Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13043:2020 về Thức ăn chăn nuôi - Phân lập và định lượng Bacillus spp. giả định

• Số hiệu: TCVN13043:2020
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2020

Thành phần tính bằng g/l:
a) Trypton	15,0 g
b) Natri clorua	5,0 g
c) Pepton đậu tương	5,0 g
d) Thạch	15,0 g
e) Nước	1 000 ml
pH cuối cùng 7,3 ± 0,2.

6  Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:

6.1  Thiết bị hấp áp lực

Theo TCVN 6404 (ISO 7218).

6.2  Tủ ấm

Tủ ấm có khả năng duy trì nhiệt độ ủ ở 37 °C ± 1 °C.

6.3  Nồi cách thủy

Nồi cách thủy có khả năng giữ nhiệt độ ở 48 °C ± 1 °C và 80 °C ± 1 °C.

6.4  Thiết bị trộn

...

...

...

6.5  Máy khuấy cơ học

Máy khuấy cơ học, ví dụ: máy trộn Vortex [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] hoặc tương đương.

6.6  Cân

Cân, có thể cân chính xác đến hai chữ số thập phân.

6.7  Chai có nắp vặn

6.8  Pipet và đầu tip

Pipet chia vạch xà hết hoặc pipet tự động và đầu tip vô trùng để phân phối 100 pl và 1 ml. Các đầu tip có lỗ rộng gắn vào pipet để hút và pha loãng mẫu thức ăn chăn nuôi đã đồng nhất.

6.9  Que dàn mẫu

Que dàn mẫu hình chữ L hoặc hình tam giác vô trùng, bằng thủy tinh hoặc kim loại hoặc que dàn mẫu vô trùng dùng một lần bằng chất dẻo.

...

...

...

6.11  Tủ cấy vi sinh

6.12  Kinh hiển vi, có vật kính dầu độ phóng đại 100x.

6.13  Máy đo pH.

7  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 11923 (ISO/TS 17728)[5].

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

CẢNH BÁO - Thực hiện các biện pháp phòng ngừa để tránh khả năng nhiễm chéo mẫu với các vi khuẩn Bacillus. Đặc biệt sau khi lấy mẫu các chất phụ gia và sản phẩm premix có bổ sung Bacillus. Nếu cần, làm sạch và khử trùng thiết bị giữa mỗi lần lấy mẫu, đặc biệt là sau khi lấy mẫu các chất phụ gia và sản phẩm premix có chứa Bacillus. Cho mẫu vào vật chứa vô trùng.

8  Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498) và tiêu chuẩn sản phẩm thích hợp. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể như vậy thì các bên liên quan tự thỏa thuận về vấn đề này. TCVN 6952 (ISO 6498) đưa ra các hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu thử.

...

...

...

9.1  Chuẩn bị đĩa thạch

Chuẩn bị môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hấp áp lực môi trường ở 121 °C ± 1 °C trong 15 min, sau đó làm nguội trong nồi cách thủy đến nhiệt độ 48 °C ± 1 °C, rồi rót lần lượt các phần từ 12 ml đến 15 ml vào từng đĩa Petri (6.10) trong điều kiện vô trùng vả dàn đều để tạo thành một lớp đồng nhất.

Khi môi trường đã đông đặc, lật ngược các đĩa rồi xếp thành chồng, mỗi chồng bốn đĩa và đề khô ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ ấm ở 37 °C ± 1 °C khoảng 12 h hoặc để qua đêm. Hoặc để các đĩa mở hé nắp một phần trong tủ cấy vi sinh khoảng 30 min để làm khô bề mặt thạch.

Kiểm tra độ vô trùng của các đĩa đã khô.

CẢNH BÁO - Nếu bề mặt của đĩa thạch không khô hoặc lượng môi trường trong mỗi đĩa Petri nhiều hơn 15 ml thì khuẩn lạc của các loài Bacillus sẽ lan trên toàn bộ đĩa, do vậy không đếm được tế bào.

Các đĩa đã khô, nếu được bảo quản đúng cách, tránh mất nước có thể giữ được hai tuần trong tủ lạnh. Trong trường hợp này, để các đĩa đến nhiệt độ phòng khoảng 30 min trước khi sử dụng.

9.2  Chuẩn bị huyền phù ban đầu và dịch mẫu pha loãng thập phân

9.2.1  Chất phụ gia

Cân 20 g ± 0,1 g chất phụ gia loại thông thường. Cho 180 g ± 0,1 g dung dịch muối đệm phosphat (5.1) vào chất phụ gia. Đồng hóa hỗn hợp bằng bộ trộn thích hợp (6.4). Bắt đầu trộn ở tốc độ thấp để tránh hỗn hợp bị bắn tung tóe và chuyển sang trộn ở tốc độ cao trong 2 min rồi pha loãng ngay.

...

...

...

CẢNH BÁO - Các probiotic có xu hướng lắng nhanh cùng với các hạt mẫu, do đó khi vừa trộn xong phải lấy ngay huyền phù đồng nhất.

Chuyển 1,0 ml huyền phù ban đầu vào ống nghiệm chứa 9,0 ml dung dịch muối pepton polysorbat 80 loãng vô trùng (10^-2) (5.1.2). Trộn các lượng trong ống bằng máy trộn Vortex, trộn ở tốc độ tối đa 3 lần mỗi lần 1 s. Gia nhiệt ống trong nồi cách thủy ở 80 °C ± 1 °C trong 10 min. Làm nguội các ống trong nước lạnh (khoảng 10 °C) và pha loãng khi các ống đạt đến nhiệt độ phòng.

Khối lượng của thể tích pipet đã hút phải được hiệu chuẩn để thu được hệ số hiệu chính đối với việc tính số đếm các loài Bacillus.

9.2.2  Thức ăn chăn nuôi và sản phẩm premix

Cân 50 g ± 0,5 g mẫu thử. Thêm 450 g ± 1 g dung dịch natri hydroxit 0,2 % (5.2) vào thức ăn chăn nuôi hoặc sản phẩm premix. Đồng hóa hỗn hợp bằng bộ trộn thích hợp (6.4). Bắt đầu trộn ở tốc độ thấp để tránh hỗn hợp bị bắn tung tóe và sau đó chuyển sang trộn ở tốc độ cao (xem 6.4). Trộn thức ăn chăn nuôi và sản phẩm premix ở tốc độ cao trong 1 min.

CHÚ THÍCH: Có thể tránh tạo bọt mạnh trong huyền phù ban đầu khi trộn bằng cách sử dụng chất chống tạo bọt phù hợp (ví dụ: chất chống tạo bọt Silicon) ở nồng độ thích hợp.

Đặt mẫu ở nơi mát khoảng + 5 °C trong 30 min. Trộn lại mẫu ở tốc độ cao trong 1 min. Pha loãng ngay bằng cách sử dụng các đầu tip pipet có lỗ rộng.

CẢNH BÁO - Probiotic có xu hướng lắng nhanh với các hạt mẫu, do đó khi vừa trộn xong phải lấy ngay huyền phù đồng nhất.

Dùng các đầu tip pipet có lỗ rộng chuyển 1,0 ml huyền phù ban đầu vào ống nghiệm chứa 9,0 ml dung dịch muối pepton polysorbat 80 loãng vô trùng (10^-^2) (5.1.2). Trộn dung dịch bằng cách sử dụng máy trộn Vortex, trộn ở tốc độ tối đa 3 lần mỗi lần 1 s. Gia nhiệt ống nghiệm trong nồi cách thủy ở 80 °C ± 1 °C trong 10 min. Làm nguội các ống trong nước lạnh (khoảng 10 °C) và pha loãng khi các ống đạt đến nhiệt độ phòng.

...

...

...

Thời gian tính từ khi kết thúc quá trình chuẩn bị huyền phù ban đầu cho đến khi cấy môi trường không lớn hơn 30 min. Chuẩn bị một đĩa cấy tương tự nhưng không có mẫu để kiểm tra độ vô trùng.

Khối lượng của thể tích pipet đã hút phải được hiệu chuẩn để thu được hệ số hiệu chính đối với việc tính số đếm các loài Bacillus.

9.3  Cấy và ủ ấm

Mỗi dịch mẫu pha loãng đã chọn, cấy hai đĩa thạch riêng rẽ, mỗi đĩa 0,1 ml dung dịch. Dàn nhanh dung dịch trên bề mặt môi trường bằng que dàn mẫu vô trùng.

CẢNH BÁO - Các dịch mẫu pha loãng thích hợp đã chọn phải đồng nhất trước khi cấy mẫu lên các dĩa.

Lật ngược các đĩa rồi xếp thành chồng, mỗi chồng bốn đĩa và ù ở 37 °C ± 1 °C từ 16 h đến 24 h trong điều kiện hiếu khí.

9.4  Đếm khuẩn lạc

Sau khi ủ trong các điều kiện quy định nêu trên, chọn các đĩa chứa hơn 30 khuẩn lạc và không quá 300 khuẩn lạc Bacillus giả định để đinh lượng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU). Nếu có thể, đếm 4 đĩa (hai độ pha loãng liên tiếp). Nếu số khuẩn lạc trung bình mọc trên các đĩa dịch mẫu pha loãng cụ thể nhỏ hơn 20 thì cần lặp lại phép thử. Nếu kết quả của phép thử lặp lại thu được có ít hơn 20 khuẩn lạc thì cần đưa các số đếm vào công thức tính giá trị trung bình. Trong báo cáo thử nghiệm (Điều 12) kết quả này cần được giải thích như sau: Kết quả này nhỏ hơn giới hạn phát hiện.

Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc điển hình trên các môi trường xác định có hình thái như mô tả trong 3.1, được phát hiện và đếm là các loài Bacillus, số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mỗi gam thức ăn chăn nuôi được tính theo Công thức (1) trong Điều 10.

...

...

...

Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mỗi gam thức ăn chăn nuôi được tính theo TCVN 6404 (ISO 7218).

Số lượng Bacillus trên mỗi gam hoặc mililít, N, được tính bằng Công thức (1):

(1)

Trong đó:

Σ^C  là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa ở một hoặc hai độ pha loãng liên tiếp, có ít nhất một đĩa chứa 15 khuẩn lạc;

V là thể tích dịch cấy dùng cho mỗi đĩa, tính bằng mililít (ml) (thường là 0,1 ml);

n₁ là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất có thể đếm được;

n₂ là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai có thể đếm được;

...

...

...

Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa. Đối với số có ba chữ số, làm tròn chữ số thứ ba đến số gần 0 nhất. Trong trường hợp chữ số thứ ba là 5 thì làm tròn xuống nếu hai chữ số đầu tiên là số chẵn và làm tròn lên nếu hai chữ số đầu tiên là số lẻ.

Kết quả là số vi sinh vật trên mỗi gam sản phẩm, được biểu thị bằng một số từ 1,0 đến 9,9 nhân với lũy thừa tương ứng của 10.

11  Độ chụm

11.1  Yêu cầu chung

Độ chụm của phương pháp sử dụng các môi trường khác nhau về độ lặp lại và độ tái lập được xác định trong một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

11.2  Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Chi tiết nghiên cứu liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được công bố (xem Tài liệu tham khảo [1]) và được tóm tắt trong Phụ lục B. Giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập được xác định sử dụng ba loại mẫu thức ăn chăn nuôi bị nhiễm ở hai mức. Các giá trị thu được từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu.

11.3  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm (số vi khuẩn Bacillus trên gam hoặc mililit) đơn lẻ, độc lập (đã chuyển về logio) hoặc tỷ số của hai kết quả thử nghiệm cao hơn đến thấp hơn trên thang chuẩn, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

...

...

...

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm (số vi khuẩn Bacillus trên gam hoặc mililit) đơn lẻ (đã chuyển về logio) hoặc tỷ số của hai kết quả thử nghiệm cao hơn đến thấp hơn trên thang chuẩn, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn đến tiêu chuẩn này;

d) nhiệt độ ủ;

e) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi

f) mọi chi tiết về các tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các lưu ý về cách tiến hành

Phần lớn các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật sẽ bị bất hoạt bởi quá trình xử lý nhiệt được sử dụng trong phương pháp này.

Trong trường hợp thức ăn chăn nuôi “bị nhiễm” các loài không phải Bacillus probiotic ở mức cao thì có thể cần bổ sung các kháng sinh thích hợp vào môi trường thạch có khả năng ức chế hệ sinh vật nền.

Phụ lục B

(Tham khảo)

...

...

...

Một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm gồm có 17 phòng thử nghiệm của 12 nước châu Âu tham gia tiến hành trên ba loại mẫu khác nhau trong đó vi khuẩn Bacillus bị nhiễm ở hai mức và mẫu thứ ba là mẫu trắng đại diện. Mẫu nhiễm ở mức thấp đại diện cho mẫu thức ăn chăn nuôi và chỉ chứa Bacillus. Mẫu cô đặc cao hơn đại diện cho sản phẩm premix có chứa Bacillus và làm nền mẫu để bổ sung hệ vi sinh vật Pediococcus và nấm men. Các mẫu trắng có chứa các vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus và nấm men tuy nhiên không có bào tử Bacillus. Kết quả đánh giá mẫu trắng không được nêu trong Bảng B.1 và có thể xem trong các tài liệu được trích dẫn.

Phép thử được tổ chức vào năm 2002 và được phối hợp bởi Phòng thí nghiệm Khoa học Trung tâm (Anh) ^[1][2].

Bảng B.1 - Dữ liệu độ chụm thu được từ nghiên cứu cộng tác P1

Thông số

Mẫu (mức nhiễm)

Mức thấp 10^5 CFU/g

Mức cao 10^9 CFU/g

Số lượng mẫu

2

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

11

11

Giá trị trung bình, tính bằng log₁₀ CFU/g

5,95

9,53

Độ lệch chuẩn lặp lại, Sr, tính bằng log₁₀ CFU/g

0,07

0,09

...

...

...

1,13

0,99

Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 x s_r)

0,19

0,26

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R, tính bằng log₁₀ CFU/g

0,35

0,32

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, CV_R, tính bằng %

...

...

...

3,40

Giới hạn tái lập R (= 2,8 x s_R)

0,97

0,91

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] European Community Project SMT4-CT98-2235. “Methods for the official control of probiotics used as feed additives (vol. 1-3). 2002. Report EUR 20873/1-3. Office for Official Publications of the European Communities. ISBN 92-894-6249-3 (set)”

[2] Leuschner R.G.K., J. Bew, A. Cruc. 2003. Enumeration of probiotic bacilli spores in animal feed: A collaborative study. J. AOAC 86, 568-575

[3] Council Directive (79/373/EEC) of 2 April 1979 on the marketing of compound feeding stuffs (OJ No L 86, 6.4.1979, p.30)

...

...

...

[5] TCVN 11923 (ISO/TS 17728), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lấy mẫu để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi