Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11600:2016 về Thịt và sản phẩm thịt - Xác định dư lượng ractopamin

• Số hiệu: TCVN11600:2016
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2016

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11600:2016

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG RACTOPAMIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG - PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN

Meat and meat products - Determination of ractopamine residues - Liquid chromatographic (HPLC) method with fluorescence detection

Lời nói đầu

TCVN 11600:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2011.23 Parent and total ractopamine in bovine, swine and turkey tisues. Liquid chromatography with tandem mas spectrometry;

TCVN 11600:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG RACTOPAMIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG - PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN

...

...

...

CẢNH BÁO: Bảo quản các dung môi trong buồng bảo quản chất lỏng dễ cháy. Các dung môi này gây nguy hiểm nếu hít, nuốt hoặc tiếp xúc qua da. Sử dụng thiết bị bảo vệ cá nhân thích hợp như kính an toàn và găng tay cao su, các thao tác sử dụng dung môi phải thực hiện trong tủ hút. Thải bỏ các vật liệu theo quy định.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần để xác định dư lượng ractopamin, bao gồm ractopamin gốc và ractopamin tổng số trong sản phẩm động vật.

Phương pháp này đã được thử nghiệm trên gan, thận, thịt và mỡ của bò, lợn và gà. Kết quả thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.

2  Nguyên tắc

Ractopamin và dạng cộng kết glucuronid được chiết ra khỏi mẫu lợn, bò và gà bằng metanol. Khi phân tích ratopamin gốc, dịch chiết được tinh sạch bằng cách sử dụng cột chiết pha rắn (SPE) chế độ trao đổi cation hỗn hợp. Khi phân tích ractopamin tổng số (ractopamin gốc cùng với dạng cộng kết), dịch chiết được sấy khô, thủy phân bằng enzym, sau đó qua cột SPE chế độ trao đổi cation hỗn hợp. Xác định dư lượng chất phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần (LC-MS/MS), sử dụng đường chuẩn thích hợp với nền mẫu có ractopamin-d₆ làm chất nội chuẩn (ISTD).

3  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

3.1  Nước, nước cất hoặc nước khử ion, loại dùng cho HPLC.

...

...

...

3.3  Axetonitril (C₂H₃N), loại dùng cho HPLC.

3.4  Toluen (C₆H₅CH₃).

3.5  Polymetylsiloxan đã clo hóa, ví dụ Gelest Aquaphobe™ CM (P.N. PP1-AQCM). 1)

3.6  Trietylamin (C₆H₁₅N), độ tinh khiết 99 %.

3.7  Axit axetic băng.

3.8  Natri axetat (CH₃COONa).

3.9  Amoni hydroxit (NH₄OH).

3.10  Amoni axetat (NH₄COONa).

3.11  Axit formic (CH₂O₂), độ tinh khiết 98 %.

...

...

...

3.13  Chất chuẩn đối chứng ractopamin hydroclorua (ractopamin HCI), được bảo quản ở 25 ^oC.

3.14  Chất nội chuẩn ractopamin-d₆, được chứa trong ampun đã được cân trước.

3.15  Dung dịch polymetylsiloxan đã clo hóa (3.5) trong toluen (3.4), 2 % (thể tích).

3.16  Dung dịch chiết chất béo

Cho 0,2 ml trietylamin (3.6) vào 100 ml metanol (3.2). Trộn kỹ.

3.17  Dung dịch natri axetat, 25 mM.

Cho 2,05 g ± 0,20 g natri axetat (3.8) vào 950 ml nước (3.1) và hòa tan bằng cách trộn đều. Chỉnh pH đến 5,2 ± 0,1 bằng axit axetic băng (3.7), thêm nước (3.1) đến 1 000 ml.

3.18  Dung dịch rửa giải SPE

Cho 5,0 ml amoni hydroxit (3.9) vào 95 ml metanol (3.2). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

...

...

...

Cho 0,77 g ± 0,5 g amoni axetat (3.10) vào 950 ml nước (3.1) và hòa tan bằng cách trộn đều. Chỉnh pH đến 4,5 ± 0,1 bằng axit axetic băng (3.7). Thêm nước (3.1) đến 1 000 ml. Trộn kỹ.

3.20  Dung dịch pha động A

Cho 1,0 ml axit formic (3.11) vào 1 000 ml dung dịch amoni axetat 10 mM (3.19) và trộn kỹ.

3.21  Dung dịch pha động B

Cho 1,0 ml axit formic (3.11) vào 1 000 ml dung dịch axetonitril (3.3) và trộn kỹ.

3.22  Dung dịch chuẩn gốc ractopamin hydroclorua, 1 000 μg/ml.

Cân lượng chất chuẩn đối chứng ractopamin hydroclorua (3.13) tương ứng với 100 mg +0,1 mg (được tính theo dạng và độ tinh khiết) vào bình định mức 100 ml, hòa tan và thêm metanol (3.2) đến vạch.

3.23  Dung dịch chuẩn gốc ractopamin-d₆ hydroclorua, 1 000 μg/ml.

Hòa tan 1 mg ractopamin-d₆ hydroclorua trong ampun (3.14) với 1,0 ml metanol (3.2).

...

...

...

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc ractopamin hydroclorua (3.22) 100 lần bằng metanol (3.2).

3.25  Dung dịch nội chuẩn ractopamin-d₆ hydroclorua, 10 μg/ml.

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc ractopamin-d₆ hydroclorua (3.23) 100 lần bằng metanol (3.2).

3.26  Dung dịch ractopamin hydroclorua để dựng đường chuẩn (đối với các mẫu chưa thủy phân)

Từ dung dịch chuẩn trung gian ractopamin hydroclorua 10 μg/ml (3.24), chuẩn bị dãy dung dịch có nồng độ 0,50 ng/ml; 1,0ng/ml; 2,5 ng/ml; 10 ng/ml; 25 ng/ml và 50 ng/ml (tương đương 2,5 ng/g; 5,0 ng/g; 12,5 ng/g; 50 ng/g; 125 ng/g và 250 ng/g).

3.27  Dung dịch ractopamin hydroclorua để dựng đường chuẩn (đối với các mẫu đã thủy phân)

Từ dung dịch chuẩn ractopamin hydroclorua 10 ng/ml (3.26), chuẩn bị dãy dung dịch có nồng độ 0,20 ng/ml; 0,50 ng/ml; 1,0 ng/ml; 1,5 ng/ml và 2,0 ng/ml (tương đương 0,40 ng/g; 1,0 ng/g; 2,0 ng/g; 3,0 ng/g và 4 ng/g).

CHÚ THÍCH: Các nồng độ tương đương với các thể tích khác nhau có thể được thay thế. Để chuẩn bị dung dịch ractopamin hydroclorua, tất cả các nồng độ và phép tính phải dựa vào ractopamin tự do (được hiệu chính về độ tinh khiết và dạng).

Bảo quản tất cả các chất chuẩn gốc và dung dịch chuẩn ở 2 ^oC đến 8 ^oC tránh ánh sáng. Ở các điều kiện này, các dung dịch chuẩn gốc bền trong 30 ngày và dung dịch chuẩn khác bền trong 14 ngày. Đường chuẩn đối với các mẫu đã thủy phân chỉ gồm năm dung dịch chuẩn và tạo dải hẹp hơn so với đường chuẩn ractopamin tự do (chưa thủy phân).

...

...

...

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

4.1  Pipet định mức, loại A, bằng thủy tinh, có các dung tích thích hợp.

4.2  Bình định mức, có các dung tích thích hợp.

4.3  Ống đong hỗn hợp chia vạch, dung tích 50 ml, dùng một lần, có nắp vặn hoặc ống đong chia vạch bằng thủy tinh.

4.4  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến ± 0,00001 g.

4.5  Cân, có thể cân chính xác đến ± 0,01 g.

4.6  Máy đo pH.

4.7  Thìa, bằng thép không gỉ hoặc được phủ teflon.

4.8  Máy khuấy từ và que khuấy phủ Teflon.

...

...

...

4.10  Ống nghiệm, dài 100 mm, đường kính trong 16 mm, bằng borosilicat có nắp đậy hoặc ống nghiệm đã được silan hóa dài 100 mm, đường kính trong 16 mm.

4.11  Máy trộn vortex nhiều ống.

4.12  Ống ly tâm bằng polypropylen, hình nón, dung tích 50 ml, có nắp đậy.

4.13  Máy ly tâm, có rôto phù hợp với các ống ly tâm hình nón dung tích 50 ml và có thể đạt gia tốc 2025 g.

4.14  Bộ phân phối chân không, có khóa bằng polytetra fluorethylen (PTFE) và giá để ống nghiệm dài 16 mm.

4.15  Máy làm khô bằng nitơ, ví dụ: TurboVap™ LV 2) hoặc nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ 50 ^oC.

4.16  Bể cát, có khả năng duy trì được nhiệt độ 65 ^oC.

4.17  Cột chiết pha rắn (SPE), cột chế độ trao đổi cation hỗn hợp, ví dụ cột Oasis MCX, 3 ml, 60 mg 3).

4.18  Máy sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần (LC-MS/MS), loại ba tứ cực, ví dụ API 4000 hoặc API 5000 ^4).

...

...

...

4.20  Cột sắc ký, ví dụ: Zorbax SB-Phenyl, dài 50 mm, đường kính trong 4,6 mm, cỡ hạt 3,5 μm 5).

5  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Silan hóa ống nghiệm

Cần tuân thủ quy trình dưới đây nếu ống nghiệm đã mua chưa được silan hóa.

a) Đổ đầy một lượng dung dịch polymetylsiloxan đã clo hóa 2 % (3.15) vào một số ống nghiệm thích hợp (4.10) và đậy nắp ngay. Để cho dung dịch trong ống phản ứng ít nhất 2 h ở nhiệt độ phòng.

b) Loại bỏ dung dịch đã silan hóa.

c) Đổ đầy metanol (3.2) vào mỗi ống nghiệm, đậy nắp ngay và để cho dung dịch trong ống phản ứng ít nhất 2 h ở nhiệt độ phòng.

...

...

...

e) Tráng ống bằng metanol (3.2). Lật ngược ống và để đến khô.

6.2  Chuẩn bị mẫu thử

6.2.1  Đồng hóa và bảo quản mẫu

Xay hoặc nghiền tối thiểu 500 g mẫu, sử dụng máy xay (4.9) để tạo mẫu đồng nhất (nếu nghiền lạnh thì để lạnh khô đến thăng hoa trước khi lấy mẫu con).

Có thể cân 5 0 g ± 0,5 g mẫu con (mẫu đã nghiền), cho vào các ống ly tâm (4.12) và cấp đông để hạn chế mẫu cấp đông và rã đông nhiều lần. Bảo quản tất cả mẫu ở nhiệt độ đông lạnh (-10 ^oC hoặc thấp hơn) khi chưa xử lý hoặc chưa lấy mẫu con. Nên bảo quản mẫu bổ sung cùng với các mẫu phân tích để xác nhận tính ổn định khi bảo quản.

6.2.2  Chuẩn bị các mẫu thu hồi và mẫu kiểm soát

Chuẩn bị ít nhất hai mẫu nền kiểm soát và một mẫu nền bổ sung ở nồng độ giới hạn dư lượng tối đa (MRL) hoặc nồng độ được yêu cầu khác trong ngày phân tích. Dịch lỏng của mẫu kiểm soát này được sử dụng để chuẩn bị chất chuẩn thích hợp với nền mẫu. Tiến hành chiết mẫu thu hồi và mẫu kiểm soát như đối với mẫu thử nêu trong 6.2.3 hoặc 6.2.4.

6.2.3  Chiết mẫu thịt, gan, thận

6.2.3.1  Cân chính xác 5,0 g ± 0,5 g phần mẫu thử đã xay nhỏ lấy từ mẫu đông lạnh hoặc mẫu đã được rã đông một phần, cho vào ống ly tâm 50 ml (4.12).

...

...

...

6.2.3.3  Thêm vào các mẫu thu hồi một lượng dung dịch chuẩn thích hợp và để yên trong 15 min đến 20 min trước khi tiến hành. Các mẫu được giữ lạnh trong suốt quá trình này.

Đối với các mẫu đã biết là nhiễm ractopamin hoặc các mẫu chưa biết rõ thì không được phép rã đông.

6.2.3.4  Thêm 20 ml ± 1 ml metanol (3.2) vào mẫu và trộn khoảng 1 min bằng máy trộn vortex (4.11).

6.2.3.5  Ly tâm mẫu ở gia tốc khoảng 2025 g trong 10 min đến 15 min.

6.2.3.6  Gạn dịch nổi phía trên vào ống ly tâm 50 ml (4.12) hoặc vào ống đong hỗn hợp chia vạch (4.3).

6.2.3.7  Thêm lần thứ hai 20 ml metanol (3.2) vào phần mẫu còn lại. Khuấy mạnh bằng thìa (4.7), ly tâm ở gia tốc khoảng 2025 g trong 10 min đến 15 min và thêm phần dịch nổi thứ hai vào phần dịch nổi đầu tiên (6.2.3.6).

6.2.3.8  Thêm tiếp 10 ml metanol vào phần mẫu còn lại. Khuấy mạnh bằng thìa (4.7), ly tâm ở gia tốc khoảng 2025 g trong 10 min đến 15 min và thêm phần dịch nổi thứ ba vào hai phần dịch nổi trước.

6.2.3.9  Thêm metanol (3.2) vào phần dịch nổi được gộp ở trên đến 50 ml.

LƯU Ý: Tất cả các mẫu phải được chỉnh đến thể tích cuối cùng như nhau, bằng 50 ml hoặc thể tích lớn hơn nếu tất cả mẫu vượt quá thể tích này.

...

...

...

6.2.3.11  Nếu phân tích ractopamin gốc thì tiến hành theo 6.4. Nếu phân tích ractopamin tổng số thì tiến hành theo 6.3.

6.2.4  Chiết mẫu mỡ

6.2.4.1  Quy trình chiết thực hiện theo 6.2.3.1 đến 6.2.3.8 nhưng dùng trietylamin 0,2 % trong metanol (3.16) làm dung dịch chiết.

6.2.4.2  Thêm 1,0 ml axit axetic băng (3.7) vào dịch chiết đã gộp và thêm metanol (3.2) đến 50 ml. Vặn nắp và trộn kỹ. Ghi lại thể tích.

6.2.4.3  Nếu phân tích ractopamin gốc thì tiến hành theo 6.4. Nếu phân tích ractopamin tổng số thì tiến hành theo 6.3.

6.3  Thủy phân bằng enzym

6.3.1  Chuyển 5 ml dịch chiết đã được gộp (xem 6.2.3 hoặc 3.2.4) vào ống nghiệm đã silan hóa (6.1) và làm bay hơi đến khô ở 50 ^oC.

6.3.2  Hòa tan mẫu trong 1 ml dung dịch đệm natri axetat (3.17).

6.3.3  Thêm 20 μl dung dịch β-glucuronidase (3.12) và trộn kỹ.

...

...

...

6.3.5  Thêm 2 ml metanol (3.2) và trộn kỹ.

6.3.6  Ly tâm ở gia tốc khoảng 2025 g trong 5 min.

6.3.7  Tiến hành theo 6.4.

6.4  Chiết pha rắn chế độ trao đổi cation hỗn hợp (SPE MCX)

6.4.1  Gắn cột SPE MCX (60 mg) (4.17) vào bộ phân phối chân không (4.14) và làm ướt bằng 2 ml metanol (3.2), để dung môi ráo đến bề mặt cột.

6.4.2  Cho 2 ml dịch chiết đã phối trộn từ 6.2.3 hoặc 6.2.4 (nếu phân tích ractopamin gốc) hoặc toàn bộ dung dịch đã thủy phân từ 6.3 (nếu phân tích ractopamin tổng số) qua ống, loại bỏ nước thải.

6.4.3  Rửa cột bằng 2 ml metanol (3.2).

6.4.4  Rửa giải cột bằng 2,5 ml dung dịch amoni hydroxit 5 % trong metanol (3.18) vào ống nghiệm đã silan hóa (6.1).

6.4.5  Làm bay hơi đến khô, dùng dòng không khí hoặc nitơ, sử dụng nồi cách thủy hoặc máy làm khô bằng nitơ (4.15) cài đặt ở 50 ^oC.

...

...

...

6.4.7  Hòa tan các mẫu kiểm soát thích hợp với nền mẫu bằng 1,0 ml từng dung dịch để dựng đường chuẩn (3.26 hoặc 3.27) và chuyển vào lọ nhỏ để phân tích bằng LC-MS/MS.

6.5  Phân tích LC-MS/MS

6.5.1  Điều kiện vận hành LC-MS/MS

Các điều kiện vận hành sau đây được cho là thích hợp. Các điều kiện này có thể được sửa đổi để thu được sắc ký yêu cầu.

- Cột:

4.20;

- Nhiệt độ cột:

20 ^oC;

- Pha động A:

...

...

...

- Pha động B:

3.21;

- Tốc độ dòng:

0,5 ml/min;

- Chương trình gradient:

xem Bảng 1;

-Thể tích bơm:

10 μl;

- Bộ bơm mẫu:

...

...

...

- Nhiệt độ bơm mẫu tự động:

Nhiệt độ phòng;

- Thời gian chạy:

6,5 min;

- Thiết bị LC-MS/MS:

4,18;

- Chế độ vận hành:

ion dương, kiểm soát đa phản ứng (MRM);

Xác định:

...

...

...

Khẳng định:

302,1 >284,2; 302,1 >121,2;

Nội chuẩn:

308,2 > 168,1;

Các thông số cụ thể đối với các hợp chất, xem Bảng 2. Các thông số của thiết bị, xem Bảng 3.

Bảng 1 - Chương trình gradient

Bước

Tổng thời gian

Pha động A

...

...

...

min

%

%

1

0,00

70,0

30,0

2

0,50

...

...

...

30,0

3

3,50

0,0

100,0

4

4,00

0,0

100,0

...

...

...

4,10

70,0

30,0

6

6,50

70,0

30,0

Bảng 2 - Các thông số cụ thể đối với các hợp chất^a

...

...

...

Khối lượng Q1, amu

Khối lượng Q3, amu

CE

CxP

Ractopamin

302,1

164,1

25

10

...

...

...

302,1

284,2

23

20

Ractopamin

302,1

121,2

40

8

...

...

...

308,2

168,1

25

10

Bảng 3 - Các thông số của thiết bị (đối với API4000 và API5000)^a

Thông số thiết bị

Giá trị các thông số

Nguồn ion

...

...

...

Độ phân giải (Q1 và Q3)

Đơn vị tùy chọn

Khí 1 (GS1)

30

Khí 2 (GS2)

40

Khí chắn (CUR)

20

Điện áp phun ion (IS)

...

...

...

Nhiệt độ (TEM)

500

Va chạm hoạt hóa phân ly (CAD)

8,00

Điện thế bắn phá (DP)

50

Điện thế đầu vào (EP)

9,00

Thời gian ngưng, miligiây (ms)

...

...

...

^a Tối ưu hóa các thông số đối với hệ thống được sử dụng.

6.5.2  Tiến hành phân tích

Pha động dùng để cùng rửa giải các đồng phân phi đối hình (diastereomer) của ractopamin như một pic sắc ký. Có thể thay đổi các thông số của thiết bị hoặc thành phần pha động khi đồng phân phi đối hình của ractopamin không bị phân tách trong sắc ký đồ và tỷ lệ số đếm vượt quá các tiêu chí được xác định để chấp nhận dữ liệu.

Nên sử dụng van chuyển đổi để giảm thiểu nguồn nhiễm bẩn và tránh làm hao hụt đáp ứng tuyệt đối khi bơm nhiều dịch chiết. Van này có thể được cài đặt chương trình chuyển đổi dòng pha động để thải trước khi rửa giải ractopamin nhằm giảm thiểu lượng nền mẫu được bơm vào nguồn. Thiết bị có thể tối ưu hóa lại trước mỗi mẻ nếu độ nhạy tuyệt đối bị giảm vì nhiễm bẩn tại nguồn.

6.5.2.1  Cân bằng hệ thống với pha động ở tốc độ dòng 0,10 ml/min để đảm bảo thời gian lưu ổn định trước khi tương tác với nguồn ion hóa phun điện tử (ESI).

6.5.2.2  Kết nối hệ thống HPLC với nguồn ESI và cài đặt tốc độ dòng pha động vào nguồn ở 0,5 ml/min.

6.5.2.3  Cân bằng hệ thống với 10 lần bơm dung dịch chuẩn thích hợp với nền mẫu hoặc mẫu trước khi bắt đầu phân tích. Việc này phải được thực hiện với dung dịch nền mẫu đại diện cho mẫu được phân tích.

6.5.2.4  Tiến hành bơm hai lần dung dịch chuẩn thích hợp với nền mẫu ở nồng độ thấp nhất sau đó bơm một lần dung dịch chuẩn thích hợp với nền mẫu ở nồng độ cao nhất và quan sát pic ractopamin có mặt ở thời gian lưu dự kiến đối với các ion ở m/z 302,1; m/z 164,1; m/z 284,2 và m/z 121,2. Dải khuyến cáo cho thể tích bơm là từ 8 μl đến 12 μl.

...

...

...

6.5.2.6  Bơm riêng dung dịch chuẩn thích hợp với nền mẫu, bơm riêng từng dịch chiết mẫu và sau đó lại bơm riêng dung dịch chuẩn thích hợp với nền mẫu.

6.6  Dựng đường chuẩn

Đo diện tích pic đối với ratopamin và chất nội chuẩn (ractopamin d₆) của dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Dựng đường chuẩn tuyến tính (1/x) dùng tỷ số ion xác định của đáp ứng chuẩn (tỷ lệ 302,1 > 164,1 và 308,2 >168,1) (đường chuẩn của diện tích ractopamin hoặc diện tích chất nội chuẩn theo nồng độ]. Từ đường chuẩn, tính nồng độ của từng dung dịch chiết, biểu thị bằng nanogam trên mililít (ng/ml).

Nếu diện tích pic ratopamin của mẫu phân tích vượt quá giá trị cao nhất của đường chuẩn thích hợp với nền mẫu được chuẩn bị bằng cách thêm 1,0 ml dung dịch chuẩn vào dịch chiết cuối cùng của nền mẫu kiểm soát, thì dịch chiết mẫu ban đầu (từ 6.2.3 hoặc 6.2.4) phải được pha loãng 5 lần (hoặc độ pha loãng thích hợp khác) bằng dịch chiết từ nền mẫu kiểm soát sau đó được thủy phân và/hoặc chiết pha rắn (phụ thuộc vào mẫu cần xác định dư lượng ratopamin tổng số hoặc ractopamin gốc) và bơm lại cùng với đường chuẩn.

7  Tính kết quả

Nồng độ ractopamin trong mẫu thử, X, biểu thị bằng nanogam trên gam (ng/g), được tính theo Công thức sau:

Trong đó:

A là nồng độ dịch chiết mẫu xác định được từ đường chuẩn (xem 6.6), tính bằng nanogam trên mililít (ng/ml);

...

...

...

C là thể tích dịch chiết, tính bằng mililít (ml);

D là khối lượng của mẫu, tính bằng gam (g);

E là hệ số pha loãng, tính bằng mililít trên mililít (ml/ml) (xem 6.6).

8  Khẳng định

Khẳng định việc nhận biết đã được thực hiện bằng cách so sánh ion sản phẩm đo được trong mẫu với ion sản phẩm trong chất chuẩn về khối lượng và cường độ tương đối.

Thu lấy sắc đồ riêng đối với các mảnh m/z 302,1 đến m/z 164,1; m/z 302,1 đến m/z 284,2 và m/z 302,1 đến m/z 121,2 đối với mỗi lần bơm và đảm bảo rằng thời gian lưu ractopamin trong mẫu tương ứng với thời gian lưu của ractopamin trong chất chuẩn chỉ chênh lệch ±5 %. Các dịch chiết có thể được bơm lại nếu có dao động về thời gian lưu trong quá trình phân tích mẻ vượt quá sai số cho phép 5 %.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

...

...

...

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được;

f) nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 - Các kết quả thử nghiệm trên bò

Mức bổ sung, ng/g

...

...

...

Số lần lặp lại

Thử nghiệm nội bộ

Thử nghiệm liên phòng

Độ chệch

Giá trị HorRat

Giá trị trung bình,

ng/g

Độ lệch chuẩn lặp lại,

s_r

...

...

...

RSD, %

Giá trị trung bình,

ng/g

Độ lệch chuẩn tái lập,

s_r

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập

RSD, %

Gan (ractopamin tổng số)

0,5

...

...

...

6

0,411

0,0252

6,15

0,389

0,0484

12,4

-0,111

0,50

...

...

...

2

6

0,378

0,0647

17,1

...

...

...

3

6

0,377

0,0475

12,6

...

...

...

1,0

1

6

0,816

0,0536

6,57

0,850

0,0768

...

...

...

-0,150

0,40

2

6

0,855

0,0658

7,69

...

...

...

3

6

0,880

0,102

11,6

...

...

...

2,0

1

6

1,62

0,0789

...

...

...

1,78

0,209

11,7

-0,218

0,58

2

6

1,77

...

...

...

12,2

3

6

...

...

...

0,180

9,22

Gan (ractopamin gốc)

20

...

...

...

6

19,3

1,18

6,13

18,2

1,16

6,35

-1,76

0,44

...

...

...

2

6

17,3

0,80

4,62

...

...

...

3

6

18,2

0,450

2,48

...

...

...

40

1

6

37,2

1,59

4,29

36,2

1,56

...

...

...

-3,76

0,33

2

6

34,6

0,662

1,91

...

...

...

3

6

36,9

0,695

1,88

...

...

...

80

1

6

71,9

2,82

...

...

...

70,7

4,28

6,05

-9,31

0,52

2

6

65,6

...

...

...

2,69

3

6

...

...

...

0,637

0,854

Thận (ractopamin tổng số)

0,5

...

...

...

6

0,408

0,0340

8,32

0,402

0,0522

13,0

-0,098

0,52

...

...

...

2

6

0,441

0,0452

10,3

...

...

...

3

5^a

0,347

0,0281

8,09

...

...

...

1,0

1

6

0,814

0,0685

8,42

0,816

0,0778

...

...

...

-0,184

0,42

2

6

0,881

0,0522

5,92

...

...

...

3

6

0,754

0,0583

7,74

...

...

...

2,0

1

6

1,57

0,139

...

...

...

1,63

0,168

10,3

-0,368

0,50

2

6

1,81

...

...

...

5,90

3

6

...

...

...

0,0993

6,51

Thận (ractopamin gốc)

45

...

...

...

6

39,3

1,91

4,87

41,3

2,34

5,66

-3,69

0,44

...

...

...

2

6

40,9

1,60

3,92

...

...

...

3

5^a

43,7

0,547

1,25

...

...

...

90

1

6

79,4

1,48

1,86

80,9

1,97

...

...

...

-9,11

0,21

2

6

81,2

1,35

1,67

...

...

...

3

6

82,1

2,17

2,65

...

...

...

180

1

6

151

5,28

...

...

...

161

8,72

5,40

-18,6

0,52

2

6

163

...

...

...

1,49

3

6

...

...

...

2,34

1,37

Thịt (ractopamin tổng số)

0,5

...

...

...

6

0,441

0,0313

7,09

0,411

0,0543

13,2

-0,0887

0,53

...

...

...

2

6

0,438

0,0519

11,9

...

...

...

3

5^a

0,355

0,0259

7,30

...

...

...

1,0

1

6

0,854

0,0586

6,86

0,815

0,0957

...

...

...

-0,185

0,52

2

6

0,862

0,0919

10,7

...

...

...

3

6

0,73

0,0785

10,8

...

...

...

2,0

1

6

1,68

0,102

...

...

...

1,73

0,177

10,2

-0,272

0,50

2

6

1,93

...

...

...

4,81

3

6

...

...

...

0,108

6,85

Thịt (ractopamin gốc)

5

...

...

...

6

3,78

0,259

6,86

3,85

0,247

6,42

-1,15

0,36

...

...

...

2

6

3,78

0,259

6,86

...

...

...

3

6

4,00

0,188

4,71

...

...

...

10

1

6

7,44

0,431

5,79

7,95

0,881

...

...

...

-2,05

0,69

2

6

7,44

0,431

7,28

...

...

...

3

6

8,96

0,652

5,14

...

...

...

20

1

6

15,2

0,779

...

...

...

15,8

1,23

7,80

-4,18

0,54

2

6

15,2

...

...

...

5,14

3

6

...

...

...

0,935

5,46

Mỡ (ractopamin tổng số)

0,5

...

...

...

6

0,384

0,0295

7,68

0,405

0,0308

7,62

-0,0954

0,30

...

...

...

2

6

0,404

0,0133

3,30

...

...

...

3

6

0,426

0,0333

7,82

...

...

...

1,0

1

6

0,880

0,0324

3,68

0,897

0,867

...

...

...

-1,103

0,43

2

6

0,944

0,0932

9,88

...

...

...

3

6

0,866

0,108

12,5

...

...

...

2,0

1

6

1,98

0,147

...

...

...

1,90

0,158

8,28

-0,0972

0,41

2

6

1,19

...

...

...

7,37

3

6

...

...

...

0,169

9,25

Mỡ (ractopamin gốc)

5

...

...

...

6

4,25

0,252

5,92

4,10

0,239

5,83

-0,898

0,33

...

...

...

2

6

4,05

0,127

3,15

...

...

...

3

6

4,01

0,276

6,88

...

...

...

10

1

6

8,98

0,486

5,41

8,73

0,505

...

...

...

-1,27

0,36

2

6

8,92

0,447

5,02

...

...

...

3

6

8,30

0,304

3,66

...

...

...

20

1

6

18,7

0,959

...

...

...

18,3

1,20

6,58

-1,71

0,46

2

6

18,9

...

...

...

7,07

3

6

...

...

...

0,565

3,27

^a^) Giá trị ngoại lệ được loại bỏ.

...

...

...

Mức bổ sung, ng/g

Số thứ tự phòng thử nghiệm

Số lần lặp lại

Thử nghiệm nội bộ

Thử nghiệm liên phòng

Độ chệch

Giá trị HorRat

Giá trị trung bình,

ng/g

...

...

...

s_r

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

RSD, %

Giá trị trung bình,

ng/g

Độ lệch chuẩn tái lập,

s_r

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập

RSD, %

...

...

...

0,5

1

6

0,421

0,0414

9,86

0,405

0,031

7,62

...

...

...

0,40

2

6

0,427

00145

3,39

...

...

...

3

6

0,361

0,0235

6,53

...

...

...

1,0

1

6

0,793

0,0326

4,12

...

...

...

0,0752

9,22

-0,185

0,41

2

6

0,874

0,0857

...

...

...

3

5^a

0,771

...

...

...

7,97

2,0

1

6

...

...

...

0,106

6,32

1,77

0,128

7,26

-233

0,36

2

...

...

...

1,88

0,0623

3,31

...

...

...

6

1,75

0,120

6,85

...

...

...

225

1

6

208

7,39

3,55

207

6,82

3,30

...

...

...

0,33

2

6

204

8,63

4,23

...

...

...

3

6

208

4,23

2,04

...

...

...

450

1

6

423

20,7

5,01

...

...

...

19,0

4,64

-40,1

0,51

2

6

402

18,6

...

...

...

3

6

415

...

...

...

4,37

900

1

6

...

...

...

7,21

0,885

798

29,0

3,64

-102

0,54

2

...

...

...

776

31,0

4,00

...

...

...

6

805

29,1

3,62

...

...

...

0,5

1

6

0,404

0,0185

4,58

0,413

0,0402

9,73

...

...

...

0,39

2

6

0,458

0,0240

5,23

...

...

...

3

6

0,378

0,0243

6,43

...

...

...

1,0

1

6

0,836

0,0600

7,18

...

...

...

0,0493

5,80

-0,150

0,26

2

6

0,891

0,0287

...

...

...

3

6

0,822

...

...

...

3,06

2,0

1

6

...

...

...

0,0400

2,25

1,77

0,0881

4,97

-0,0277

0,24

2

...

...

...

1,73

0,0876

5,08

...

...

...

6

1,82

0,110

6,08

...

...

...

50

1

6

41,2

1,82

4,40

44,4

3,39

7,64

...

...

...

0,61

2

6

43,9

1,14

2,59

...

...

...

3

6

48,2

2,37

4,93

...

...

...

100

1

6

82,6

2,29

2,77

...

...

...

6,64

7,36

-9,69

0,65

2

6

92,1

2,76

...

...

...

3

6

96,2

...

...

...

4,78

200

1

6

...

...

...

4,62

2,80

181

14

7,78

-19,4

0,76

2

...

...

...

189

12,0

6,38

...

...

...

6

188

7,71

4,09

...

...

...

Bảng A.3 - Các kết quả thử nghiệm trên lợn

Mức bổ sung, ng/g

Số thứ tự phòng thử nghiệm

Số lần lặp lại

Thử nghiệm nội bộ

Thử nghiệm liên phòng

Độ chệch

Giá trị HorRat

...

...

...

ng/g

Độ lệch chuẩn lặp lại,

s_r

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

RSD, %

Giá trị trung bình,

ng/g

Độ lệch chuẩn tái lập,

s_r

...

...

...

RSD, %

Thịt (ractopamin tổng số)

50

1

6

41,2

1,82

4,40

44,4

...

...

...

7,64

-5,57

0,61

2

6

43,9

1,14

2,59

...

...

...

3

6

48,2

2,37

...

...

...

100

1

6

82,6

...

...

...

2,77

90,3

6,64

7,36

-9,69

0,65

2

6

...

...

...

2,76

2,99

3

...

...

...

96,2

4,60

4,78

200

...

...

...

6

165

4,62

2,80

181

14

7,78

-19,4

0,76

...

...

...

2

6

189

12,0

6,38

...

...

...

3

6

188

7,71

4,09

...

...

...

Gan (ractopamin tổng số)

0,5

1

6

0,393

0,0536

13,6

0,400

...

...

...

15,0

-0,100

0,60

2

6

0,452

0,0345

7,64

...

...

...

3

6

0,348

0,0146

...

...

...

1,0

1

6

0,848

...

...

...

14,3

0,801

0,0875

10,9

-0,199

0,48

2

6

...

...

...

0,0433

5,47

3

...

...

...

0,765

0,0722

9,45

2,0

...

...

...

6

1,54

0,143

9,30

1,62

0,121

7,48

-0,382

0,37

...

...

...

2

6

1,69

0,0965

5,17

...

...

...

3

6

1,32

0,0816

5,03

...

...

...

Gan (ractopamin gốc)

20

1

6

19,0

0,456

2,40

18,0

...

...

...

6,62

-2,04

0,46

2

6

18,0

0,717

3,98

...

...

...

3

6

16,9

1,16

...

...

...

40

1

6

37,6

...

...

...

1,50

36,7

1,42

3,85

-3,26

0,30

2

6

...

...

...

1,65

4,64

3

...

...

...

37,1

0,939

2,53

80

...

...

...

6

66,6

2,30

3,45

69,8

3,88

5,55

-10,2

0,47

...

...

...

2

6

70,6

3,93

5,57

...

...

...

3

6

72,3

3,12

4,32

...

...

...

Thận (ractopamin tổng số)

0,5

1

6

0,399

0,0270

6,77

0,385

...

...

...

14,2

-0,115

0,56

2

6

0,385

0,0793

20,6

...

...

...

3

6

0,372

0,0520

...

...

...

1,0

1

6

0,706

...

...

...

12,7

0,729

0,0886

12,2

-0,271

0,54

2

6

...

...

...

0,0879

11,8

3

...

...

...

0,735

0,0991

13,5

2,0

...

...

...

6

1,46

0,173

11,9

1,56

0,166

10,6

-0,439

0,52

...

...

...

2

6

1,59

0,124

7,81

...

...

...

3

6

1,63

0,165

10,1

...

...

...

Thận (ractopamin gốc)

45

1

6

41,4

2,37

5,73

41,1

...

...

...

5,95

-3,59

0,47

2

6

42,5

2,19

5,14

...

...

...

3

6

40,3

2,71

...

...

...

90

1

6

77,4

...

...

...

5,59

79,8

6,46

8,09

-10,2

0,70

2

6

...

...

...

5,29

6,26

3

...

...

...

77,6

7,47

9,63

180

...

...

...

6

142

10,9

7,68

150

12,1

8,09

-30,1

0,78

...

...

...

2

6

152

13,3

8,76

...

...

...

3

6

156

8,55

5,47

...

...

...

Thịt (ractopamin tổng số)

0,5

1

6

0,398

0,0281

7,08

0,413

...

...

...

8,97

-0,0869

0,36

2

6

0,408

0,0456

11,2

...

...

...

3

6

0,433

0,0315

...

...

...

1,0

1

6

0,814

...

...

...

7,21

0,825

0,087

10,5

-0,176

0,47

2

6

...

...

...

0,0776

9,57

3

...

...

...

0,849

0,123

14,5

2,0

...

...

...

6

1,62

0,0903

5,58

1,77

0,180

10,1

-0,227

0,50

...

...

...

2

6

1,96

0,0878

4,49

...

...

...

3

6

1,75

0,158

9,05

...

...

...

Thịt (ractopamin gốc)

5

1

6

4,74

0,240

5,08

4,42

...

...

...

10,9

-0,580

0,61

2

6

4,17

0,645

15,5

...

...

...

3

6

4,36

0,336

...

...

...

10

1

6

9,90

...

...

...

5,55

9,21

0,700

7,60

9,21

0,48

2

6

...

...

...

0,428

4,89

3

...

...

...

8,98

0,523

5,82

20

...

...

...

6

19,1

1,92

10,1

18,4

1,42

7,74

-1,59

0,54

...

...

...

2

6

17,9

0,717

4,00

...

...

...

3

6

18,3

1,38

7,55

...

...

...

Mỡ (ractopamin tổng số)

0,5

1

6

0,38

0,0201

5,28

0,397

...

...

...

13,3

-0,103

0,53

2

6

0,446

0,0425

9,53

...

...

...

3

6

0,365

0,0524

...

...

...

1,0

1

6

0,875

...

...

...

4,21

0,896

0,111

12,4

-0,104

0,55

2

6

...

...

...

0,133

13,8

3

...

...

...

0,853

0,123

14,4

2,0

...

...

...

6

1,86

0,0717

3,85

1,86

0,171

9,17

-0,136

0,45

...

...

...

2

6

1,94

0,230

11,8

...

...

...

3

6

1,79

0,164

9,19

...

...

...

Mỡ (ractopamin gốc)

5

1

6

4,91

0,333

6,79

4,63

...

...

...

8,11

-0,369

0,46

2

6

4,20

0,112

2,66

...

...

...

3

6

4,78

0,126

...

...

...

10

1

6

10,5

...

...

...

4,24

9,73

0,814

8,37

-0,273

0,52

2

6

...

...

...

0,175

2,01

3

...

...

...

10,0

0,226

2,25

20

...

...

...

6

21,5

0,852

3,97

20,0

1,61

8,05

-0,0389

0,56

...

...

...

2

6

18,1

0,25

1,39

...

...

...

3

6

20,4

0,887

4,36

...

...

...

1) Sản phẩm của Gelest, Inc., Morrisville, PA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

2) Sản phẩm của Zymark, Hopkinton, MA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

3) Sản phẩm của Waters, Milford, MA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

4) Các sản phầm của Applied Biosystem, CA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

5) Sản phẩm của Agilent Technologies, Inc., CA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.