Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11838:2017 về Thịt - dư lượng sulfonamid bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần

• Số hiệu: TCVN11838:2017
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2017

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11838:2017

THỊT - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG SULFONAMID BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN

Meat - Determination of sulfonamid residues by liquid chromatography tanderm mass spectrometry

Lời nói đầu

TCVN 11838:2017 do Trung tâm Kiểm tra vệ sinh Thú y Trung ương I - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỊT - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG SULFONAMID BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN

...

...

...

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng sulfonamid gồm 13 chất: Sulfadiazine (SDZ), sulfapyridine (SP), sulfamerazine (SMR), sulfamethazine (SMZ), sulfatroxazole (STX), sulfamethoxazole (SMX), sulfadimethoxine (SD), sulfachloropyridazine (SCR), sulfamonomethoxine (SMM), sulfathiazole (STZ), sulfaquinoxaline (SQ), sulfabendazine (SBZ), sulfadoxine (SBX) có trong thịt tươi và thịt đông lạnh bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần.

Giới hạn định lượng của phương pháp là 25 μg/kg.

2  Nguyên tắc

Dư lượng sulfonamid trong thịt được chiết ra bằng axetonitril, loại chất béo bằng n-hexan, làm sạch bằng chiết lỏng- lỏng. Xác định và định lượng sulfonamid bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần.

3  Thuốc thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích.

3.1  Natri sulphat (Na₂SO₄).

...

...

...

3.3  n-hexan.

3.4  Nước, loại dùng cho LC/MS.

3.5  Axetonitril, loại dùng cho LC/MS.

3.6  Axetonitril, loại dùng cho HPLC.

3.7  Metanol, loại dùng cho HPLC.

3.8  Khí N₂, độ tinh khiết 99,9 %.

3.9  Axít formic.

3.10  Dung dịch n-hexan bão hòa axetonitril

Cho axetonitril (3.6) và n-hexan (3.3) theo tỷ lệ (1:4) vào phễu chiết (4.17) lắc cho đến khi bão hòa, loại bỏ lớp dưới. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 6 tháng.

...

...

...

Pha 30 ml dung dịch axetonitril (3.5) với 70 ml nước (3.4) vào lọ thủy tinh (4.18). Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 1 tuần.

3.12  Chất chuẩn sulfadiazine (SDZ), độ tinh khiết 99,0 %.

3.13  Chất chuẩn sulfapyridine (SP), độ tinh khiết 99,0 %.

3.14  Chất chuẩn sulfamerazine (SMR), độ tinh khiết 99,2 %.

3.15  Chất chuẩn sulfamethazine (SMZ), độ tinh khiết 99,6 %.

3.16  Chất chuẩn sulfatroxazole (STX), độ tinh khiết 98,0 %.

3.17  Chất chuẩn sulfamethoxazole (SMX), độ tinh khiết 99,0 %.

3.18  Chất chuẩn sulfadimethoxine (SD), độ tinh khiết 99,0 %.

3.19  Chất chuẩn sulfachloropyridazine (SCR), độ tinh khiết 99,0 %.

...

...

...

3.21  Chất chuẩn sulfathiazole (STZ), độ tinh khiết 99,5 %.

3.22  Chất chuẩn sulfaquinoxaline (SQ), độ tinh khiết 98,0 %.

3.23  Chất chuẩn sulfabendazine (SBZ), độ tinh khiết 98,0 %.

3.24  Chất chuẩn sulfadoxine (SDX), độ tinh khiết 99,0 %.

3.25  Chất nội chuẩn sulfadiazine d4, độ tinh khiết 98,4 %.

3.26  Chất nội chuẩn sulfamethazine d4, độ tinh khiết 99,0 %.

3.27  Dung dịch chuẩn gốc SDZ, SP, SMR, SMZ, STX, SMX, SD, SCR, SMM, STZ, SQ, SBZ, SDX, nồng độ 1000 μg/ml trong metanol

Cân 50 mg ± 0,1 mg mỗi loại vào các bình định mức dung tích 50 ml riêng biệt (4.13). Hòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (3.7) để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg/ml. Dung dịch này được bảo quản ở âm 20 °C trong 6 tháng.

CHÚ THÍCH: Lượng cân trên phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 μg/ml sau khi đã tính toán và hiệu chỉnh khối lượng theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất.

...

...

...

Lấy 100 μl từ mỗi dung dịch gốc SDZ, SP, SMR, SMZ, STX, SMX, SD, SCR, SMM, STZ, SQ, SBZ, SDX (3.27) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với metanol (3.7). Dung dịch này được bảo quản ở âm 20 °C trong 1 tháng.

3.29  Dung dịch chuẩn trung gian (S2) SDZ, SP, SMR, SMZ, STX, SMX, SD, SCR, SMM, STZ, SQ, SBZ, SDX, 1μg/ml trong metanol

Lấy 1 ml từ dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian S1 (3.28) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với metanol (3.7). Dung dịch này được bảo quản ở âm 20 °C trong 1 tuần.

3.30  Dung dịch nội chuẩn gốc SDZ d₄, SMZ d₄, nồng độ 1000 μg/ml trong metanol.

Cho 1ml metanol (3.7) vào từng lọ có chứa 1mg chất nội chuẩn thu được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg/ml. Dung dịch này được bảo quản ở âm 20 °C trong 6 tháng.

3.31  Dung dịch nội chuẩn hỗn hợp trung gian (IS1) SDZ d₄, SMZ d₄, 10 μg/ml trong metanol

Lấy 100 μl từ mỗi dung dịch nội chuẩn gốc SDZ d₄, SMZ d₄ (3.30) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với metanol (3.7). Dung dịch này được bảo quản ở âm 20 °C trong 1 tháng.

3.32  Dung dịch nội chuẩn hỗn hợp trung gian (IS2) SDZ d₄, SMZ d₄, 1 μg/ml trong metanol

Lấy 1ml dung dịch hỗn hợp nội chuẩn trung gian (3.31) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với metanol (3.7). Dung dịch này được bảo quản ở âm 20 °C trong 1 tuần.

...

...

...

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Hệ thống máy sắc ký lỏng phổ khối lượng 3 tứ cực LC-MS/MS

- Bơm 2 kênh dung môi gradient;

- Detector 3 tứ cực MS/MS;

- Máy tính và phần mềm phân tích;

- Cột sắc ký RP C18, đường kính trong 2,1 mm, chiều dài cột 150 mm, kích thước hạt 5 μm;

- Hệ thống bơm mẫu tự động.

4.2  Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,01 mg.

4.3  Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 r/min.

...

...

...

4.5  Tủ sấy, dải nhiệt độ đến 250 °C, sai số ± 0,1 °C.

4.6  Bộ cô quay chân không, có điều chỉnh nhiệt độ.

4.7  Máy đồng nhất mẫu.

4.8  Bể chiết siêu âm.

4.9  Máy xay thịt.

4.10  Tủ âm sâu, dải nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 30 °C.

4.11  Micropipet, dung tích 100 μl và 1000 μl.

4.12  Ống nghiệm thủy tinh, dung tích 8 ml.

4.13  Bình định mức, dung tích 10 ml và 50 ml.

...

...

...

4.15  Bình quả lê, dung tích 50 ml.

4.16  Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml.

4.17  Phễu chiết thủy tinh, 500 ml.

4.18  Lọ thủy tinh, dung tích 250 ml.

4.19  Màng lọc nylon, kích thước lỗ 0,2 μm đường kính 1,3 mm.

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Mẫu khi chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở âm 20 °C trong 6 tháng.

6  Chuẩn bị mẫu

...

...

...

Cắt thịt thành từng miếng nhỏ, nghiền mịn bằng máy xay thịt (4.9) để đồng nhất mẫu. Chuyển mẫu đã đồng nhất sang dụng cụ đựng mẫu. Khi thực hiện phân tích, phải đưa mẫu về nhiệt độ phòng.

Cân 2 g ± 0,01 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml (4.14). Cho vào 100 μl hỗn hợp nội chuẩn (3.32). Lắc đều bằng máy vortex (4.4) sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.

6.2  Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu thịt tươi không nhiễm sulfonamid. Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu thử. Trong một lô mẫu chuẩn bị tối thiểu một mẫu trắng.

6.3  Chuẩn bị mẫu kiểm soát

Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng có bổ sung 30 μl hỗn hợp chuẩn sulfonamid (3.29) và 100 μl hỗn hợp nội chuẩn (3.32) để thu được nồng độ chuẩn của mẫu kiểm soát là 150 ng/g và nồng độ nội chuẩn là 50 ng/g. Lắc cho đều bằng máy vortex (4.4) sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.

6.4  Chuẩn bị mẫu xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn được lập dựng trên mẫu trắng (6.2) được thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau.

Cho lần lượt các dung dịch chuẩn hỗn hợp sulfonamid (3.28), (3.29) và dung dịch nội chuẩn hỗn hợp sulfonamid (3.32) vào các ống ly tâm có chứa mẫu trắng theo Bảng 1, lắc 15 s bằng máy vortex (4.4), sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo như đối với mẫu thử.

...

...

...

STT

Nồng độ chuẩn trong mẫu (μg/kg)

Thể tích chuẩn (3.29) thêm vào (μl)

Thể tích chuẩn (3.28) thêm vào (μl)

Thể tích nội chuẩn (3.32) thêm vào (μl)

1

0

0

...

...

...

2

12,5

25

100

3

25

50

...

...

...

4

50

100

100

5

100

20

...

...

...

6

200

40

100

6.4.1  Tính hệ số tín hiệu

Tính cho chất cần phân tích theo công thức:

Trong đó:

RF: hệ số tín hiệu;

...

...

...

Sp: tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích;

Sp_IS: diện tích pic của ion thứ cấp của nội chuẩn.

6.4.2  Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu và chuẩn bị mẫu theo mục 6.4 Phương trình đường chuẩn có dạng có dạng: RF = ax + b. Trong đó:

RF

là hệ số tín hiệu, tính theo điều 6.4.1;

X

là nồng độ chất chuẩn, tính theo đơn vị μg/I;

...

...

...

là điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

a

là hệ số góc của đường chuẩn.

7  Cách tiến hành

7.1  Chiết mẫu và làm sạch mẫu

Thêm vào mẫu thử (6.1) 15 ml axetonitril (3.6), 10 ml n-hexan bão hòa axetonitril (3.10), 5 g Na₂SO₄(3.1).

Đồng hóa mẫu ở tốc độ chậm bằng máy đồng nhất mẫu (4.7);

Ly tâm mẫu ở 4000 r/min trong 5 min (4.3);

Hút hết lớp dưới vào bình quả lê (4.15);

...

...

...

Cho vào bể chiết siêu âm (4.8) trong 5 min;

Ly tâm mẫu ở 4000 r/min trong 5 min (4.3);

Hút dung dịch lớp dưới vào bình quả lê (4.15) đã hút lần 1;

Cho vào dịch chiết thu được 5 ml n-propanol (3.2);

Cô cạn bằng bộ cô quay chân không ở nhiệt độ 50 °C (4.6);

Hòa tan cặn bằng 2 ml dung dịch axetonitril: nước tỷ lệ 3:7 ( 3.11);

Lọc bằng màng lọc nylon (4.19), đưa dịch chiết vào lọ đựng mẫu 1,5 ml (4.16);

Tiến hành phân tích trên hệ thống LC-MS/MS (4.1).

7.2  Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS/MS

...

...

...

Chuẩn hóa các điều kiện của sắc ký lỏng như tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột và các điều kiện của đầu dò MS/MS như điện thế mao quản, điện thế đầu cone, năng lượng va chạm, tốc độ khí va chạm...để mỗi chất phân tích thu được tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con; không có píc nhiễu tại vị trí của píc phân tích.

7.2.2  Điều kiện trên LC

Nhiệt độ cột:

(40 ± 5) °C

Tốc độ dòng:

0,2 ml/min

Thể tích bơm mẫu:

5 μl

Thời gian phân tích:

...

...

...

Pha động:

Chạy theo chương trình gradient thể hiện theo Bảng 2

Bảng 2 - Điều kiện gradient cho hệ thống LC

Thời gian (min)

Kênh B

Nước + 0,01 % axít formic

Kênh A

Axetonitril + 0,01 % axít formic

0.0

...

...

...

3

1

97

3

20

3

97

21

3

...

...

...

22

97

3

25

97

3

7.2.3  Điều kiện trên MS:

Kiểu ion hóa:

ESI (+)

...

...

...

150 °C

Nhiệt độ hóa hơi dung môi:

400 °C

Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi:

600 l/h

Tốc độ dòng khí qua khối nón:

20 l/h

Áp suất khí va chạm:

Argon, p = 2,93x10^-^3 mbar

...

...

...

2,0 kV

Bảng 3 - Điều kiện phân mảnh MS/MS

STT

Kháng sinh

Thời gian lưu (min)

lon mẹ (m/z)

lon con (m/z)

Năng lượng va chạm CE (eV)

Năng lượng (Sample Cone) (V)

...

...

...

Sulfadiazine

6,8

250,9

91,9

24

22

155,9*

18

2

...

...

...

8,2

278,8

91,8*

30

28

155,8

20

3

Sulfaquinoxaline

...

...

...

300,8

91,8

32

28

155,8*

16

4

Sulfamerazine

7,6

...

...

...

91,8

24

26

155,8*

18

5

Sulfadimethoxine

10,9

310,8

...

...

...

30

30

155,8*

20

6

Sulfachloropyridazine

9,4

284,7

155,8*

...

...

...

22

91,8

28

7

Sulfabendazine

10,8

276,8

155,8*

14

...

...

...

91,8

28

8

Sulfatroxazole

10,0

267,8

155,8*

16

24

...

...

...

28

9

Sulfamethoxazole

9,9

253,8

155,8*

16

22

91,9

...

...

...

10

Sulfamonomethoxine

8,3

280,8

155,8*

18

26

91,8

26

...

...

...

Sulfathiazole

7,1

255,8

155,8*

14

22

91,8

26

12

...

...

...

7,3

249,8

155,8*

16

28

91,8

28

13

Sulfadoxine

...

...

...

310,7

155,8*

18

30

91,8

28

14

Sulfadiazine d₄

6,8

...

...

...

159,8

14

26

15

Sulfamethazine d₄

8,1

282,9

185,9

18

...

...

...

Ghi chú: ion ký hiệu ( * ) dùng để định lượng.

7.3  Trình tự bơm mẫu

- Bơm dung môi kiểm tra máy: axetonitril (3.5);

- Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;

- Bơm mẫu trắng;

- Bơm mẫu kiểm soát;

- Bơm mẫu thử;

8  Tính toán và biểu thị kết quả

8.1  Tính kết quả

...

...

...

Trong đó:

C   là hàm lượng chất phân tích có trong mẫu, tính bằng microgam trên kilogam (μg/kg);

C_x là nồng độ chất phân tích được suy ra từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên lit (μg/l);

V  là thể tích cuối cùng của mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

F  là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

m  là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

8.2  Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg/kg (ppb) đến hai số sau dấu phẩy.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;

- Kết quả thử nghiệm thu được.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Qui trình nội bộ VS1/QT/153/TD “Thịt - Xác định dư lượng Sulfonamid bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ”

...

...

...

[3] Optimized extraction and clean up protocols for LC-MS/MS Multi-residue determination of veterinary drugs in edible muscle tissues - Hãng waters.