TCVN-8710-32-2026-Benh-thuy-san-Quy-trinh-chan-doan-Phan-32-Benh-trang-duoi

• Số hiệu: TCVN8710-32:2026
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2026

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-32:2026

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN -
PHẦN 32: BỆNH TRẮNG ĐUÔI DO VI RÚT MACROBRACHIUM ROSENBERGII NODAVIRUS Ở TÔM CÀNG XANH

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - White tail disease by Macrobrachium rosenbergil nodavirus in Giant river prawn

Lời nói đầu

TCVN 8710-32:2026 do Trung tâm Chẩn đoán và Xét nghiệm thú y Trung ương I, Cục Chăn nuôi và Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:

- TCVN 8710-1:2011, Phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm;

- TCVN 8710-2:2019, Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển;

...

...

...

- TCVN 8710-4:2019, Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm;

- TCVN 8710-5:2023, Phần 5: Hội chứng taura ở tôm;

- TCVN 8710-6:2019, Phần 6: Bệnh do Koi herpes vi rút ở cá chép;

- TCVN 8710-7:2019, Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép;

- TCVN 8710-8:2023, Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

- TCVN 8710-9:2012, Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm;

- TCVN 8710-10:2015, Phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-11:2015, Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-12:2019, Phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm;

...

...

...

- TCVN 8710-14:2015, Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;

- TCVN 8710-15:2015, Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila ở cá;

- TCVN 8710-16:2016, Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

- TCVN 8710-17:2016, Phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

- TCVN 8710-19:2019, Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

- TCVN 8710-20:2019, Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

- TCVN 8710-21:2019, Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá;

- TCVN 8710-22:2022, Phần 22: Bệnh sán lá 16 móc ở cá;

- TCVN 8710-23:2022, Phần 23: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do IHNV ở cá hồi;

...

...

...

- TCVN 8710-25:2022, Phần 25: Bệnh do ký sinh trùng Bonamia ostreae và Bonamia exitiosa ở hàu;

- TCVN 8710-26:2023, Phần 26: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do EHNV ở cá;

- TCVN 8710-27:2023, Phần 27: Bệnh do vi rút Tilapia lake (TiLV) ở cá rô phi;

- TCVN 8710-28:2023, Phần 28: Bệnh do RSIV ở cá biển;

- TCVN 8710-29:2026, Phần 29: Bệnh do vi rút Herpes ở bào ngư;

- TCVN 8710-30:2026, Phần 30: Bệnh nhiễm trùng xuất huyết do vi rút Viral haemorrhagic septicaemia ở cá;

- TCVN 8710-31:2026, Phần 31: Bệnh tuyến tụy do vi rút Salmonid alphavirus ở cá hồi;

- TCVN 8710-32:2026, Phần 32: Bệnh trắng đuôi do vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus ở tôm càng xanh.

...

...

...

PHẦN 32: BỆNH TRẮNG ĐUÔI DO VI RÚT MACROBRACHIUM ROSENBERGII NODAVIRUS Ở TÔM CÀNG XANH

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure -

Part 32: White tail disease by Macrobrachium rosenbergii nodavirus in Giant river prawn

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh trắng đuôi do vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) ở tôm càng xanh.

2  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

2.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

...

...

...

Bệnh trắng đuôi do vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) ở tôm càng xanh (WTD) (White tail disease by Macrobrachium rosenbergii nodavirus in Giant river prawn)

Bệnh do vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) gây ra, thường kết hợp với một loại vi rút vệ tinh Extra small virus (XSV).

2.1.2

Vi rút gây bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh (WTD) (Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV))

MrNV thuộc họ Nodaviridae, có hình cầu đa diện không có vỏ bọc, có đường kính từ 26-27 nm, bao gồm hai chuỗi RNA đơn (ssRNA). Bộ gen của MrNV gồm hai phân tử là RNA1 và RNA2 có kích thước tương ứng là 2.9 và 1.3 kb

Vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) là tác nhân chính gây bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh. Vai trò của vi rút Extra Small Virus (XSV) trong khả năng gây bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh chưa rõ ràng.

2.2  Các từ viết tắt

- ADN (Deoxyribonucleic acid): Axit deoxyribonucleic;

- ARN (Ribonucleic acid): Axit Ribonucleic;

...

...

...

- FAM: 6-Carboxyfluorescein (một chất phát huỳnh quang dùng trong đoạn dò TaqMan);

- MAP (Magnetic Affinity Particles): Các hạt từ sử dụng trong bộ kít InviMAG^® Virus DNA/RNA để gắn chọn lọc acid nucleic trong quá trình tách chiết tự động;

- MrNV: Macrpbrachium rosenbergii nodavirus;

- PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phosphat;

- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược;

- Real-time RT-PCR (Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực;

- TAE (Tris-acetate-EDTA): Tris-axetat-axit etylendlamintetraaxetic;

- TBE (Tris-borate-EDTA): Tris-borat-axit etylendiamintetraaxetic;

- TE (Tris-EDTA): Tris-axit etylendiamintetraaxetic;

...

...

...

- XSV: Extra small virus.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Mồi và đoạn dò (primers/probe) real-time RT-PCR, gồm mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò

3.2  Mồi (primers) RT-PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.3  Kít nhân gen PCR

3.4  Kít nhân gen RT-PCR

3.5  Kít nhân gen real-time RT-PCR

3.6  Kít tách chiết ARN

...

...

...

3.8  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE (Cách chuẩn bị xem A.1 của Phụ lục A)

3.9  Chất nhuộm màu, ví dụ: sybr safe

3.10  Chất đệm tải mẫu (loading dye 6X)

3.11  Thang chuẩn ADN (ladder/ Marker)

3.12  Dung dịch đệm TE

3.13  Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.14  Ethanol, 70 %, 90% đến ethanol tuyệt đối

3.15  Dung dịch muối đệm phosphate (PBS) (Cách chuẩn bị xem A.2 của Phụ lục A).

4  Thiết bị, dụng cụ

...

...

...

4.1  Thiết bị

4.1.1  Tủ lạnh, Có thể duy trì ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C

4.1.2  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ âm 20 °C tới âm 80 °C

4.1.3  Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2

4.1.4  Máy nhân gen PCR

4.1.5  Máy real-time PCR

4.1.6  Máy tách chiết ARN/ADN

4.1.7  Máy ly tâm, có thể hoạt động với gia tốc 2 000 g đến 4 000 g và gia tốc 12 000 g

4.1.8  Máy nghiền mẫu

...

...

...

4.1.10  Máy lắc trộn Vortex

4.1.11  Máy đọc sản phẩm PCR

4.1.12  Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bề chạy điện di

4.1.13  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg

4.1.14  Cối, chày nghiền mẫu.

4.2  Dụng cụ

4.2.1  Pipet đơn kênh các loại

4.2.2  Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml

4.2.3  Dụng cụ chứa mẫu, kín, có nắp đậy, không rò rỉ, vô trùng

...

...

...

4.2.5  Khay đựng đá lạnh

4.2.6  Bộ khuôn và lược đổ thạch

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh do vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) được ghi nhận lần đầu tiên tại pháp vào năm 1997, sau đó xuất hiện tại một số quốc gia tại châu Á.

- Bệnh chủ yếu xảy ra ở tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii). Một số loài giáp xác khác có thể được coi là vật chủ trung gian mang mầm bệnh gồm: tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei), tôm he Nhật Bản (Penaeus japonicus), tôm he Ấn Độ (Penaeus indicus), tôm sú (Penaeus monodon) và Artemia sp.

- Bệnh có thể xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm, tuy nhiên thường gặp ở giai đoạn ấu trùng (larvae) và hậu ấu trùng (postlarvae).

- Phương thức truyền lây của bệnh bao gồm:

+ Lây theo chiều dọc: qua trứng từ tôm mẹ mang mầm bệnh;

...

...

...

- Tỷ lệ lưu hành của bệnh dao động từ 10 % đến 100 %, tùy thuộc điều kiện môi trường và biện pháp quản lý nuôi.

5.2  Triệu chứng và bệnh tích

- Tôm mắc bệnh thường lột xác bất thường, giảm khả năng bắt mồi và bơi lội.

- Ở tôm bị nhiễm bệnh, phần cơ đuôi và cơ bụng trở nên trắng đục do sự hoại tử mô cơ. Vùng đổi màu trắng thường xuất hiện đầu tiên ở đốt bụng thứ hai hoặc thứ ba, sau đó dần dần lan ra cả phía trước và phía sau cơ thể. Trường hợp nặng có thể xảy ra thoái hóa đuôi (telson) và phần phụ (uropods).

- Tôm ở giai đoạn hậu ấu trùng nhiễm MrNV có màu trắng sữa và đục hơn. Các mô bị tổn thương chủ yếu là cơ vân vùng bụng, đầu ngực và đuôi.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu

Thu mẫu tôm có dấu hiệu bệnh lý, còn sống hoặc mới chết. Mẫu bệnh phẩm được lấy và để riêng biệt trong dụng cụ chứa mẫu (4.2.3).

Số lượng tôm trên mỗi mẫu phụ thuộc vào kích cỡ của tôm:

...

...

...

- Tôm thương phẩm: Lấy nguyên con, từ 5 con/mẫu đến 10 con/mẫu hoặc lấy mang, cơ đầu, cơ bụng, chân bơi và cơ đuôi của 5 con/mẫu đến 10 con/mẫu.

- Tôm bố mẹ: Lấy nguyên con 1 con/mẫu hoặc lấy mang, chân bơi, cơ đuôi của 1 con/mẫu.

Tất cả các mẫu phải được dán nhãn, ghi kí hiệu và gửi kèm theo phiếu gửi mẫu bệnh phẩm và thông tin dịch tễ của mẫu.

6.2  Bảo quản mẫu

a) Bảo quản vận chuyển

Bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 48 h từ khi lấy mẫu đến khi vận chuyển về phòng thí nghiệm hoặc bảo quản trong ethanol 70 % đến ethanol 90 % với tỷ lệ mẫu : ethanol bằng 1:10.

b) Bảo quản tại phòng thí nghiệm

Mẫu được được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C chuyển đến phòng thí nghiệm chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc được bảo quản trong dung dịch PBS (3.15) theo tỷ lệ mẫu: PBS bằng 1:10 ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc bảo quản trong ethanol từ 70 %.

6.3  Chuẩn bị mẫu

...

...

...

Cho mẫu vào dung dịch PBS (3.15) theo tỷ lệ mẫu : PBS bằng 1:10, đồng nhất mẫu bằng máy nghiền mẫu (4.1.8) hoặc bằng cối, chày nghiền mẫu (4.1.14) để tạo thành huyễn dịch 10 %. Chuyển huyễn dịch vào 2 ống vô trùng, một ống mẫu để xét nghiệm và một ống lưu mẫu.

Với mẫu đã bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C cần rã đông từ từ ở 2 đến 8 °C hoặc nhiệt độ phòng trước khi thực hiện đồng nhất mẫu.

6.4  Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.6) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít tách chiết ARN: InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini KiV KF96, Cat. No: 7441050100 (xem B.1, phụ lục B) hoặc sử dụng kít tách chiết TACO RNA/DNA extraction Kit (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests (xem B.2, phụ lục B) hoặc PureLink Viral RNA/DNA mini kit (50) (Cat No: 12280-050) xem B.2, phụ lục B)[1]

6.5  Phương pháp real-time RT - PCR

6.5.1  Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy real-time PCR (4.1.5) theo phương pháp real-time RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút MrNV sử dụng cặp mồi MrNV4-F / MrNV4 -R và đoạn dò Taqman MrNV4-P (3.1), vi rút XSV sử dụng cặp mồi XSV4-F/ XSV4 8-R và đoạn dò Taqman XSV4 -P. Trình tự cặp mồi, đoạn dò được nêu trong Bảng dưới đây:

Bảng 1 - Trình tự cặp mồi, dò

...

...

...

KH mồi, mẫu dò

Trình tự mồi từ đầu 5' tới 3'

MrNV

MrNV4-F

CAACTCGGTATGGAACTCAAGGT

MrNV4 -R

AGGAAATACACGAGCAAGAAAAGTC

MrNV4-P

FAM-ACCCTTCGACCCCAGCAATGGTG -TAMRA

...

...

...

XSV4-F

AGCCACACTCTCGCATCTGA

XSV4 8-R

CTCCAGCAAAGTGCGATACG

XSV4-P

FAM- CATGCCCCATGATCCTCGCA- TAMRA

Mồi và đoạn dò được chuẩn bị như sau:

- Mồi và đoạn dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (4.1.7) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.12) để hoàn nguyên ở nồng độ 100 μM làm mồi gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 μM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.13) (20 μl mồi gốc và 80 μl nước tinh khiết không có nuclease).

...

...

...

6.5.2  Tiến hành phản ứng real-time RT-PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy real-time PCR (4.1.5) theo phương pháp real-time RT- PCR sử dụng cặp mồi MrNV4-F / MrNV4 -R đoạn dò MrNV4-P phát hiện vi rút MrNV, cặp mồi XSV4-F/ XSV4 8-R đoạn dò Taqman XSV4 -P phát hiện vi rút XSV. Sử dụng kít nhân gen real-time RT-PCR (3.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem Phụ lục C).

6.5.3  Đọc kết quả

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct).

- Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct = ± 2

Với điều kiện phản ứng như trên:

- Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính

- Mẫu không có giá trị Ct là âm tính

...

...

...

CHÚ THÍCH:

- Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

- Phản ứng real-time RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.6  Phương pháp RT- PCR, Nested RT- PCR và Multiplex RT-PCR

6.6.1  Chuẩn bị mồi

Phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu MrNV2-F/ MrNV2-R hoặc XSV2-F/XSV2-R (3.2) để phát hiện MrNV và XSV ở tôm postlarvae (PL) thu thập từ các ổ dịch nghi ngờ bị bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh.

Bảng 2 - Trình tự mồi phương pháp RT-PCR

Vi rút đích

...

...

...

Trình tự (5’-3’)

Kích thước sản phẩm

MrNV

MrNV2-F

GCG-TTA-TAG-ATG-GCA-CAA-GG

425 bp

MrNV2-R

AGC-TGT-GAA-ACT-TCC-ACT-GG

XSV

...

...

...

CGC-GGA-TCC-GAT-GAA-TAA-GCG-CAT-TAA-TAA

546 bp

XSV2-R

CCG-GAA-TTC-CGT-TAC-TGT-TCG-GAG-TCC-CAA

Phương pháp Nested RT- PCR sử dụng cặp mồi bước 1: MrNV2-F/ MrNV2-R hoặc XSV2-F/XSV2-R và cặp mồi bước 2: MrNV3-F/ MrNV3-R hoặc XSV3-F/ XSV3-R để phát hiện sàng lọc MrNV và XSV ở tôm giống và tôm bố mẹ.

Bảng 3 - Trình tự mồi phương pháp Nested RT- PCR

Vi rút đích

Tên mồi

Trình tự (5’-3’)

...

...

...

Bước 1: One step RT-PCR (Sahul Hameed & cs, 2004a, b; Sudhakaran & cs, 2007a)

MrNV

MrNV2-F

GCG-TTA-TAG-ATG-GCA-CAA-GG

425 bp

MrNV2-R

AGC-TGT-GAA-ACT-TCC-ACT-GG

XSV

XSV2-F

...

...

...

546 bp

XSV2-R

CCG-GAA-TTC-CGT-TAC-TGT-TCG-GAG-TCC-CAA

Bước 2: Nested RT-PCR (Sudhakaran & cs, 2007a)

MrNV

MrNV3-F

GAT-GAC-CCC-AAC-GTT-ATC-CT

205 bp

MrNV3-R

...

...

...

XSV

XSV3-F

ACA-TTG-GCG-GTT-GGG-TCA-TA

236 bp

XSV3-R

GTG-CCT-GTT-GCT-GAA-ATA-CC

Phương pháp Multiplex RT-PGR sử dụng cặp mồi bước 1: MrNV1-F/ MrNV1-R hoặc XSV1F/XSV1-R để phát hiện MrNV và XSV.

Bảng 4 - Trình tự mồi phương pháp Multiplex RT-PCR

Vi rút đích

...

...

...

Trình tự (5’-3’)

Kích thước sản phẩm

MrNV

MrNV1-F

GAT-ACA-GAT-CCA-CTA-GAT-GAC-C

681 bp

MrNV1-R

GAC-GAT-AGC-TCT-GAT-AAT-CC

XSV

...

...

...

GGA-GAA-CCA-TGA-GAT-CAC-G

500 bp

XSV1-R

CTG-CTC-ATT-ACT-GTT-CGG-AGT-C

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái động khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (4.1.7) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mờ và hoàn nguyện. Dùng dung dịch đệm TE (3.12) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 μM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.13) (20 μl mồi gốc và 80 μl nước tinh khiết không có nuclease).

6.6.2  Tiến hành phản ứng RT- PCR, Nested RT- PCR và Multiplex RT-PCR

Phản ứng RT- PCR được thực hiện trong máy nhân gen PCR (4.1.4) sử dụng cặp mồi MrNV2-F/MrNV2-R hoặc XSV2-F/ XSV2-R, sử dụng kit nhân gen (3.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem Phụ lục D).

...

...

...

Bước 1: Phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi MrNV2-F/ MrNV2-R và XSV2-F/ XSV2-R (3.2)

Bước 2: Phân ứng Nested RT- PCR sử dụng cặp mồi MrNV3-F/ MrNV3-R và XSV3-F/ XSV3-R (3.2)

Phản ứng Multiplex RT-PCR được thực hiện trong máy nhân gen PCR (4.1.4) sử dụng cặp mồi MrNV1-F/ MrNV1-R hoặc XSV1-F/ XSV1-R, sử dụng kit nhân gen (3.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem F.2 của Phụ lục F).

6.6.3  Điện di

6.6.3.1  Chuẩn bị bản thạch

Pha thạch agarose với nồng độ (3.7) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.8) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 μl chất nhuộm màu (3.9) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất).

6.6.3.2  Chạy điện di

Hút 2 μl chất đệm tải mẫu (3.10) vào 8 μl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch. Thực hiện điện di trong bộ điện di, chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.11) để so sánh kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 μl thang chuẩn ADN (3.11) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

6.6.4  Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc sản phẩm PCR (4.1.11).

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Đối chứng dương có vạch sáng kích thước như sau:

...

...

...

Phản ứng Nested RT- PCR: Sản phẩm khuếch đại ở vạch sáng 205 bp hoặc 236 bp

Phản ứng Multiplex RT-PCR: Sản phẩm khuếch đại ở vạch sáng 681 bp hoặc 500 bp

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng

Với điều kiện phản ứng trên

- Mẫu xét nghiệm âm tính khi tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Mẫu xét nghiệm dương tính khi tại giếng của mẫu thử xuất hiện vạch sáng kích thước bằng đối chứng dương.

CHÚ THÍCH:

- Trong trường hợp mẫu dương tính yếu, có thể không phát hiện được sản phẩm của bước 1.

- Khi xét nghiệm, cần tiến hành xét nghiệm riêng từng tác nhân gây bệnh.

...

...

...

Tôm càng xanh được xác định bị bệnh trắng đuôi do vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus khi có các đặc điểm dịch tễ (xem 5.2), triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh (xem 5.2) và:

- Có kết quả dương tính với MrNV bằng phương pháp real-time RT- PCR (xem 6.5.3) hoặc

- Có kết quả dương tính với MrNV bằng phương pháp RT- PCR (xem 6.6.4) hoặc

- Có kết quả dương tính với MrNV bằng phương pháp nested RT PCR (xem 6.6.4) hoặc

- Có kết quả dương tính với MrNV bằng phương pháp multiplex RT-PCR (xem 6.6.4).

Phụ lục A

(quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

...

...

...

A.1.1  Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X:

100 ml

Nước khử ion:

900 ml

Tổng:

1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

...

...

...

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) pH 7,4 ± 0,2

A.2.1  Thành phần

Natri chloride (NaCl)

8g

Kali chloride (KCl)

0,2 g

Dinatri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

1,15g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

...

...

...

Nước cất

1 000 ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong 1 000 ml nước cất. Lắc đều cho tới khi tán hoàn toàn.

Chỉnh pH trong khoảng 7,4 ± 0,2. Hấp ở 121 °C trong 15 phút, bảo quản ở 4 °C đến 8 °C. Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Phụ lục B

(tham khảo)

...

...

...

B.1  Quy trình tách chiết ARN bằng bộ kít InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini Kít/ KF96

B.1.1  Thuốc thử và vật liệu

B1.1.1  Dung dịch đệm RV

B1.12  Dung dịch rửa 1

B1.1.3  Dung dịch rửa 2

B1.1.4  Hỗn hợp hạt từ

B1.1.5  Dung dịch thu hồi ADN/ARN (EB)

B.1.2  Thiết bị, dụng cụ

B.1.2.1  Máy chiết tách tự động Thermo Scientific^TM KingFisher^TM Flex

...

...

...

B.1.2.3  Máy ly tâm lạnh

B.1.2.4  Máy lắc, ủ nhiệt

B.1.2.5  Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml

B.1.3  Cách tiến hành

- Chuẩn bị đĩa chứa dung dịch chiết tách theo hệ thống của máy như sau:

+ Đĩa rửa 1: 800μl dung dịch dịch rửa 1 /giếng;

+ Đĩa rửa 2 và đĩa rửa 3: 800μl dung dịch rửa 2/giếng;

+ Đĩa elution buffer 100μl dung dịch EB/giếng

- Huyễn dịch 10% của mẫu bệnh phẩm được rã đông, trộn đều bằng máy vortex. Ly tâm mẫu trong máy ly tâm lạnh với lực ly tâm 2500 g/15 min.

...

...

...

- Chuyển toàn bộ dung dịch trong ống eppendorf vào đĩa chứa mẫu 96 giếng (mỗi giếng tương ứng với một mẫu chiết tách). Dùng giấy dán đĩa chuyên dụng dán kín mặt đĩa.

- Đặt đĩa lên máy lắc, ủ nhiệt (HLC-MHR23). Lắc đĩa với gia tốc 750 rpm/15 min, nhiệt độ 65 °C.

- Lấy đĩa ra khỏi máy lắc, để nguội trong 5 min, tháo bỏ giấy dán đĩa. Bổ sung 420’ μl dung dịch hạt từ Mix (gồm có 400 μl Binding solution và 20 μl MAP) vào mỗi giếng.

- Chuyển tất cả các đĩa bao gồm: đĩa Tip Combs, đĩa EB, đĩa rửa 3, đĩa rửa 2, đĩa rửa 1 và đĩa chứa mẫu vào từng khay của máy chiết tách tự động theo hướng dẫn của máy.

- Chọn chương trình chiết tách RNA đã được cài đặt trước đó theo hướng dẫn của hãng sản xuất kít InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96.

- Sau 34 min, quá trình chiết tách hoàn tất. Thu hồi ARN của từng giếng vào ống eppendorf 0.5 ml tương ứng đã ghi rõ ký hiệu mẫu.

- Bảo quản mẫu ARN ở 4 °C trong vài giờ và âm 20 °C đến âm 80 °C trong thời gian lâu hơn.

B.2  Quy trình tách chiết ARN bằng bộ kit Taco RNA/DNA

B.2.1  Thuốc thử và vật liệu thử

...

...

...

B.2.1.2  Dung dịch đệm rửa B

B.2.1.3  Nước đệm

B.2.1.4  Ethanol tuyệt đối (100%).

B.2.1.5  Hạt từ.

B.2.2  Thiết bị, dụng cụ

B.2.2.1  Máy TACO

B.2.2.2  Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml

B.2.3  Chuẩn bị thuốc thử

- Pha dung dịch đệm rửa A (washing buffer A) với 135 ml ethanol tuyệt đối

...

...

...

- Tiến hành theo sơ đồ nêu trong bảng B.1.

Bảng B.1 - Sơ đồ chuẩn bị

Thuốc thử

Lượng (μl)

Vật liệu thử

Lượng (μl)

Cột

H

G

...

...

...

E

D

C

B

A

Ethanol tuyệt đối

250

-

-

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

...

...

...

Hạt từ

50

►2

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

-

-

►3

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

-

►4

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

...

...

...

-

►5

...

...

...

Nước đệm

100

-

-

►6

...

...

...

Ethanol tuyệt đối

250

-

-

►7

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

Hạt từ

...

...

...

►8

...

...

...

750

-

-

►9

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

-

►10

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

-

...

...

...

Nước đệm

...

...

...

-

-

►12

...

...

...

B.2.4  Chuẩn bị mẫu thử

- Cho 450 μl mẫu dung dịch đệm vào các ống eppendorf.

- Cho 100 μl mẫu vào ống eppendorf chứa dung đệm.

- Lắc bằng máy votex (4.1.10) trong 15 s.

- Ly tâm 12 000 vòng trong 1 min.

- Cho 550 μl (mẫu và dung dịch đệm) vào các giếng ở cột 1 hoặc 7.

B.2.5  Đưa mẫu vào máy TACO

- Đặt đĩa vào máy TACO

...

...

...

- Sử dụng máy TACO theo hướng dẫn sử dụng: Máy TACO tự động chiết tách trong khoảng 50 min.

- Thu 100 μl ADN từ các giếng trong cột 6 hoặc 12 sang các ống eppendorf mới.

LƯU Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện.

B.3.  Tách chiết ARN bằng bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit

B.3.1. Thuốc thử và vật liệu thử

B.3.1.1  Proteinase K

B.3.1.2  Dung dịch đệm lysis Buffer

B.3.1.3  Dung dịch earrier RNA

B.3.1.4  Dung dịch dung dịch đệm rửa (W5)

...

...

...

B.3.2  Thiết bị, dụng cụ

B.3.2.1 Máy ly tâm

B.3.2.2  Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml

B.3.2. Tiến hành

- Pha hỗn hợp dung dịch carrier và lysis buffer

N x 0,21 mL = A mL

A mL x 28 μL/mL = B μL

Trong đó: N là số mẫu cần tách chiết

A là tổng số mL lysis buffer cần cho N mẫu;

...

...

...

1. Cho 25 μL proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml;

2. Cho 200 μL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K;

CHÚ THÍCH: nếu thể tích mẫu <200 μL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 μL bằng dung dịch PBS hoặc dung dịch natri chloride 0,9 %..

3. Cho hỗn hợp dung dịch lysis buffer và carrier RNA vào ống chứa mẫu; đóng nắp ống và vortex 15 s;

4. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;

5. Cho thêm 250 μL ethanol 96 % đến ethanol tuyệt đối vào ống mẫu; đóng nắp và vortex 15 s;

6. Để ở nhiệt độ phòng 5 min;

CHÚ THÍCH: mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên.

7. Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc;

...

...

...

9. Cho 500 μL dung dịch đệm rửa (W5) vào cột lọc; ly tâm 12.000 vòng trong 2 min đến 3 min; Chuyển cột lọc sang ống thu mới;

10. Lặp lại Bước 9 với 500 μL nước rửa dung dịch đệm rửa (W5) một lần nữa;

11. Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới;

12. Ly tâm khô 12000 vòng trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5;

13. Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 μL;

14. Cho 10 - 50 μL nước không chứa RNase (E3) (có sẵn) vào cột lọc;

15. Để ở nhiệt độ phòng 1 min; Ly tâm cột lọc ở 12000 vòng trong 1 min đến 2 min.

16. Lấy sản phẩm dưới cột lọc; Bảo quản mẫu ARN ở 4 °C trong vài giờ và âm 20 °C đến âm 80 °C trong thời gian lâu hơn.

...

...

...

(Tham khảo)

Phương pháp Real-time RT-PCR phát hiện vi rút gây bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh

Thực hiện phản ứng real-time RT-PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi và đoạn dò phát hiện vi rút MrNV (MrNV4-F/R/P) hoặc XSV (XSV4-F/R/P) đã được chuẩn bị (3.1) và kít nhân gen realtime RT-PCR (3.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

VÍ DỤ: Theo kít Quanta Bio- qScript ^TMXLT 1 step RT-qPCR ToughMix hoặc kít tương đương theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho mỗi phản ứng nhân gen được nêu trong bảng C.1.

Bảng C.1 - Thành phần phản ứng real-time RT-PCR

STT

Thành phần

...

...

...

Thể tích cho 1 phần ứng (μl)

1

Nước không có RNAase/ADNase

6

2

Dung dịch 2X reaction mix

12,5

...

...

...

Mồi xuôi

20

0,5

4

Mồi ngược

20

0,5

5

Đoạn dò

...

...

...

0,5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

Chuyển 20 μL hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng MrNV và XSV chuẩn.

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phần ứng real-time RT-PCR bằng máy real-time PCR (4.1.5) đã cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong bảng C.2.

Bảng C.2 - Chu trình nhiệt của phản ứng real-time RT-PCR

...

...

...

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

50

10 min

01

95

01 min

01

95

...

...

...

40

60(*)

30 s

Giữ ở 4 °C đến khi tắt máy

CHÚ THÍCH:

+ Phản ứng real-time RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen) và mẫu đối chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen);

+ Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng;

+ Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử dụng.

...

...

...

(Tham khảo)

Phương pháp RT-PCR phát hiện vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus gây bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh

D.1  Thực hiện phản ứng RT - PCR

Kỹ thuật RT-PCR một bước:

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi MrNV2-F/ MrNV2-R hoặc XSV2-F/ XSV2-R đã được chuẩn bị (3.2) và kít nhân gen (3.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

VÍ DỤ: Chuẩn bị MasterMix cho phản ứng RT-PCR theo kít Superscript^® III One-Step RT-PCR with Platinum^® Taq. Cat: 12574-026[3]) hoặc kít tương đương theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho mỗi phản ứng nhân gen được nêu trong bảng D.1

Bảng D.1 - Thành phần phản ứng RT-PCR

Thành phần

...

...

...

Thể tích cho 1 Phản ứng (μl)

Nước không có ARNase/DNAase

6

Dung dịch 2x Reaction Mix

12,5

Mồi xuôi

20

...

...

...

Mồi ngược

20

0,5

Enzyme

0.5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

...

...

...

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng RT-PCR bằng máy nhân gen (4.1.4) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng D.2).

Bảng D.2 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

50

30 min

...

...

...

94

2 min

1

94

15 s

40

55

30 s

68

...

...

...

68

5 min

1

CHÚ THÍCH:

+ Phản ứng RT- PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen dương) và mẫu đối chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen âm);

+ Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng;

+ Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử dụng.

Phụ lục E

...

...

...

Phương pháp Nested RT-PCR phát hiện vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus gây bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh

Thực hiện phản ứng Nested RT - PCR

Phương pháp Nested RT - PCR bao gồm 2 bước:

Bước 1: Phản ứng RT-PCR (xem phụ lục D)

Bước 2: Phản ứng Nested RT-PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi MrNV3-F / MrNV3-R hoặc XSV3-F/XSV3-R đã được chuẩn bị (3.2) và kít nhân gen (3.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

VÍ DỤ: Chuẩn bị Master mix cho phản ứng Nested RT-PCR theo kít Thermo Scienetific Dream Taq PCR Master Mix (2X), Cat No: K1071[4] hoặc kít tương đương theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng E.1).

Bảng E.1 - Thành phần phản ứng Nested RT-PCR

...

...

...

Nồng độ (μM)

Thể tích cho 1 phản ứng (μl)

Nước không có

ARNase/DNAase

6,5

Dung dịch Master Mix 2X

12,5

...

...

...

20

0,5

Mồi ngược

20

0,5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 3 μl mẫu cDNA là sản phẩm bước 1.

...

...

...

Mẫu thử: Cho 3 μl mẫu sản phẩm của phản ứng RT-PCR tại bước 1 vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng Nested RT-PCR bằng máy nhân gen (4.1.4) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng E.2).

Bảng E.2 - Chu trình nhiệt của phản ứng Nested RT-PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

95

2 min

1

...

...

...

30 s

30

55

30 s

72

60 s

72

10 min

1

...

...

...

+ Phản ứng Nested RT- PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen dương) và mẫu đối chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen âm);

+ Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng Nested RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng;

+ Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử dụng.

Phụ lục F

(Tham khảo)

Phương pháp multiplex RT-PCR phát hiện vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus gây bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh

Thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR

VÍ DỤ: Chuẩn bị MasterMix cho phản ứng multiplex RT-PCR theo kít Superscript^® III One-Step RT-PCR with Platinum^®Taq. Cat 12574-026[3]) hoặc kít tương đương theo hướng dẫn của nhà sản xuất

...

...

...

Bảng F.1 - Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR

Thành phần

Nồng độ (μM)

Thể tích cho 1 phản ứng (μl)

Nước không có

ARNase/DNAase

5

Dung dịch 2x Reaction Mix

...

...

...

12,5

Mồi MrNV1-F

20

0,5

Mồi MrNV1-R

20

0,5

Mồi XSV1-F

20

...

...

...

Mồi XSV1-R

20

0,5

Enzyme

0.5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

Mỗi phản ứng chứa 20 μl dung dịch đệm đã được pha như bảng F.2

...

...

...

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng multiplex RT-PCR bằng máy nhân gen (4.1.4) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng F.2).

Bảng F.2 - Chu trình nhiệt của Phản ứng multiplex RT-PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

50

30 min

...

...

...

94

2 min

1

94

15 s

40

55

30 s

68

...

...

...

68

5 min

1

CHÚ THÍCH:

+ Phản ứng multiplex RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen dương) và mẫu đối chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen âm);

+ Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng multiplex RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng;

+ Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử dụng.

Phụ lục G

...

...

...

Sơ đồ xét nghiệm vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus

Thư mục tài liệu tham khảo

1. Tripathy S, P. K. Sahoo, Jkumari., B.K. Mishra., N. Sarangi., S. Ayyappan. Multiplex RT-PCR detection and sequence comparison of viruses MrNV and XSV associated with whote tail disease in Macrobrachium cosenbergii. Aquacplture 258 (1-4):134-139.

2. Sudhakaran R., Syed Musthaq S., Haribabu P., Mukherjee S.C., Gopal C. & Sahul Hameed A.S. (2006). Experimental transmission of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) in three species of marine shrimp (Penaeus indicus, Penaeus Japonicus and Penaeus monodon): Aquaculture, 257,136-141.

3. Sri Widada J. & Bonami J.R. (2004). Characteristics of the monocistronic genome of extra small virus,, a virus-like particle associated with Macrobrachium rosenbergiinodavirus: possible candidate for a new species of satellite virus. Journal of General Virology 85, 643-646.

4. Sudhakaran R., Syed Musthaq S., HaribabuP., Mukherjee S.C., Gopal C. and Sahpl Hameed A.S. (2004a). Experimental transmission of Macrobrachium rosenbergiinodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) in three species of marine shrimp (Penaeus indicus, Penaeus japonicusand Penaeus monodon). Aquacplture, 257 (1-4), 136-141.

5. Sahul Hameed A.S., Yoganandhan K., Sri Widada J. & Bonami J.R. (2004b). Studies on the occurrence of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus-like particles associated with white tail disease of M. rosenbergii in India by RT-PCR detection. Aquaculture, 238, 127-133.

...

...

...

7. Eissa I. A. M, Diab A. S, Ahmed A. A and Moria Zaki. Evaluation of different RT-PCR assays for diagnosis of carrier infection of nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) in Macrobrachium rosenbergii in Egypt. Life Science Journal 2014.

8. Zhang et al. (2006). Quantitative relationship of two viruses (MrNV and XSV) in white-tail disease of Macrobrachium rosenbergii. Diseases of aquatic organisms, Disease of Aquatic Organisms, Vol. 71: 11-17,2006.

9. OIE/WOAH, Manual of diagnostic test for aquatic animails, 2024, Chapter 2.2.7. Manual of diagnostic test for Infection with Macrobrachium rosenbergii nodavirus (White tail disease).

[1] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[3] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương

[4] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[3] Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.