâm 5000 rpm đối với ống ly tâm 15 ml và 50 ml.

5.3  Bộ bay hơi dung môi bằng nitơ, có thể điều chỉnh được nhiệt độ đến 40 °C.

5.4  Cân, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

5.5  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5.6  Pipet, loại điều chỉnh được thể tích từ 10 μl đến 100 μl và từ 100 μl đến 1000 μl.

5.7  Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần, có thể sử dụng hệ thống gồm sắc ký lỏng kèm bộ bơm mẫu tự động ghép nối với detector khối phổ loại ba tứ cực, bẫy ion với nguồn ion hóa phun điện tử (ESI), chế độ ion dương.

5.8  Thiết bị rung siêu âm.

...

...

...

5.10  Bình định mức các loại: dung tích 10 ml, 20 ml, 50 ml, 100 ml, 1000 ml

5.11  Ống ly tâm các loại: dung tích 15 ml, 50 ml; bằng nhựa polypropylen.

5.12  Bộ chiết pha rắn trao đổi cation mạnh, ví dụ cột SCX 500 mg x 3 ml hoặc tương đương.

5.13  Giấy lọc, đường kính 11 cm.

5.14  Pipet pasteur, dung tích 3 ml.

5.15  Màng lọc, loại PTFE, kích thước lỗ 0,22 μm.

5.16  Lọ đựng mẫu, dung tích 2 ml.

6  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325.

...

...

...

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị mẫu sơ bộ

Mẫu được chuẩn bị theo TCVN 6952. Mẫu được xay nhỏ, trộn đều.

Lượng mẫu tối thiểu là 0,5 kg, để đảm bảo tính đồng nhất.

7.2  Chuẩn bị mẫu thử

Cân 2,00 g mẫu thử (7.1) chính xác đến 0,01 g vào ống ly tâm 50 ml (5.11), thêm 100 μl nội chuẩn trung gian hỗn hợp 200 μg/l (4.23), để yên 30 min. Thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat (4.12) và lắc xoáy trong 1 min. Siêu âm mẫu trong 5 min và ly tâm với tốc độ 5000 rpm trong 5 min ở 4 °C. Lọc lấy dịch chiết phía trên qua giấy lọc (5.13) vào ống ly tâm 50 ml thứ 2. Lặp lại quá trình chiết với 10 ml đệm phosphat (4.12) và gộp dịch chiết vào ống ly tâm thứ 2. Kiểm tra và chỉnh pH đến 6,0 ±0,1 bằng dung dịch NaOH 10 % (4.10) hoặc H₃PO₄ 10 % (4.14). Ly tâm với tốc độ 5000 rpm trong 5 min ở 4 °C, lọc qua giấy lọc (5.13) vào ống ly tâm 50 ml thứ 3 (5.11).

Hoạt hóa cột trao đổi cation (5.12) lần lượt với: 3 ml metanol (4.1), 3 ml nước, 3 ml dung dịch đệm phosphat (4.12). Nạp 10 ml dịch chiết qua cột. Rửa tạp lần lượt với 3 ml nước, 3 ml metanol (4.1). Rửa giải bằng 6 ml NH₄OH 5 % trong metanol (4.8) vào ống 15 ml (5.11). Thổi khô bằng dòng khí nitơ ở 40°C. Hòa cặn thu được bằng 1 ml dung dịch axit axetic 1 % trong nước (4.4), lắc đều. Lọc mẫu qua màng lọc 0,22 μm (5.15) vào lọ đựng mẫu 2 ml (5.16).

7.3  Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu âm tính với chất cần phân tích.

...

...

...

7.4  Chuẩn bị mẫu kiểm soát

Mẫu kiểm soát là mẫu chứa chất cần phân tích có hàm lượng đã biết. Mẫu kiểm soát được phân tích như mẫu thử.

Chuẩn bị mẫu kiểm soát 5 μ/kg. Cân 2,00 g mẫu trắng trên cân phân tích (5.5) vào ống ly tâm nhựa 50 ml (5.12), bổ sung 100 μl chuẩn trung gian hỗn hợp 100 μg/l (4.19) và 100 μl nội chuẩn trung gian hỗn hợp 200 μg/l (4.23). Lắc xoáy 1 min, sau đó để yên 30 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo như mẫu thử (7.2).

Hiệu suất thu hồi của mẫu kiểm soát phải đạt giá trị trong khoảng 60 % ÷ 115 %.

7.5  Phân tích trên máy LC-MS/MS

- Điều kiện phân tích bằng LC-MS/MS được tham khảo ở phụ lục B

- Thứ tự bơm mẫu: dung môi, các dung dịch chuẩn S1 đến S6, mẫu trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử

8  Tính toán kết quả

Dựa vào đường chuẩn biểu thị sự tương quan giữa tỷ lệ diện tích píc chuẩn và diện tích píc nội chuẩn với nồng độ. Dựa vào tỷ lệ diện tích píc mẫu và diện tích píc chất nội chuẩn tương ứng, tính được hàm lượng các chất phân tích trong dung dịch mẫu (C_i).

...

...

...

 (1)

Trong đó:

Xi: Hàm lượng chất “i” trong mẫu (μg/kg)

Ci: Hàm lượng chất "i" trong dung dịch mẫu tính từ đường chuẩn (μg/l)

m: Khối lượng mẫu (g) (trong trường hợp này là 2 g)

2: hệ số

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

...

...

...

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Xác định hàm lượng các chất clenbuterol, salbutamol, ractopamine trong nước tiểu động vật bằng phương pháp sắc ký lỏng - khối phổ hai lần

Nguyên tắc chung: Phương pháp xác định các chất clenbuterol, salbutamol, ractopamine trong mẫu nước tiểu động vật được tiến hành tương tự như phương pháp xác định các chất này trong mẫu thức ăn chăn nuôi tại tiêu chuẩn này, ngoại trừ các điều 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 và điều 8 của tiêu chuẩn được thay đổi như sau:

A.1  Chuẩn bị mẫu sơ bộ

...

...

...

Lượng mẫu tối thiểu là 150 ml. Mẫu được lắc đều trước khi xử lý để đảm bảo tính đồng nhất.

A.2  Chuẩn bị mẫu thử

Lấy 1,00 ml mẫu thử bằng pipet (5.6) vào ống ly tâm nhựa 15 ml (5.11), thêm 50 μl nội chuẩn trung gian hỗn hợp 200 μg/l (4.23), để yên 30 min. Thêm 10 ml đệm phosphat (4.12) vào ống. Lắc đều trong 5 min. Nếu có vẩn đục, thực hiện ly tâm với tốc độ 5000 rpm trong 5 min.

Hoạt hóa cột trao đổi cation (5.12) lần lượt với: 3 ml metanol (4.1), 3 ml H₂O, 3 ml dung dịch đệm phosphat (4.12). Nạp toàn bộ dịch chiết qua cột. Rửa tạp lần lượt với 3 ml nước, 3 ml metanol (4.1). Rửa giải bằng 6 ml NH₄OH 5% trong metanol (4.8) vào ống 15 ml (5.11). Thổi khô bằng dòng khí nitơ ở 40°C. Hòa cặn thu được bằng 1 ml dung dịch axit axetic 1% trong nước (4.4), lắc đều. Lọc mẫu qua màng lọc 0,22 μm (5.15) vào lọ đựng mẫu 2 ml (5.16).

A.3  Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu âm tính với chất cần phân tích.

Lấy 1,00 ml mẫu trắng và thực hiện các bước như mẫu thử (2).

A.4  Chuẩn bị mẫu kiểm soát

Chuẩn bị mẫu kiểm soát 5 μg/I. Lấy 1,00 ml mẫu trắng vào ống ly tâm nhựa 15 ml (5.11), thêm 50 μl chuẩn trung gian hỗn hợp 100 μg/l (4.19) và 50 μl nội chuẩn trung gian hỗn hợp 200 μg/l (4.23). Lắc xoáy 1 min, sau đó để yên 30 min trước khi tiến hành các bước như mẫu thử (2).

...

...

...

A.5  Tính toán kết quả

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu nước tiểu được tính theo công thức (A.1):

 (A.1)

Trong đó:

Xi: Hàm lượng chất “i” trong mẫu (μg/l)

Ci: Hàm lượng chất "i" trong dung dịch mẫu tính từ đường chuẩn (μg/l)

V: Thể tích nước tiểu (ml) (trong trường hợp này là 1 ml)

Phụ lục B

...

...

...

Ví dụ điều kiện phân tích các chất clenbuterol, salbutamol, ractopamine bằng thiết bị LC-MS/MS

B.1  Điều kiện LC

- Cột sắc ký C18 (150 mm x 2,1 mm; 3,5 μm) (Waters).

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/min.

- Nhiệt độ cột: 25 °C.

- Thể tích tiêm mẫu: 10 μl.

- Pha động: theo chế độ gradient như bảng dưới

Thời gian (min)

Axit formic 0,1 % trong nước (%)

...

...

...

0,01

100

0

1,00

100

0

3,00

70

30

...

...

...

0

100

6,00

0

100

7,00

100

0

10,00

...

...

...

0

B.2  Điều kiện khối phổ

- Khối phổ AB Sciex 5500 QQQ (Sciex)

- Nguồn ion hóa ESI, chế độ ion dương (+), thế phun 5,5 kV

- Nhiệt độ đầu phun (IS) 450 °C

- Curtain Gas (CUR) 20 psi

- Collision gas (CAD) 7 psi

- Ion source gas 1 (GS1) 30 psi

- Ion source gas 2 (GS2) 25 psi

...

...

...

- Entrance Potential (EP) 10

- Chế độ phân tích MRM như sau:

Tên chất phân tích

Mảnh mẹ (m/z)

Mảnh con (m/z)

Collision energy (eV)

Collision cell exit - CXP

Clenbuterol

277

...

...

...

23

26

277

259

15

16

Salbutamol

240

148*

...

...

...

20

240

166

19

22

Ractopamine

302

164*

21

...

...

...

302

107

41

16

Clenbuterol-d9

286

204

25

44

...

...

...

243

151

23

20

Ractopamin-d6

308

168

21

20

...

...

...

Tài liệu tham khảo

TCVN 4325 Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.