TCVN-8710-31-2026-Benh-thuy-san-Quy-trinh-chan-doan-Phan-31-Benh-tuyen-tuy

• Số hiệu: TCVN8710-31:2026
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2026

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-31:2026

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN -
PHẦN 31: BỆNH TUYẾN TỤY DO VI RÚT SALMONID ALPHA VIRUS Ở CÁ HỒI

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure -

Part 31: Pancreas disease by Salmonid alphavirus (SAV) in salmon

Lời nói đầu

TCVN 8710-31:2026 do Trung tâm Chẩn đoán và Xét nghiệm thú y Trung ương I, Cục Chăn nuôi và Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:

- TCVN 8710-1:2011, Phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm;

...

...

...

- TCVN 8710-3:2019, Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm;

- TCVN 8710-4:2019, Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm;

- TCVN 8710-5:2023, Phần 5: Hội chứng taura ở tôm;

- TCVN 8710-6:2019, Phần 6: Bệnh do Koi herpes vi rút ở cá chép;

- TCVN 8710-7:2019, Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép;

- TCVN 8710-8:2023, Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

- TCVN 8710-9:2012, Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm;

- TCVN 8710-10:2015, Phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-11:2015, Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

...

...

...

- TCVN 8710-13:2015, Phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm;

- TCVN 8710-14:2015, Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;

- TCVN 8710-15:2015, Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila ở cá;

- TCVN 8710-16:2016, Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

- TCVN 8710-17:2016, Phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

- TCVN 8710-19:2019, Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

- TCVN 8710-20:2019, Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

- TCVN 8710-21:2019, Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá;

- TCVN 8710-22:2022, Phần 22: Bệnh sắn lá 16 móc ở cá;

...

...

...

- TCVN 8710-24:2022, Phần 24: Bệnh do sán lá Dollfustrema sp. ở cá da trơn;

- TCVN 8710-25:2022, Phần 25: Bệnh do ký sinh trùng Bonamia ostreae và Bonamia exitiosa ở hàu;

- TCVN 8710-26:2023, Phần 26: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do EHNV ở cá;

- TCVN 8710-27:2023, Phần 27: Bệnh do vi rút Tilapia lake (TiLV) ở cá rô phi,

- TCVN 8710-28:2023, Phần 28: Bệnh do RSIV ở cá biển;

- TCVN 8710-29:2026, Phần 29: Bệnh do vi rút Herpes ở bào ngư;

- TCVN 8710-30:2026, Phần 30: Bệnh nhiễm trùng xuất huyết do ví rút Viral haemorrhagic septicaemia ở cá;

- TCVN 8710-31:2026, Phần 31: Bệnh tuyến tụy do vi rút Salmonid alphavirus ở cá hồi;

- TCVN 8710-32:2026, Phần 32: Bệnh trắng đuôi do vi rút Macrobrachium rosenbergii nodavirus ở tôm càng xanh.

...

...

...

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN -

PHẦN 31: BỆNH TUYẾN TỤY DO VI RÚT SALMONID ALPHAVIRUS Ở CÁ HỒI

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure -

Part 31: Pancreas disease by Salmonid alphavirus (SAV) in salmon

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh tuyến tụy do vi rút Salmonid alphavirus ở cá hồi.

2  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

2.1  Thuật ngữ và định nghĩa

...

...

...

2.1.1

Bệnh tuyến tụy do vi rút Salmonid alphavirus (SAV) ở cá hồi (Pancreas disease by Salmonid alphavirus (SAV) in salmon)

Bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút Salmonid alphavirus (SAV) đối với các loài cá Hồi.

2.1.2

Vi rút SAV (Salmonid alphavirus)

Vi rút thuộc giống Alphavirus, họ Togaviridae, hình cầu, có vỏ bọc với vật chất di truyền là RNA mạch đơn (ssRNA), vi rút có đường kính khoảng 60-70 nm. Bộ gen có khoảng 12 kb, mã hóa 8 loại protein gồm 4 capsid glycoprotein (E1, E2, E3 và 6K), 04 protein phi cấu trúc (nsP1-4). SAV được chia thành 6 kiểu gen từ SAV1 đến SAV6 chỉ dựa trên trình tự axit nucleic của protein E2 và nsP3.

2.2  Các từ viết tắt

- ADN (Deoxyribonucleic acid): Axit deoxyribonucleic;

- ARN (Ribonucleic acid): Axit Ribonucleic;

...

...

...

- FAM: 6-Carboxyfluorescein (một chất phát huỳnh quang dùng trong đầu dò TaqMan);

- MAP (Magnetic Affinity Particles): Các hạt từ sử dụng trong bộ kit InviMAG^® Virus DNA/RNA gắn chọn lọc acid nucleic trong quá trình tách chiết tự động;

- PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phosphat;

- RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction): Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược;

- Real-time RT-PCR (Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực;

- TAE (Tris-acetate-EDTA): Tris-axetat-axitetylendiamintetraaxetic;

- TBE (Tris-borate-EDTA): Tris-borat-axit etylendiamintetraaxetic;

- TE (Tris-EDTA): Tris-axit etylendiamintetraaxetic;

- SM: Salmonid alphavirus.

...

...

...

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Mồi và đoạn dò (primers/probe) real-time RT-PCR, gồm mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò

3.2  Mồi RT-PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.3  Kít nhân gen PCR

3.4  Kít nhân gen RT-PCR

3.5  Kít nhân gen real-time RT- PCR

3.6  Kít tách chiết ARN

3.7  Thạch agarose

3.8 Dung dịch đệm TAE hoặc TBE (Cách chuẩn bị xem A.1, phụ lục A)

...

...

...

3.10  Chất đệm tải mẫu (loading dye 6X)

3.11  Thang chuẩn ADN (ladder/Marker)

3.12  Dung dịch đệm TE

3.13  Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.14  Ethanol, 70 %, 90 % đến ethanol tuyệt đối

3.15  Dung dịch muối đệm phosphate (PBS) (Cách chuẩn bị xem A.2 của Phụ lục A).

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị

...

...

...

4.1.2  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ âm 20 °C tới âm 80 °C

4.1.3  Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2

4.1.4  Máy nhân gen PCR

4.1.5  Máy real-time PCR

4.1.6  Máy tách chiết ARN/ADN

4.1.7  Máy ly tâm, có thể hoạt động với gia tốc 2 000 g đến 4 000 g và gia tốc 12 000 g

4.1.8  Máy nghiền mẫu

4.1.9  Máy ủ nhiệt, từ 0 °C đến 100 °C

4.1.10  Máy lắc trộn Vortex

...

...

...

4.1.12  Bộ điện di, gồm bộ nguồn và thể chạy điện di

4.1.13  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg

4.1.14  Cối, chày nghiền mẫu.

4.2  Dụng cụ

4.2.1  Pipet đơn kênh các loại

4.2.2 Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml

4.2.3  Dụng cụ chứa mẫu, kín, có nắp đậy, không rò rỉ, vô trùng

4.2.4  Panh, kéo, vô trùng

4.2.5  Khay đựng đá lạnh

...

...

...

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Đặc điểm dịch tễ

Loài cảm nhiễm: Cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar), cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá hồi Bắc Cực (Salvelinus alpinus). Bệnh ghi nhận ở mọi giai đoạn phát triển, cá sống sót có thể mang vi-rút lâu dài.

Phân bố: Được báo cáo tại một số quốc gia ở châu Âu, Bắc Mỹ và Nam Mỹ.

Tỷ lệ mắc và tử vong: Trong ổ dịch, tỷ lệ nhiễm có thể đạt 70 - 100%. Tỷ lệ chết tích lũy có thể vượt 50 % tùy thuộc loài, điều kiện môi trường, phương thức nuôi, biện pháp an toàn sinh học và kiểu gen vi rút.

Kiểu gen: SAV1 và SAV2 gây bệnh trên cá nước ngọt và cá biển; SAV3-SAV6 ghi nhận trên cá biển.

Phương thức lây truyền: Chủ yếu lây ngang; lây dọc không đáng kể.

Ảnh hưởng của nhiệt độ: ở 20 °C, vi-rút không còn phát hiện sau 35 ngày; ở 4 °C, vi-rút tồn tại tới 65 ngày.

Cơ quan phát hiện vi-rút: Giai đoạn bùng phát, tim chứa lượng vi-rút cao nhất. Sau dịch, vi-rút vẫn được phát hiện trong tim, mang, thận giữa. Huyết thanh thích hợp để phát hiện sớm bằng Realtime RT-PCR hoặc nuôi cấy tế bào. Các cơ quan khác phù hợp cho chẩn đoán mô bệnh học: mang, tim, manh tràng (có mô tụy), gan, thận, lách.

...

...

...

Triệu chứng lâm sàng: Cá bệnh thường giảm ăn hoặc ngừng ăn đột ngột trong vòng 1-2 tuần trước khi tỷ lệ chết tăng. Cá có biểu hiện bơi lờ đờ trên mặt nước, một số cá yếu nằm dưới đáy bể hoặc lồng (dạng “cá ngủ”). Tăng lượng phân thải ra. Sau khi dịch bùng phát, cá trở nên gầy, thân hình mảnh, phát triển chậm.

Bệnh tích: ruột chứa nhiều dịch nhầy màu vàng, vùng tụy xung huyết hoặc xuất huyết, xoang bụng tích dịch. Tim có thể nhợt nhạt, đôi khi bị vỡ.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu

Thu mẫu có dấu hiệu bệnh lý, còn sống hoặc mới chết. Mẫu bệnh phẩm phải được lấy vô trùng và để riêng biệt trong lọ dụng cụ chứa mẫu (4.2.3).

- Cá hương, cá bột, cá con có khối lượng nhỏ hơn 1 g : Lấy nguyên con, từ 01 g /mẫu đến 03 g/mẫu.

- Cá giống và thương phẩm từ 1g đến 50 g: Lấy nguyên con, từ 5 con/mẫu đến 15 con/mẫu.

- Cá thương phẩm từ 50 g: Lấy nguyên con, từ 3 con đến 5 con/mẫu hoặc lấy tụy, tim, gan, lách, thận giữa, mang, huyết thanh của từ 2 con đến 5 con/mẫu.

- Cá bố mẹ: Lấy nguyên con 1 con/mẫu hoặc lấy tụy, tim, gan, lách, thận giữa, mang, huyết thanh, trứng hoặc sẹ của 1 con/mẫu

...

...

...

CHÚ THÍCH:

Khuyến nghị lấy tim và thận giữa để phát hiện SAV bằng phương pháp sinh học phân tử.

Đối với cá đã tiêm vacxin nên lấy tim và khống nên lấy thận giữa, lá lách hoặc các cơ quan nội tạng khác vì việc mở khoang bụng có thể gây nhiễm. RNA/DNA vi rút từ vacxin,

Số lượng cá tối thiểu 10 con/ đàn nghi nhiễm tùy theo quy mô và mục đích giám sát hay chẩn đoán.

6.2  Bảo quản mẫu

Bảo quản vận chuyển: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 48 h khi vận chuyển về phòng thí nghiệm hoặc bảo quản trong ethanol 70 % đến ethanol tuyệt đối tỷ lệ mẫu : ethanol bằng 1:10.

Bảo quản tại phòng thí nghiệm: Mẫu xét nghiệm bằng phương pháp PCR được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong quá trình chuyển đến phòng thí nghiệm nếu mẫu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc được bảo quản trong dung dịch PBS (3.15) theo tỷ lệ mẫu : PBS bằng 1:10 ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc bảo quản trong ethanol từ 70% đến ethanol tuyệt đối.

6.3  Chuẩn bị mẫu

Dùng panh, kéo (4.2.4) vô trùng để thực hiện các thao tác: tách, cắt lấy mẫu (tim, mang, thận, lách, vây ngực, vây đuôi, mô cơ) và thu mẫu trứng, sẹ bằng cách dùng ngón tay vuốt nhẹ từ phía trước bụng xuống hậu môn thu vào ống nghiệm.

...

...

...

Với mẫu đã bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C cần rã đông từ từ ở 2 đến 8 °C hoặc nhiệt độ phòng trước khi thực hiện đồng nhất mẫu.

6.4  Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.6) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Bộ kít tách chiết ARN: InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat No: 7441050100 (xem B.1, phụ lục B) hoặc bộ kit tách chiết TACO RNA/DNA extraction Kit (GeneReach Cat No. atc-d/rna, 320 tests (xem B.2, phụ lục B) hoặc Purelink viral RNA/DNA mini kit (50) (Cat. No: 12280-050) (xem B.3, phụ lục B)[1]

6.5  Phương pháp real-time RT - PCR

6.5.1  Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy real-time PCR (4.1.5) theo phương pháp real-time RT-PCR nhằm khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút gây bệnh tuyến tụy ở cá hồi, sử dụng cặp mồi QnsP1F/QnsP1R và dò QnsP1 (3.1).

Bảng 1 - Trình tự mồi, dò

TT

...

...

...

Trình tự mồi từ đầu 5' tới 3'

1

Mồi QnsP1F

CCG-GCC-CTG-AAC-CAG-TT

2

Mồi QnsP1R

GTA-GCC-AAG-TGG-GAG-AAA-GCT

3

Dò QnsP1

...

...

...

Mồi và đoạn dò được chuẩn bị như sau:

- Mồi và đoạn dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (4.1.7) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.12) để hoàn nguyên ở nồng độ gốc 100 μM.

- Mồi sử dụng ở nồng độ 25 μM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.13) (25 μl mồi gốc và 75 μl nước tinh khiết không có nuclease).

- Dò QnsP1 probe sử dụng nồng độ 10 μM: pha loãng dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.13) (10 μl dò gốc và 90 μl nước tinh khiết không có nuclease).

6.5.2  Tiến hành phản ứng real-time RT-PCR

Kỹ thuật real-time RT- PCR sử dụng cặp mồi QnsP1F / Mồi QnsP1R và dò QnsP1 probe đã được chuẩn bị (6.5.1), sử dụng kít nhân gen real-time RT-PCR (3.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem Phụ lục C).

VÍ DỤ: Kít nhân gen Quantitect probe PCR Kit (200): Catalogue Number 204343 [3]

6.5.3  Đọc kết quả

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

...

...

...

- Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct = ± 2

Với điều kiện phản ứng như trên:

- Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính

- Mẫu không có giá trị Ct được xem là âm tính

- Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.

CHÚ THÍCH:

- Những mẫu nghi ngờ, cần được xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

- Phản ứng real-time RT-PCR phát bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng real-time RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

...

...

...

6.6.1  Chuẩn bị mồi

Phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu E2F / E2R (3.2) để phát hiện vi rút gây bệnh tuyến tụy ở cá hồi.

Bảng 2 - Trình tự cặp mồi

Cặp mồi

Trình tự mồi từ đầu 5' tới 3'

Sản phẩm (bp)

Mồi E2F

5'-CCG-TTG-CGG-CCA-CAC-TGG-ATG-3'

516 bp

...

...

...

5'-CCT-CAT-AGG-TGA-TCG-ACG-GCA-G-3’

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (4.1.7) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.12) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM làm gốc.

- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 pM: Pha loãng mồi gốc bằng nước, tinh khiết không có nuclease (3.13) (20 μl mỗi gốc và 80 μl nước tinh khiết không có nuclease).

6.6.2  Tiến hành phản ứng RT-PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen PCR (4.1.4) theo phương pháp RT-PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút gây bệnh tuyến tụy ở cá hồi sử dụng cặp mồi E2F / E2R (3.2) (xem Phụ lục D)

6.6.3  Điện di

6.6.3.1  Chuẩn bị bàn thạch

Pha thạch agarose (3.7) với nồng độ từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.8) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

...

...

...

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bàn thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản thạch vào bệ điện di (4.1.12), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất).

6.6.3.2  Chạy điện di

Hút 2 μl chất đệm tải mẫu (3.10) vào 8 μl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di, chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.11) để so sánh kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 μl thang chuẩn ADN (3.11) vào một giếng trên bàn thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

6.6.4  Đọc kết quả

...

...

...

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Đổi chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Đối chứng dương có vạch sáng kích thước 516 bp

- Thang chuẩn ADN các vạch sáng rõ ràng và chia vạch đúng kích thước

Với điều kiện phản ứng trên

Mẫu xét nghiệm âm tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

Mẫu xét nghiệm dương tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử xuất hiện vạch sáng kích thước 516 bp

...

...

...

Cá được xác định mắc bệnh tuyến tụy do SAV khi có những đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và:

- Có kết quả dương tính với SAV bằng phương pháp real-time RT-PCR (xem 6.5.3) hoặc

- Có kết quả dương tính với SAV bằng phương pháp RT-PCR (xem 6.6.4).

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch đệm TAE 1X hoặc TBE 1X

A.1.1  Thành phần

...

...

...

100 ml

Nước khử ion:

900 ml

Tổng:

1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) pH 7,4 ± 0,2

...

...

...

Natri chloride (NaCl)

8g

Kali chloride (KCl)

0,2 g

Dinatri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

1,15g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

0,2 g

Nước cất

...

...

...

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong 1 000 ml nước cất. Lắc đều cho tới khi tan hoàn toàn.

Chỉnh pH trong khoảng 7,4 ± 0,2. Hấp ở 121 °C trong 15 phút, bảo quản ở 4 °C đến 8 °C. Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn cửa nhà sản xuất

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hoá chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

...

...

...

B.1.1  Thuốc thử và vật liệu

B1.1.1  Dung dịch đệm RV

B1.1.2  Dung dịch rửa 1

B1.1.3  Dung dịch rửa 2

B1.1.4  Hỗn hợp hạt từ tính

B1.1.5 Dung dịch thu hồi ADN/ARN (EB)

B.1.2 Thiết bị, dụng cụ

B.1.2.1 Máy chiết tách tự động (Ví dụ Thermo Scientific^TM KingFisher^TM Flex)

B.1.2.2  Máy lắc trộn vortex

...

...

...

B.1.2.4  Máy lắc, ủ nhiệt

B.1.2.5  Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml

B.1.3  Cách tiến hành

- Chuẩn bị đĩa chứa dung dịch chiết tách theo hệ thống của máy như sau:

+ Đĩa rửa 1: 800μl dung dịch wash 1/giếng;

+ Đĩa rửa 2 và Đĩa rửa 3: 800μl dung dịch wash 2/giếng;

+ Đĩa thu hồi ADN/ARN: 100μl dung dịch EB/giếng

- Huyễn dịch 10% của mẫu bệnh phẩm được rã đông, trộn đều bằng máy vortex. Ly tâm mẫu trong máy ly tâm lạnh với lực ly tâm 2500 g/15 min.

- Hút 200 μl dịch trong bên trên sau khi ly tâm vào ống eppendorf 1,5ml vô trùng có chứa sẵn 200 μl dung dịch đệm lysis. Trộn đều mẫu bằng máy vortex và spin để kéo các phần bám trên nắp ống xuống.

...

...

...

- Đặt đĩa lên máy lắc, ủ nhiệt (HLC-MHR23). Lắc đĩa với gia tốc 750 rpm/15 min, nhiệt độ 65 °C.

- Lấy đĩa ra khỏi máy lắc, để nguội trong 5 min, tháo bỏ giấy dán đĩa. Bổ sung 420 μl dung dịch Bead Mix (gồm có 400 μl Binding solution và 20 μl MAP) vào mỗi giếng.

- Chuyển tất cả các đĩa bao gồm: đĩa Tip Combs, đĩa elution buffer, đĩa washing wash 3, đĩa washing wash 2, đĩa washing wash 1 và đĩa chứa mẫu vào từng khay của máy chiết tách tự động theo hướng dẫn của máy.

- Chọn chương trình chiết tách RNA đã được cài đặt trước đó theo hướng dẫn của hãng sản xuất kít InviMAG^®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96.

- Sau 34 min, quá trình chiết tách hoàn tất. Thu hồi ARN của từng giếng vào ống eppendorf 0.5 ml tương ứng đã ghi rõ ký hiệu mẫu.

- Bảo quản mẫu ARN ở 4 °C trong vài giờ và âm 20 °C đến âm 80 °C trong thời gian lâu hơn.

B.2  Quy trình tách chiết ARN bằng bộ kit Taco RNA/DNA

B.2.1  Thuốc thử và vật liệu thử

B.2.1.1  Dung dịch đệm rửa A

...

...

...

B.2.1.3  Nước đệm

B.2.1.4  Ethanol tuyệt đối (100%).

B.2.1.5  Hạt từ.

B.2.2  Thiết bị, dụng cụ

B.2.2.1  Máy TACO

B.2.2.2  Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml

B.2.3  Chuẩn bị thuốc thử

- Pha dung dịch đệm rửa A (washing buffer A) với 135 ml ethanol tuyệt đối.

- Pha dung dịch đệm rửa B (washing buffer B) với 230 ml ethanol tuyệt đối.

...

...

...

Bảng B.1 - Sơ đồ chuẩn bị

Thuốc thử

Lượng (μl)

Vật liệu thử

Lượng (μl)

Cột

H

G

F

...

...

...

D

C

B

A

Ethanol tuyệt đối

250

-

-

► 1

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

...

...

...

50

►2

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

-

-

►3

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

-

►4

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

...

...

...

►5

...

...

...

100

-

-

►6

...

...

...

Ethanol tuyệt đối

250

-

-

►7

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

750

Hạt từ

50

...

...

...

Dung dịch đệm rửa A

...

...

...

-

-

►9

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

-

►10

...

...

...

Dung dịch đệm rửa B

750

-

-

►11

...

...

...

Nước đệm

100

...

...

...

-

►12

...

...

...

B.2.4  Chuẩn bị mẫu thử

- Cho 450 μl mẫu dung dịch đệm vào các ống eppendorf.

- Cho 100 μl mẫu vào ống eppendorf chứa dung đệm.

- Lắc bằng máy votex (4.1.10) trong 15 s.

- Ly tâm 12000 vòng trong 1 min.

- Cho 550 μl (mẫu và dung dịch đệm) vào các giếng ở cột 1 hoặc 7.

B.2.5  Đưa mẫu vào máy TACO

- Đặt đĩa vào máy TACO

- Đặt lược vào máy TACO.

...

...

...

- Thu 100 μl ADN từ các giếng trong cột 6 hoặc 12 sang các ống eppendorf mới.

LƯU Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện.

B.3.  Tách chiết ARN bằng bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit

B.3.1 . Thuốc thử và vật liệu thử

B.3.1.1  Proteinase K

B.3.1.2  Dung dịch đệm lysis Buffer

B.3.1.3  Dung dịch carrier RNA

B.3.1.4  Dung dịch dung dịch đệm rửa (W5)

B.3.1.5  Nước RNase-free (E3)

...

...

...

B.3.2.1  Máy ly tâm

B.3.2.2  Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml

B.3.2. Tiến hành

- Pha hỗn hợp dung dịch carrier và lysis buffer

N x 0,21 mL = A mL

A mL x 28 μL/mL = B μL

Trong đó: N là số mẫu cần tách chiết

A là tổng số mL lysis buffer cần cho N mẫu;

B là tổng số μL carrier RNA cần cho N mẫu.

...

...

...

2. Cho 200 μL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase k;

CHÚ THÍCH: nếu thể tích mẫu < 200 μl thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 μL bằng dung dịch PBS hoặc dung dịch natri chloride 0,9 %.

3. Cho hỗn hợp dung dịch lysis buffer và carrier RNA vào ống chứa mẫu; đóng nắp ống và vortex 15s;

4. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;

5. Cho thêm 250 μL ethanol 96 % đến ethanol tuyệt đối vào ống mẫu; đóng nắp và vortex 15 s;

6. Để ở nhiệt độ phòng 5 min;

CHÚ THÍCH: mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên.

7. Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc;

8. Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 2 min đến 3 min; chuyển cột lọc sang ống thu mới;

...

...

...

10. Lặp lại bước 9 với 500 μL nước rửa dung dịch đệm rửa (W5) một lần nữa;

11. Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới;

12. Ly tâm khô 12000 vòng trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5;

13. Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 μL;

14. Cho 10 - 50 μL nước không chứa RNase (E3) (có sẵn) vào cột lọc;

15. Để ở nhiệt độ phòng 1 min; Ly tâm cột lọc ở 12000 vòng trong 1 min đến 2 min.

16. Lấy sản phẩm dưới cột lọc; Bảo quản mẫu ARN ở 4 °C trong vài giờ và âm 20 °C đến âm 80 °C trong thời gian lâu hơn.

Phụ lục C

...

...

...

Phương pháp real-time RT-PCR phát hiện vi rút SAV

Thực hiện phản ứng real-time RT-PCR

Kỹ thuật real-time RT-PCR bao gồm:

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi QnsP1F / QnsP1R, dò QnsP1probe đã được chuẩn bị (3.1) và kít nhân gen real-time RT-PCR (3.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Theo Kit nhân gen qScript XLT One-Step RT-qPCRToughMix, Code: 95132.500[5]) , Đóng gói: 500 Mẫu/Kit. Quantabio. Mỹ hoặc kít tương đương theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho mỗi phản ứng nhân gen được nêu trong bảng C.1.

Bảng C.1 - Thành phần phản ứng real-time RT - PCR

STT

Thành phần

...

...

...

Thể tích cho 1 phản ứng
(μl)

1

Nước không có RNAase/ADNase

6

2

Dung dịch 2X reaction mix

12,5

...

...

...

Mồi QnsP1F

25

0,5

4

Mồi QnsP1R

25

0,5

5

Dò QnsP1

...

...

...

0,5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng SAV chuẩn.

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng real-time RT-PCR bằng máy real-time PCR (4.1.5) đã cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong Bảng C.2.

Bảng C.2 - Chu trình nhiệt của phản ứng real-time RT-PCR

...

...

...

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

50

10 min

01

95

01 min

01

95

...

...

...

40

60

30 s

CHÚ THÍCH:

+ Phản ứng real-time RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen dương) và mẫu đối chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen âm);

+ Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng real-time RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng;

+ Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử dụng.

Phụ lục D

...

...

...

Phương pháp RT-PCR phát hiện vi rút SAV gây bệnh tuyến tụy ở cá hồi

Thực hiện phản ứng RT-PCR

Thực hiện phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi E2F/ E2R.

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi E2F/ E2R đã được chuẩn bị (3.2) và kít nhân gen (3.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

VÍ DỤ: Chuẩn bị MasterMix cho phản ứng RT-PCR theo kít Superscript^® III One-Step RT-PCR with Platinum^® Taq. Cat: 12574-026[3]) hoặc kít tương đương theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho mỗi phản ứng nhân gen được nêu trong bảng D.1.

Bảng D.1-Thành phần phản ứng RT-PCR

Thành phần

Nồng độ (μM)

...

...

...

Nước không có ARNase/DNAase

6

Dung dịch 2x Reaction Mix

12,5

Mồi E2F

20

0,5

...

...

...

20

0,5

Enzyme

0.5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng

20

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng chuẩn.

...

...

...

Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng RT-PCR bằng máy nhân gen (4.1.4) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng D.2).

Bảng D.2 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR

Nhiệt độ (°C)

Thời gian

Số chu kỳ (vòng)

50

30 min

1

...

...

...

2 min

1

94

15 s

40

55

30 s

68

60 s

...

...

...

5 min

1

Giữ ở 4 °C đến khi tắt máy

CHÚ THÍCH:

+ Phản ứng RT- PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen dương) và mẫu đối chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen âm);

+ Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng;

+ Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử dụng.

Phụ lục E

...

...

...

Sơ đồ xét nghiệm vi rút SAV

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Fringuelli E, Rowley HM, Wilson JC, Hunter R, Rodger H, Graham DA. Phylogenetic analyses and molecular epidemiology of European salmonid alphaviruses (SAV) based on partial E2 and nsP3 gene nucleotide sequences. Journal of Fish Diseases. 2008;31(11):811-23. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2008.00953.x

[2] Graham DA, Frost p, McLaughlin K, Rowley HM, Gabestad I, Gordon A, McLoughlin MF. A comparative study of marine salmonid alphavirus subtypes 1-6 using an experimental cohabitation challenge model. Journal of Fish Diseases. 2011;34(4):273-86. https://doi.org/10.1111/j.1365- 2761.2010.01239.x

[3] Hodneland K, Endresen C. Sensitive and specific detection of salmonid alphavirus using real-time PGR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 2006; 131 (2): 184-92. https://doi.org/10.1016/i.iviromet.2005.08.003

[4] Jansen MD, Guarracino M, Carson M, Modahl I, Taksdal T, Sindre H, et al. Field evaluation of diagnostic test sensitivity and specificity for Salmonid alphavirus (SAV) infection and pancreas disease (PD) in farmed Atlantic salmon (Salmo salar L.) in Nonway using Bayesian latent class analysis. Frontiers in Veterinary Science. 2019;6:Article 419. https://doi.org/10.3389/fvets.2019.00419

[5] Jansen MD, Taksdal T, Wasmuth MA, Gjerset B, Brun E, Olsen AB, et al. Salmonid alphavirus (SAV) and pancreas disease (PD) in Atlantic salnion (Salmo salar L.) in freshwater and seawater sites in Norway from 2006 to 2008. Journal of Fish Diseases. 2010;33(5):391-402. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2009.01130.x

...

...

...

[7]OIE/WOAH, Manual of diagnostic test for aquatic animails. 2021, Chapter 2.3.8. Manual of diagnostic test, for Infection with salmonid alphavirus